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幽门螺杆菌omp11基因的克隆及序列分析
目的对幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)郑州分离株MEL-Hp27和NCTC11637株外膜蛋白基因(omp11)进行克隆和测序;确定不同Hp菌株omp11基因序列的变异性,并对该基因编码多肽的化学及免疫学特性进行预测,为幽门螺杆菌疫苗抗原的筛选提供数据.方法提取Hp染色体DNA,用自行设计的PCR引物,从染色体DNA上扩增出omp11基因,将其克隆到载体pNEB193中,用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli JM109).对重组质粒进行酶切鉴定,对插入的omp11基因片段进行测序,应用生物信息学软件Omiga2.0、GeneDoc2.3和GenBank、Swiss-port数据库对4个Hp菌株(MEL-Hp27、NCTC11637、26695、J99)的omp11基因序列进行同源性分析,并对该基因编码多肽的主要化学特征和抗原结构域进行预测.结果MEL-Hp27和NCTC11637株omp11基因的核苷酸序列长度均为561bp,不同菌株间核苷酸序列的同源性为96.6%～98.0%,与国内的MEL-Hp27株同源性高的菌株是NCTC11637,二者的同源性为97.9%.4株Hp omp11基因编码的氨基酸序列长度均为186aa,不同菌株间氨基酸序列的同源性为98.9%～100%,与MEL-Hp27株同源性高的菌株是26695,二者的同源性为99.5%.预测HpMEL-Hp27omp11基因编码多肽的相对分子质量(Mr)为21.939×103,等电点为9.373,有4个具有抗原活性的结构域.结论Hpomp11基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列均具有很高的保守性;国内菌株MEL-Hp27的omp11基因编码的氨基酸序列与国外26695株的同源性高;Hpomp11基因编码的多肽具有典型抗原分子的结构特征,有希望成为新的Hp疫苗候选抗原.
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引发重症监护室内血流感染的粘质沙雷菌同源性分析
目的：分析从绍兴市中心医院重症监护室（ ICU）内血流感染患者中分离的粘质沙雷菌株的同源性和耐药情况，为临床合理用药及感染控制提供依据。方法收集ICU病房2013年6月至2013年9月血流感染中分离培养出来的粘质沙雷菌株，并从ICU医务人员手上采集细菌，进行分离培养。对培养出的17株粘质沙雷菌进行药敏检测，用PCR技术扩增常见耐药基因，使用脉冲场凝胶电泳（ PFGE）技术进行同源性分析。收集患者的临床资料，用Spearman相关法进行统计学分析。结果17株粘质沙雷菌对第一代、二代头孢霉素、庆大霉素、环丙沙星耐药率100％，对阿米卡星及头孢他啶敏感，对碳青酶烯类的耐药率为11．76％～35．29％，PCR扩增结果显示1（5．88％）株粘质沙雷菌携带TEM基因，17株粘质沙雷菌PFGE分型一致。结论粘质沙雷菌是重要的致病菌，存在着院内传播现象，具有多重耐药性。临床应根据药敏试验合理选用抗菌药物，加强感染控制，防止耐药菌株在院内交叉传播和暴发流行。
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碳青霉烯类药物耐药的弗劳地枸橼酸杆菌耐药机制研究
目的 对耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌进行同源性分析及多种耐药基因的检测.方法 用琼脂稀释法测定其低抑菌浓度( MIC)值,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌的同源性,以聚合酶链反应(PCR)检测β-内酰胺酶、膜孔蛋白的缺失等多种耐药基因.结果 PFGE显示1、2、4、5号菌株均有19个条带,具有同源性；PCR试验检测结果1、4号菌携带blaCTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)；2、3、5号菌携带携带blaDHA,3号携带bla ACT/MIR型AmpC 基因,1、2、4、5号菌携带bla KPC-2碳青霉烯酶基因；2号、4号菌株缺失膜孔蛋白基因ompF,3号菌株同时缺失ompC和ompF；其中3号菌株的16S rRNA基因定量确定AmpC基因的表达为阴性菌的106.7倍.结论 宁波市第一医院碳青霉烯类耐药的弗劳地枸橼酸盐杆菌具有同源性,其耐药机制由KPC酶、AmpC酶、ESBLs、膜孔蛋白缺失等共同作用所形成,多数耐药基因定位在质粒上易引起耐药性的播散,临床应引起高度重视.
