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建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法
目的 建立敏感、特异的普通聚合酶链反应(PCR)方法和TaqMan荧光定量PCR方法对产气肠杆菌进行快速检测.方法 以产气肠杆菌组氨酸脱氢酶基因(hdc)为靶基因设计引物以及TaqMan FAM探针,建立对产气肠杆菌进行检测的普通PCR方法和TaqMan荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性.结果 普通PCR和TaqMan荧光定量PCR方法均能对产气肠杆菌进行特异检测;普通PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为100 copies/μl和1.0×105 cfu/g,TaqMan荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为33copies/μl和1.0×104 cfu/g;TaqMan荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;在稳定性评价试验中,普通PCR方法的重复性良好,TaqMan荧光定量PCR方法对质粒标准品检测Ct值的组内差异为0.15％～0.98％,组间差异为0.55％～1.63％.结论 本研究建立的检测产气肠杆菌的普通PCR方法和TaqMan荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于产气肠杆菌的快速检测.
关键词： 产气肠杆菌 普通PCR TaqMan荧光定量PCR -
鼠巴贝斯虫TaqMan探针荧光定量PCR方法的建立及应用
目的 建立一种用于检测鼠巴贝斯虫的TaqMan探针荧光定量PCR方法.方法 针对鼠巴贝斯虫18sRNA基因序列,设计特异性引物和探针,建立鼠巴贝斯虫的TaqMan探针荧光定量PCR反应体系,并对该方法的灵敏度和特异性进行验证.结果 本方法对鼠巴贝斯虫的检测灵敏度较高,低检出限为1.34× 10-7ng/μl;具有较高的特异性,与钩端螺旋体、莱姆病螺旋体、巴尔通体、Q热、土拉菌等病原均无交叉反应,反应体系稳定.结论 本研究建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法特异、灵敏,可用于鼠巴贝斯虫的实验室快速检测及现场监测使用.
关键词： TaqMan荧光定量PCR 鼠巴贝斯虫 应用 -
人细小病毒B19三种基因型通用核酸检测体系的建立与评价
目的：建立能同时检测人细小病毒B19（简称B19病毒）3种基因型的通用核酸检测（ NAT）体系，并进行方法学评价。方法对B19病毒3种基因型代表毒株全序列进行比对，选取其保守区域（ NS1区）设计B19病毒的通用引物和探针。为避免假阴性结果，在体系中引入竞争性噬菌体内标。将适宜浓度的内标添加到一系列梯度稀释的参考品质粒中，建立B19病毒实时荧光定量PCR（ qPCR）标准曲线。对建立的B19病毒通用NAT体系分别进行敏感性、特异性、重复性等方法学评价。结果建立的B19病毒实时qPCR检测体系的标准曲线在1×109～1× 103拷贝（copies）／μl模板浓度范围内相关性良好。方法学评价显示，体系的低检测下限为10拷贝／μl；与其他血源传播病毒等无交叉反应；批内和批间实验重复性良好。结论建立了B19病毒3种基因型全检的通用NAT体系，不仅可用于B19病毒感染的诊断，还可用于血液和血液制品中B19病毒的NAT筛查，对于保障输血和血液制品的病毒安全性具有重要意义。
关键词： 人细小病毒B19 TaqMan荧光定量PCR 核酸检测 -
原料血浆和凝血因子类产品中人细小病毒B19污染情况调查
目的：检测混合原料血浆和凝血因子类产品中人细小病毒B19（human parvovirus B19，B19病毒）核酸，分析我国原料血浆及凝血因子类产品中B19病毒的污染情况。方法针对B19病毒的保守区域NS1区合成引物及探针，采用TaqMan实时定量PCR法检测混合原料血浆和4类凝血因子类产品中B19病毒核酸。结果混合原料血浆的B19病毒核酸的阳性率为59．49％（116／195），高浓度可达1．35×1010拷贝／ml。因子Ⅷ、凝血酶、纤维蛋白原以及凝血酶原复合物的阳性率分别为93．55％（29／31）、100％（10／10）、85．71％（6／7）和88．89％（8／9）。结论我国混合原料血浆与凝血因子类产品中B19病毒的污染率较高，有必要进行原料血浆的B19病毒筛查，对于保障血液制品的病毒安全性具有重要意义。
关键词： 人细小病毒B19 血浆 凝血因子类产品 TaqMan荧光定量PCR -
氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中TIF3 p36的变化
