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不同叶型半夏蛋白质差异性初步分析
采用紫外分光光度法、非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析半夏总蛋白.结果显示:芍药叶叶型半夏和掌叶叶型半夏的总蛋白含量远高于竹叶叶型和桃叶叶型半夏.聚类分析结果显示:生长于南川县的四种叶型半夏样品,除芍药叶叶型半夏外,竹叶叶型、掌叶叶型和桃叶叶型显示相对较高的遗传相似性;采自不同地区的芍药叶叶型半夏遗传相似性较高,表明芍药叶叶型半夏受环境影响相对较小.因此,在半夏生产中,可以根据不同的需要,规范半夏种子纯度.
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纤维蛋白酶谱检测蚯蚓纤溶酶组分
目的建立鉴定蚯蚓纤溶酶粗酶液中活性组分的方法.方法根据蚯蚓纤溶酶能水解纤维蛋白的性质,建立了纤维蛋白-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Fibrin-SDS-PAGE),优化了电泳条件,电泳后酶所在部位为透明区带.结果分离胶中纤维蛋白终质量浓度为0.4×10-3 mg·L-1,电泳后胶板用2.5%TritonX-100复性30min,PBS缓冲液(pH 7.2)保温30min,考马斯亮蓝R-250染色,7%醋酸脱色,可以得到清晰的酶谱.结论该方法灵敏度高,用2μg样品,就能准确检测出粗酶液中所有纤溶酶组分.
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mRNA差异显示技术的应用与改进
目的:克隆和研究高低分化胆管癌间差异表达基因.方法:对mRNA差异显示PCR(DDRT-PCR)的一系列条件进行了探索和改进,建立了有效的DDRT-PCR法.结果:在高、低分化胆管癌差异分化基因的研究方面获得了满意的结果,共获得 9 个有显著差异的cDNA片段,测序后进行同源序列比较,有一个与层粘连蛋白受体基因高度同源,还有一个可能是一个新基因的部分序列.结论:通过对传统方法的改进,大大提高了工作效率,降低了实验成本和工作量并对相关问题进行了探讨,为进一步的研究奠定了基础.
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一种简化的检测SMN1基因纯合性缺失的方法
目的 建立一种更加准确、快捷的方法,简便地诊断纯合缺失型脊髓性肌萎缩症.方法 应用双侧等位基因特异聚合酶链反应(AS-PCR)进行SMN1基因的特异扩增,并用另1个无关基因作内对照,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析,确定患儿是否为纯合缺失型脊髓性肌萎缩症. 结果双重AS-PCR产物,通过PAGE或琼脂糖凝胶电泳,可准确判读患儿是否存在SMN1基因外显子7纯合性缺失.结论 相对于以往常规使用的PCR-酶切或变性高效液相层析(DHPLC)方法,本研究所建立的方法不需要复杂的后续分析手段,能够更准确、快捷、简便地诊断纯合缺失型脊髓性肌萎缩症患儿.
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微粒体甘油三酯转运蛋白MTP研究进展
MTP存在于细胞微粒体、内质网腔内,在内质网内含量高,占总蛋白的0.5%~1.0%.用层析技术获得纯的MTP在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为两种异构体,其分子质量是58000和88000;另外用沉降平衡技术测得的分子质量是150 000,说明MTP有两种异源二聚体.氨基酸测序和免疫技术分析证明低的是一个亚单位,称为蛋白二硫化合物异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)它的二硫化合物异构酶活性能使新合成蛋白质的一对半胱胺酸残基形成二硫键.另外它也是四聚体酶的成分,四聚体羟化酶有α和β两个亚基,β则为PDI.在体外PDI可以单独存在,其含量超过MTP,也可以自我形成二聚体和四聚体.MTP的大亚基不被去污剂所溶解,其可能与PDI协同翻译有关或者是PDI的分子伴侣(chaperone).PDI对于MTP是很重要的,这表现在当单独将MTP表达在昆虫Sf9,MTP无活性,而与PDI一起表达时MTP才有活性,说明它是MTP的组成和功能基础.PDI由491个氨基酸组成,当它成为MTP成分时活性仅为游离时的1/10,当其解离后活性增加,其活性中心在35~40和379~384两段氨基酸残基序列处.人的MTP大亚基具有高度的保守性、但同源性较低;其少数几个区域与卵黄磷脂蛋白序列具有同源性,可推测它是卵黄原蛋白的家族[1].