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产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的分析
对我院2001年10月～2002年5月临床分离的30株非重复的产ESBLs大肠埃希菌进行检测,了解CTX-M基因的检出情况及产CTX-M酶大肠埃希菌的耐药性和同源性.
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多重耐药不动杆菌主要β-内酰胺酶基因型及同源性研究
随着广谱抗生素的广泛应用,多重耐药的不动杆菌的比例不断上升,并在全球多处的重症监护病房发生暴发流行,成为抗感染治疗的棘手问题.近年来我院鲍曼不动杆菌分离率不断增加,耐药率也不断上升,本研究分析了我院2007年7月-2008年5月临床分离的61株多重耐药不动杆菌属菌株的耐药性、同源性及主要β-内酰胺酶基因型.
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牛乳头瘤病毒E6蛋白与p73蛋白作用的研究
高危型乳头瘤病毒E6蛋白能结合并降解p53蛋白，导致细胞发生转化，是其致癌的关键环节。但近大量研究表明p53并非E6致癌的唯一靶位，E6蛋白的致癌机制还远没有阐明，探索E6蛋白与其新的靶分子的相互作用对肿瘤的基因治疗和全面揭示其致癌机制具有重要意义。1997年，Kaghad等发现了一个在结构和功能上都和p53极为相似的新基因，命名为p73。p73基因虽然发现时间不长，却已成为研究的热点。p73无论在结构上还是在功能上均与p53极为相似。p73蛋白具有与p53同样的四个主要功能区，其中DNA结合结构域两者的相同序列高达63%。即使是在两者同源性较低的羧基端，也发现了相似的乳头瘤病毒E6结合α-螺旋基序(motif),即VNQLVGQ序列。并且当p73过表达
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华南地区HGV的流行状况和同源性分析
目的 了解华南地区庚型肝炎病毒(HGV) 的流行状况及HGV不同株和不同基因区的同源性. 方法 采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测来自广东、香港、云南的不同人群血清标本共1 991份.对其中20份的5端非编码区(5UTR) 238bp和3份非结构蛋白5区(NS5) 621bp进行了序列测定和同源性分析. 结果 一般人群HGV RNA阳性率为(0.73～1.34)%,献血员(2.52～2.90)%,静脉吸毒者17.86%,血液透析患者14.13%,接受骨髓移植者41.67%,在非甲～戊型肝炎病人为25.30%,肝细胞癌14.48%,乙型肝炎7.22%,丙型肝炎(8.33～16.13)%.不同株5UTR同源性介乎(90.40～100)%; 不同株NS5区核苷酸同源性(93.30～94.00)%,氨基酸为(97～99.2)%. 结论 接受骨髓移植、血液透析、静脉吸毒者,乙型、丙型、非甲～戊型肝炎病人及肝细胞癌患者是HGV的高感染人群.不同HGV株存在一定的地区性差异;同一地区不同人群的HGV株变异不明显;序列中存在高度保守区及较大变异区.
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本溪地区乙肝患者病毒基因型分析
根据乙型肝炎病毒S基因序列的同源性可将该病毒分为A、B、C、D、E、F、G 7种基因型,各种基因型的分布与感染状况又表现不同的特点.我们对我国东北部重工业基地--本溪地区乙型肝炎患者病毒基因型进行了检测.