目的 探讨氯化镉诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同阶段蛋白翻译起始因子(TIF3)p36 mRNA表达水平的变化,为进一步阐明氯化镉的分子致癌机制提供线索.方法 应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以及敏感先进的Taqman荧光定量PCR方法,检测并分析氯化镉诱发16HBE恶性转化不同阶段即转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞的TIF3 p36 mRNA表达量的变化.结果 相对于非转化对照细胞(16HBE),氯化镉诱发恶性转化不同阶段细胞(转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞)的TIF3 p36 mRNA基因表达水平均明显升高(P＜0.01或P＜0.05),其中低剂量组(5 μmol/L)所转化的各阶段细胞的eIF3 p36 mRNA平均表达量分别是对照细胞的3.1、5.9和9.9倍,中剂量组(10 μmol/L)的各阶段转化细胞的TIF3平均表达量分别是对照细胞的7.1、6.8和14.8倍,高剂量组(15 μmol/L)的各阶段转化细胞的TIF3 p36平均表达量分别是对照细胞的3.6、3.0和9.1倍.这些不同剂量组的研究结果提示,eIF3 p36的异常表达量与氯化镉诱发16HBE细胞恶变程度之间有正相关关系,但与镉的剂量无关.结论 氯化镉在诱发16HBE细胞恶变过程中,存在明显的蛋白翻译启动因子eIF3 p36异常表达现象,其表达水平与细胞的恶变程度密切相关,这可能是氯化镉诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一.
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屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的研究
目的 建立屎肠球菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法.方法 根据屎肠球菌的ddl基因设计TaqMan荧光定量PCR特异的引物及探针,在多种常见致病菌及条件致病菌中检测其特异性;将目的 基因克隆到pMD18-T载体中建立标准曲线,检测方法的灵敏度和稳定性;使用腹水模拟标本验证方法的应用性.结果 在特异性评价中,除了阳性对照外其余菌株均未见特异性扩增曲线.建立屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线,确定本方法对质粒标准品的检测下限为20copy/管.通过对1.0×107、1.0×105和1.0×1033个浓度质粒标准品的重复检测,确定屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR方法的组内变异系数为1.90%~3.91%;组间变异系数为1.52%~1.69%.应用屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR方法对含菌量为1.6×100~1.6×108cfu/mL浓度梯度的腹水模拟标本进行检测,其检测灵敏度为1.6×102cfu/mL.结论 本研究建立了屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法.
关键词： 屎肠球菌 TaqMan荧光定量PCR 标准曲线 -
基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立
目的 建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的TaqMan探针荧光定量PCR方法.方法 根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法.用该方法对30份临床疑似病料进行检测,并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较.结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的佳探针浓度为0.4 μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝／μL.检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100％,与普通PCR的检测结果(25/30)比较,本方法对临床样品的检出率(28/30)更高.结论 建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测.
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医院临床标本中阴沟肠杆菌遗传多样性分析及应用TaqMan荧光定量PCR方法快速检测阴沟肠杆菌的研究
目的 调查医院临床标本中阴沟肠杆菌基因群的构成比例,并建立TaqMan荧光定量PCR方法对阴沟肠杆菌进行特异、灵敏、快速检测.方法 通过hsp60基因分型分析临床标本中基因群的构成,并以外膜蛋白基因(ompⅩ)为靶基因设计引物及FAM探针,建立TaqMan荧光定量PCR方法对阴沟肠杆菌基因群检测,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性.结果 237株临床标本共归为10个基因群.其中群Ⅲ,Ⅵ和Ⅷ菌株数量多,占总菌株数的71％;群Ⅰ占11％;其他6个群总共占18％.无基因群Ⅶ,Ⅹ和Ⅻ.TaqMan荧光定量PCR方法能对阴沟肠杆菌不同基因群进行特异检测:对十个基因群和群Ⅰ的质粒标准品的检测下限分别为36拷贝/μL和21拷贝/μL,对粪便模拟标本的检测下限为104个菌落形成单位/μL;TaqMan荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;结论 医院临床标本中可以检测到十个基因群,具有遗传多样性的特征.本研究建立的TaqMan荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于阴沟肠杆菌的快速检测.