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短串联重复子DNA多态性及其法医学应用研究
调查云南汉族人群18个常染色体和性别染色体STR基因座遗传多态性,获得18个基因座的群体遗传学数据,并探讨该18个STR基因座的法医学应用价值.709份EDTA抗凝血(男456、女253份)来自昆明地区无血缘关系汉族个体,法医案件及亲子鉴定标本取自本教研室的检案,各种动物血痕取自动物中心.应用酚-氯仿法或Chelex-100法提取DNA,STR-PCR、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带分析技术和377测序技术对上样本进行分析.709例样本中18个基因座观察到的等位基因数分别为4~15;累积个人识别率(TDP)为0.9999999999925334;累积非父排除率(CCE)为0.999962106.18个STR基因座在群体遗传学研究和法医学个人识别、亲子鉴定中均有较高的应用价值.
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虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测研究
目的 分析虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测效果,建立一种用于虫草属的DNA分子指纹高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测方法.方法 分别对虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶终浓度、胶电泳步骤、胶固定方案、胶染色方法、胶显色步骤进行分析,确定利于虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶DNA多态性展现的方案.结果 确定虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测方案,分别为聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%、银染染色液为0.3%的AgNO3、胶显色步骤中显影液为强碱NaOH和0.5%的甲醛溶液,且NaOH的浓度为2%.结论 本研究所建立的银染检测及显带体系适用于虫草属基因组聚丙烯酰胺凝胶电泳研究.
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桃仁蛋白梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳的研究
电泳作为一种分离蛋白质的手段已是含蛋白中药材鉴定的常用方法.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是利用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合形成的立体网状物作为载体对不同的带电物质进行分离的电泳方法.
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急性髓系白血病细胞端粒酶活性与疗效关系的初步研究
我们采用端粒重复序列扩增法-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)-银染法检测了正常组织和急性髓系白血病(AML)患者治疗前后骨髓细胞的端粒酶活性变化,以探讨其临床意义。对象和方法1 对象选择初发未治AML患者32例,按国内诊断标准[1]确诊,其中男22例,女10 例,年龄16~67岁, 中位年龄32.9岁。M01例,M14例,M212例(M2a10例,M 2b2例),M3a4例,M43例,M58例(M5a1例,M5b7例)。M3 患者用全反式维甲酸 40~60?mg/d治疗至完全缓解(CR),获CR后用HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)方案治疗;其余患者用DA(柔红霉素+阿糖胞苷)或HA方案诱导,缓解后用AA(阿克拉霉素+阿糖胞苷)+足叶乙甙方案。经1~2个疗程后该组患者获骨髓缓解 20例。非血液病患者(包括肝炎、系统性红斑狼疮)及正常志愿者9名作为对照。2 试剂端粒酶PCR-ELISA试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司,阳性对照为人胚肾 293细胞株(试剂盒提供),阴性对照为端粒酶提取物加1?μg/μl RNase A,37?℃孵育 20 min。3 端粒酶活性检测3.1 标本留取:初发未治患者在初诊时、骨髓缓解患者在化疗后第14天各取骨髓2~3?ml,肝素抗凝,Ficoll分离单个核细胞,初治组白血病细胞含量大于0.70,锥虫蓝染色拒染率大于95 %,PBS洗涤2次,保存于-70?℃待用。正常组织(膀胱、胃、肺组织)30份,均由本院外科提供,标本均取于离体后1?h内,液氮速冻后保存于-70?