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贵州省一例犬伤致人患狂犬病的病原学及病毒基因分析
目的 从病原学角度证实贵州省凯里市一起犬伤人致儿童死亡病例为狂犬病所致,了解狂犬病病毒的基因特征.方法 采用dFA实验初步检测犬和患儿脑组织狂犬病病毒抗原,以RT-nested PCR检测狂犬病病毒核酸,测定狂犬病病毒N基因全长序列,根据同源性比较及系统进化树进行分子流行病学分析.结果 dFA与RT-nested PCR检测显示犬脑和人脑组织标本均为狂犬病病毒抗原和核酸阳性.经测序拼接均得到长度为1353 bp的核苷酸序列,同源性分析显示犬脑组织(GZD)和人脑组织(GZH)检出的狂犬病病毒N基因核苷酸与推导的氨基酸同源性均为100％,与我国各省已报道的狂犬病病毒基因1型流行毒株及疫苗株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4％～99.6％和98.2％～100％,与我省往年报道的毒株N基因核苷酸和推到的氨基酸同源性高.此外,在与疫苗株的比较中,与CNT株的核苷酸和氨基酸同源性高.进化树分析显示犬脑和人脑组织标本狂犬病病毒N基因亲缘进化关很近,同属于基因1型狂犬病病毒.结论 从病原学和病毒分子生物学证实了贵州省一起犬伤人致儿童死亡病例为狂犬病所致,其病原为狂犬病病毒基因1型,与疫苗毒株中的CNT毒株的亲缘进化关系近,该起病例可能为我省境内传播,因此,应加强我省狂犬病疫区的防制工作.
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陕西株GBV-C/HGV RNA NS3区cDNA的序列分析
应用反转录及套式PCR 技术, 从陕西省西安市两位非甲～戊型急性肝炎患者的血清中提取RNA,经特异性的反转录引物P4反转录成cDNA ,以此为模板分别用P3,P4及P1,P2两对引物进行PCR扩增,扩增到218bp(4248nt～4465nt )的HGV RNA NS3区部分基因,将其克隆人PinPointTMXal-T载体,挑选阳性克隆并进行了序列分析,结果表明SG2与HGV的核苷酸同源性分别为85.64%与84.48%;与GBV-C 的核苷酸同源性为86.21%与84.48%,其二者之间的核苷酸同源性为97.13%,二者与HGV的氨基酸的同源性分别为98.28%和93.10%,与GBV-C的氨基酸同源性为98.28%,93.10%,二者之间的氨基酸同源性则达到了94.83%.
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动物源性和人源性甲型流感病毒(H1N1)血凝素(HA)的特征分析
目的 研究动物源性和人源性甲型H1N1流感病毒(influenza A virus)血凝素(hemagglutinin,HA)的特征,以探讨动物源性和人源性甲型H1N1流感病毒血凝素之间的关系.方法 从美国生物信息中心(NCBI)下载禽(鸟)源、猪源、人源的甲型H1N1流感病毒血凝素氨基酸序列,使用Clustal W2.0生物学软件比较上述血凝素氨基酸序列,并建立甲型H1N1流感病毒血凝素氨基酸序列的进化树.结果 2009年分离的人源性甲型流感病毒血凝素氨基酸序列同源性非常高,达到了99%～100%,而2009年分离的人源性甲型流感病毒血凝素氨基酸序列和禽(鸟)源,猪源的甲型流感病毒血凝素氨基酸序列之间的同源性非常低,只有77%～90%(只有猪源ABW36355和2009年分离的人源甲型流感病毒血凝素氨基酸序列同源性为90%,余同源性为77%～83%);蛋白生物进化树表明禽源(鸟)、猪源、人源的甲型流感病毒血凝素氨基酸序列明显分为3个大的分支.2009年分离的人源性甲型流感病毒血凝素氨基酸序列(ADA71154除外)与疫情前分离得到的人源的血凝素氨基酸序列同源性很低(79%～80%),并且进化树分为3个分支.结论 2009年流行的甲型H1N1流感病毒是一种新的流感病毒,病毒的血凝素氨基酸序列之间的同源性非常高,而和猪、禽(鸟)源的甲型H1N1流感病毒的血凝素氨基酸序列之间的同源性非常低,从这一层面上来讲,目前流行的甲型流感病毒的血凝素的基因并不是猪源和禽源,和疫情前人源的血凝素比对的结果也表明,2009年流行的甲型H1N1流感病毒也并不是直接源于2009年以前的人源流感H1N1病毒,而应该是另有来源.