关键词： 热休克蛋白60 TaqMan荧光定量PCR 外膜蛋白基因Ⅹ -
人G1型轮状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立与应用
目的 本研究旨在建立一种快速准确定量检测人G1型轮状病毒的TaqMan探针荧光实时PCR检测方法.方法 以轮状病毒VP6基因为靶基因,分别设计2对引物及其相应的TaqMan探针,扩增目的片段,将目的片段克隆于PCD-NA3.1+载体上,体外转录获得RNA,系列稀释后为标准品,建立TaqMan探针荧光定量实时PCR检测方法并对该方法进行验证.结果 设计实验找到优条件下的引物浓度(250 nmol/L)、探针浓度(300 nmol/L);通过对引起腹泻的人柯萨奇病毒、呼肠孤病毒等进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有很好的特异性.该方法的低检测量为5 copies/μL.对该方法进行重复性实验,发现变异率均小于1％,重复性好.用已建立的方法对4份粪便临床样品进行3次重复试验,病毒RNA的检出率为100％.结论 本实验初步建立了人G1型轮状病毒TaqMan探针荧光实时PCR检测方法,为G1型轮状病毒的诊断、检测和分子流行病学研究提供了一种新的方法.
关键词： 人轮状病毒 VP6基因 TaqMan荧光定量PCR -
荧光定量PCR检测细菌NDM-1基因方法的探讨
目的:将Taqman荧光定量PCR技术与SYBRGreen染料RT-PCR技术比较后,应用于检测细菌NDM-1基因.方法:使用Taqman荧光定量PCR方法与SYBRGreen染料RT-PCR对已知特性的标准株中NDM-1基因检测,对比其扩增灵敏度.结果:Taqman荧光定量PCR技术灵敏度高于SYBRGreen染料RT-PCR法,所测标准株中NDM-1基因转录水平可高达7.5×104拷贝/μl,比SYBRGreen染料RT-PCR技术检测灵敏度高7.8倍.结论:Taqman荧光PCR技术对超级耐药菌NDM-1基因具有较高的敏感性和准确性,可以作为对超级细菌进行监控与防控的方法.
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定量PCR-微流芯片法定量检测血清HBV DNA含量
目的应用定量PCR-微流芯片法定量检测临床血清标本HBV DNA含量,以了解该方法的灵敏度.方法将定量PCR-微流芯片法应用于10倍梯度稀释的HBV DNA参比品的定量检测,并与Taqman荧光定量法作比较;同时,应用这两种方法平行检测49份HBsAg阳性乙型肝炎患者的血清标本.结果 Taqman荧光定量法可检测出 104 拷贝/mL的HBV DNA参比品,测得临床血清标本HBV DNA阳性率为63.27% (31/49),阳性血清的HBV DNA含量均值为9.60×106±19.54 拷贝/mL;而PCR芯片法可测出103 拷贝/mL HBV DNA参比品,测得临床血清标本HBV DNA的阳性率为77.55% (38/49),阳性血清的HBV DNA含量均值为6.95×106±15.43 拷贝/mL.两者差异无显著性(P＞0.05).结论两种方法均能有效检测临床血清标本HBV DNA含量,而定量PCR-微流芯片法的敏感性更高,尤其适合于低病毒载量检测及患者抗病毒药物选择和疗效的监测.
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利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群
目的 建立一种新的检测结核分枝杆菌复合群的荧光定量试验方法 (R/P分析),探讨R/P分析检测临床标本中结核分枝杆菌复合群的应用价值.方法 根据结核分枝杆菌复合群基因保守序列设计引物和探针构建质粒标准品.运用R/P分析检测54例确诊结核病人临床样本,检测的结果 同时与培养法、荧光定量PCR法进行比较.结果 不同临床标本用R/P分析诊断结核病,其敏感性高于荧光定量PCR法和培养法,阳性检出率分别为96.3%、83.3%和55.6%.结论 R/P方法 是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分结核分枝杆菌复合群的死菌与活菌,因此可以更好的指导医生进行治疗,更准确地做出公共卫生决策.
关键词： 结核分枝杆菌复合群 TaqMan荧光定量PCR 快速检测