℃待用。3.2 端粒酶提取物提取:每份实体组织取标本量100?mg,用液氮速冻后在研钵中研成粉末,转至洁净管中,加入200?μl裂解液;每份单个核细胞直接加入200?μl裂解液。充分混匀, ?4℃裂解30?min,16?000×g离心10?min,小心地将上清(约150?μl )移至另一洁净管中,-70?℃保存备用或即用。紫外吸收法测定蛋白质含量。3.3 TRAP-PCR-ELISA:取上述提取液5~20?μl (蛋白质含量10?μg)加入25?μl TRAP-PC R扩增液,用无菌DEPC水补充至50?μl,加40?μl石蜡油覆盖,在PCR仪上扩增:25?℃延伸30?min;94?℃灭活5?min;扩增反应:94?℃ 30?s,50?℃ 30?s,72?℃ 90?s ,循环30次;72?℃延伸10?min。取上述PCR产物5?μl加变性液20?μl混匀,置室温10 ?min,加入225?μl杂交液(含地高辛标记的探针),混匀后取出100?μl包被于抗生物素的酶标板中,20?℃作用2?h,加入过氧化物酶并与TMB底物显色30?min,在时间分辨荧光仪(WALLAC公司)测定波长为450?nm和690?nm A值,差值△A(A450-A6 90)代表细胞端粒酶活性。3.4 PAGE-银染:取PCR产物45?μl,加氯仿∶异戊醇(24∶1)60?μl混匀,5?000?r/min离心5?min后将上清液小心移至另一0.5?ml洁净管中,加3?mol/L醋酸钠5?μl和无水乙醇3 00?μl,混匀置-20?℃冰箱过夜,再离心,吸掉无水乙醇,在室温下风干,加5~10?μl 去离子水溶解,加上样缓冲液,经120?g/L非变性PAGE,凝胶用体积分数为10%的乙醇固定5 ?min,体积分数为1%的硝酸浸胶5?min,在染色液中染色10?min,用显色液洗2次,醋酸终止反应,制膜干燥保存。用凝胶成像分析仪摄影。4 统计学处理采用SPSS 9.0统计软件包进行t检验。
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唐山地区儿童腹泻病中轮状病毒感染的流行病学特征研究
1对象与方法1.1研究对象本组研究对象为唐山市中心区四所综合医院2003年1月1日-2005年12月31日因患腹泻住院的社区感染儿童以及住院期间患腹泻病的院内感染儿童,共计1 122例.分别从每例患儿采集粪便标本1份,置标本于-20℃冰箱保存.
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蛋白质谱型分析在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌鉴定中的应用研究
目的:从生化途径探索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)鉴定的新方法及其对甲氧西林的耐药机理.方法:采用细菌透析袋表面培养法,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-QAGE),分析菌株蛋白质代谢产物谱形.结果:MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)的蛋白质代谢产物SDS-PAGE谱形分析存在明显可资鉴别的差异.结论:该方法为MRSA鉴定新方法的建立提供了可行性依据,为进一步研究MRSA的耐药机理提供一个可参考的研究线索.
关键词: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 聚丙烯酰胺凝胶电泳 -
考马斯亮蓝染色在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用
在研究医学媒介节肢动物与宿主相互关系过程中,经常用到聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,以分析功能成分的变化及作用关系,通过分析蛋白凝胶电泳后的色带图谱,可识别不同的蛋白,或用凝胶电泳法分析DNA,其中的关键显色技术是考马斯亮蓝染色法.本文结合实际研究的经验,介绍一种快速显色的技术,供相关人员参考使用.本实验流程仅需三小时,且具有快速、安全、染色及观察(色带)简便等优点.
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羟乙基淀粉对大鼠蛋白尿的治疗作用
目的:探寻羟乙基淀粉治疗大鼠蛋白尿的可行性.方法:建立蛋白尿大鼠动物模型,在静脉点滴6%羟乙基淀粉前后,通过大鼠输尿管插管收集肾后膀胱前尿液,测定尿蛋白分子量并比较治疗前后尿蛋白含量,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对尿蛋白分子量进行分析,同时观察治疗前后血肌酐和尿素氮变化.结果:羟乙基淀粉治疗后尿蛋白定量较治疗前明显下降,尿蛋白电泳表明高、中分子蛋白条带数目和含量较治疗前显著减少.治疗前后尿量、血肌酐和尿素氮无明显变化.结论:羟乙基淀粉能够安全、有效地减少实验大鼠的蛋白尿,为探寻蛋白尿的新的治疗方法提供了理论依据.