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广东省登革病毒的分子流行病学研究
目的通过对广东省90年代以来流行的登革病毒分子流行病学研究，初步了解我国毒株的可能来源。方法采用RT-PCR方法扩增广东省不同年份分离的登革病毒(DEN)1型和2型NS1部分基因片段，然后进行克隆测序。测序后的基因片段与国际上已知的多个DEN1和DEN2相应的序列进行比较，并以核苷酸的差异在6%以上作为基因亚型分型的标准。结果①广州1991年分离的DEN1（GD03/91）与潮洲1995年分离的DEN1（GD23/95）同源性很高，为97%，属同一基因亚型，而两者与从潮洲1997年分离的DEN1（GD14/97）同源性均为93%，分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD03/91和GD23/95可能来自东南亚或瑙鲁等地，GD14/97可能来自新加坡。②佛山市1993年分离的DEN2（GD06/93）和南海市1998年分离的DEN2（GD01/98）同源性为93%，分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD01/98与泰国流行株ThNH-P28/93株共享序列非常接近，核苷酸同源性为98%，氨基酸同源性为100%，因此推测GD01/98可能来源于泰国。结论广东省90年代以来流行的登革热来源于不同的传染源。
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淋病奈瑟菌NspA基因疫苗诱导小鼠特异性体液免疫应答
1999年Martin等首先克隆了淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)基因,发现其在细胞表面持续表达,菌株之间NspA氨基酸序列的同源性高达98%,提示NspA可能是研制淋病疫苗的理想抗原.我室已成功构建NspA真核表达载体pcNspA,本文研究了pcNspA基因免疫在小鼠体内诱生特异性抗体的作用.
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hsp60基因序列分析及其在病原菌鉴定中的应用
目的 研究致病菌hsp60基因序列的差异性,为建立致病菌快速鉴定方法及为其他研究提供科学依据.方法 在GenBank中查找所需hsp60基因序列,运用分子生物学软件Primer5.0和Oligo6.0设计合适的通用简并引物,采用合适的扩增条件扩增常见致病菌hsp60基因片段.利用分子生物信息学分析hsp60基因序列的保守性、变异性及菌株间种系进化关系.结果 可扩增出常见致病菌hsp60基因片段,序列比较研究显示hsp60基因序列保守与变异并存,保守区与变异区呈"锯齿状"分布.种系进化关系同16S rRNA、23S rRNA分析结果一致.结论 hsp60基因序列分布特点为建立致病菌的分子生物学快速鉴别诊断方法如基因芯片研制等提供了可靠的科学依据和重要的实验基础.
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血清HIV抗体阴性静脉药瘾者肝组织HIV DNA测定
为评估HIV抗体阴性HIV感染高危人群潜在的HIV传播性，本研究对来自德国的38例HIV抗体阴性的静脉药瘾者肝组织样品进行常规DNA抽提，用HIV不同结构区(gag,pol,env)6对引物同时扩增HIV DNA。结果发现38例肝组织中有30例在HIV gag区(M667/sk03c,M661/sk01c)发生特异性扩增。10例对HIV env区(env526/C02,envC01/571K)发生特异性扩增。进一步分析发现38例中有3例同时在gag、pol、env 3个区域产生特异性扩增，12例分别对HIVgag和pol区或gag、env区产生特异性扩增，17例产生单一gag或pol或env特异性扩增，6例在gag、pol、env区均阴性。对env阳性的部分标本经荧光标记自动测序仪测序并与国际HIV标准株比较，其感染HIV株与欧美B亚型同源性为86%。此研究提示，抗HIV阴性的静脉药瘾者为潜在HIV感染的高危人群，加强对这类人群“窗口期”的监测，对预防HIV的传播有重要意义。
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干扰素调节因子-7对肿瘤细胞生长的影响
干扰素(IFN)调节因子(IFN regulatory factor,IRF)是一组通过与IFN基因中顺式元件结合来调节IFN及其诱导性基因表达的核因子.到目前为止,已发现至少有9种IRF,以IRF-1和IRF-2的研究多.基本明确IRF-1是免疫上调因子,促进IFN-γ表达;IRF-2是免疫负反馈调节因子,抑制IRF-1的过度表达.近年发现,IRF-1直接抑制肿瘤生长,上调MHCⅠ和MHCⅡ的表达.IRF-3也是肿瘤细胞生长的强抑制因子,诱发肿瘤细胞凋亡.IRF-7是1998年发现的另一IRF因子,与IRF-3在氨基酸序列上有多处同源性.报道认为IRF-7类似IRF-1和IRF-3,是多种IFN表达的重要上调因子[1].本文初步探讨IRF-7抑制肿瘤的免疫作用.
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逆转录病毒介导的小鼠IL-21基因在食管癌细胞中的表达
白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)是20世纪末发现的细胞因子,与IL-2、IL-4及IL-15有同源性,但与IL-15相比,IL-21仅表达于活化的外周血CD4+ T细胞上;IL-21受体也仅表达在淋巴组织,特别是活化的T细胞、B细胞和NK细胞.
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中国基因3型乙型脑炎病毒E基因分子特征
目的 以减毒活疫苗(SA14-14-2株)为对照,分析我国分离的基因3型乙脑病毒E基因区段核苷酸及氨基酸序列分子特征.方法 从GenBank中获取相应乙脑病毒株E基因区段核苷酸序列,通过Clustal X(1.81)、DNAStar、GENEDOC(3.2)等生物学软件进行核苷酸和氨基酸位点差异分析.以蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白氨基酸位点分析.结果 我国不同地域、不同宿主分离的基因3型乙脑病毒与SA14-14-2株核苷酸同源性分别在96%和95%以上,氨基酸同源性在95%和94%以上.在同一地域、同一宿主类型分离的毒株之间核苷酸和氨基酸同源性非常高.在E基因区段存在10处共同的氨基酸位点差异,在结构域Ⅰ(E160)、结构域Ⅱ(E123和E227)和两个未在结构域中的氨基酸位点(E441和E487)等5个位点在部分基因3型乙脑病毒中存在差异.结论 我国分离的基因3型乙脑病毒与减毒活疫苗株(SA14-14-2株)E基因区段同源性高,存在5处基因3型乙脑病毒特异的氨基酸位点差异,但现行减毒活疫苗株理论上可以保护我国分离的基因3型乙脑病毒野毒株.
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呼吸机管道定植菌与呼吸机相关性肺炎病原菌的同源性研究
目的 针对ICU中接受机械通气的患者,从基因水平对该类患者呼吸机管道内定植菌与下呼吸道致病菌的同源性进行研究.方法 收集机械通气患者上机后<1 d,第3天,第5天,第7天口咽部分泌物、下呼吸道吸出物和呼吸机管道内的冷凝水进行细菌培养,再用RAPD-PCR技术进行同源性研究.结果 RAPD-PCR显示有35.71%患者呼吸机管道内的定植菌与VAP致病菌有同源性表现,有21.42%的患者在具备同源性的基础上,呼吸机管道内细菌定植时间先于下呼吸道.结论 呼吸机管道内定植菌的移行是导致VAP发生的重要原因之一;呼吸机管道更换的佳时间是上机后3～4 d.
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神经营养素家族与周围神经再生的研究进展
周围神经损伤再生一直是临床医学亟待解决的难题之一.研究表明,神经再生修复是一个复杂的生物学问题,要进一步提高周围神经再生修复的效果,必须深入研究调节神经生长和生长方向的微环境因素.在周围神经再生微环境中,神经营养素家族(neurotrophins)发挥着维持神经细胞存活和再生功能的重要作用,其在临床上的应用也逐渐成为研究热点.神经营养素家族又称为神经生长因子家族,是一类结构和功能上密切相关、在核酸和氨基酸序列上存在高度同源性的蛋白质,属于神经营养因子中的重要家族,主要包括神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophin factor,BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)、神经营养素-4/5(neurotrophin-4/5,NT-4/5)、神经营养素-6(neurotrophin-6,NT-6)、神经营养素-7(neurotrophin-7,NT-7)等.我们现就这一家族在周围神经损伤修复中的应用研究现状及进展情况作一综述.