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蛋白质组学与卵巢癌研究
随着后基因组时代的到来,蛋白质组学已成为一个发展迅速、日益重要的研究领域,高分辨率的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-D PAGE)与质谱分析技术(mass spectrometry,MS)和生物信息学的结合使蛋白质组分析及其在临床疾病中的应用成为可能.
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尿蛋白电泳对肾损伤诊断的价值
尿蛋白电泳是蛋白尿患者诊断及鉴别诊断较好的实验室指标,具有临床诊断价值[1].我们应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术进行非浓缩尿蛋白电泳,用于肾脏损伤的早期诊断.1 资料与方法1.1 研究对象:病例组选择2012年8月至12月在本院住院的患者132例,男性90例,女性42例,年龄9~86岁,平均54岁.其中糖尿病肾脏病26例,高血压肾病24例,肾病综合征28例,慢性肾炎22例,急性肾炎24例,狼疮肾炎3例,肾盂肾炎5例.糖尿病诊断符合1999年世界卫生组织糖尿病诊断和分类标准,高血压诊断符合1998年世界卫生组织/国际高血压联盟制定的高血压诊断标准,所有的肾病患者均经肾穿刺病理检查确诊.对照组30名均来自本院健康体检人群,男性18名,女性12名,平均年龄55岁.经检查无糖尿病、高血压、尿蛋白定性检查阴性.
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两种蛋白电泳染色方法的比较
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可用于检测蛋白质的相对分子质量,但常规的考马斯亮蓝R-250染色法耗时长,成本高,废弃的甲醇和冰醋酸还可造成对实验室和周围环境的污染.我们在实验过程中逐渐摸索出一种非常省时、成本很低并且对环境无污染的染色方法.
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两种蛋白电泳染色方法的比较
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可用于检测蛋白质的相对分子质量,但常规的考马斯亮蓝R-250染色法耗时长,成本高,废弃的甲醇和冰醋酸还可造成对实验室和周围环境的污染.我们在实验过程中逐渐摸索出一种非常省时、成本很低并且对环境无污染的染色方法.
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从琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA方法的总结
在分子生物学实验的操作中,许多情况下要利用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳观察、纯化和回收DNA片段。DNA片段回收是其中的重要步骤,根据实验的目的不同,回收的DNA可用于载体连接、基因重组、序列分析、探针制备等后续工作。 DNA回收技术操作简单而迅速,并且能分离用其他方法(如密度梯度离心等)不能满意分离的DNA片段。在实际工作中,根据实验需求,准确、简便、快速、经济的DNA片段回收方法更受操作者的青睐。现总结从凝胶中回收DNA常用的方法,不需要特殊的仪器和试剂。
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人血清中小分子蛋白质分离电泳方法改进
目的 建立一种灵敏易行分离分子量<10 000 Da低丰度蛋白质的电泳方法.方法 用Hitrap Blue层析柱去除血清中自蛋白,用U9对血清样品进行变性处理,采用改进后的方法(0.1%甲醇,0.5%三氯乙酸,0.1%考马斯亮蓝G250)进行染色.结果 经去除血清中的白蛋白、对样品进行变性处理及改进染色方法后,分辨率和灵敏度明显提高,可有效分离10 000 Da以下的小分子蛋白质.结论 改进后的电泳方法,不仅简便灵敏,而且还有利于蛋白质的洗脱回收.
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一种检测弓形虫抗体的快速ELIB技术
酶联免疫印迹技术(ELIB)作为一项新的免疫学技术,因其高分辨率、高灵敏度及高特异性等优点,广泛应用于寄生虫抗原的分析、纯化和鉴定等.但由于ELIB技术是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白转印以及固相免疫标记等3项技术结合而成,操作时间较长,因而未能成为常规的免疫诊断方法.我们在检测弓形虫抗体时,引进PhastSystem全自动水平电泳系统,该系统电泳凝胶厚度薄(<0.5mm),易冷却,且电场强度高,具有快速和高分辨率等特点,再加上半干式电转移配置,使得SDS-PAGE及电转印的时间均大为减少,仅需30min,全过程也不到5h;只需微量样品,可检出弓形虫IgG和IgM两种抗体.在诊断弓形病中具有应用价值.现介绍如下.