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缺氧诱导因子家族蛋白的稳定性与转录活性的调节
缺氧诱导因子是调控哺乳动物缺氧适应性反应的一类关键转录因子,能够调节100多种靶基因的表达从而使机体与组织细胞适应外周环境氧浓度的变化.在组织细胞中缺氧诱导因子家族蛋白稳定性与活性受到严密的调节,主要方式有:羟基化、泛素化、乙酰化、磷酸化、小泛素样因子修饰.
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IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究
目的 研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响.方法 在成功构建人IRE1α基因全长重组质粒的基础上,设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体(pS1;pS2);采用巢式PCR扩增XBP1启动子,插入到pGL3-Basic载体,构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1.分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBP1报告基因重组质粒共转染入SW1353细胞和Saos-2细胞中,48 h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用.结果 酶切及测序结果证实siRNA1α干扰质粒和XBP1启动子真核表达载体均构建成功,双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中,直接载体pcDNA3.15(-)IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组(P＜0.5),并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和;而siIRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低.免疫印迹结果显示,过表达IRE1α明显上调剪接型XBP1S蛋白的表达.结论 人恶性骨肿瘤细胞中,过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达,并能有效促进XBP1U剪切生成XBP1S;通过siRNA方法抑制IRE1α后,XBP1启动子的转录与表达受到抑制.本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础,为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据.
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EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析
目的 构建含有不同长度 EphA3 基因启动子片段的报告基因载体,研究其在 293T 细胞和 MEF细胞中的转录活性.方法 以Balb/C小鼠基因组 DNA 为模板,扩增不同长度的 EphA3 基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒 pGL3-Basic 真核表达载体内.酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和 pRI-CMV 内对照质粒共转染 293T 和 MEF 细胞,分析不同长度的 EphA3 基因启动子片段的转录活性.结果 酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3 基因的核心启动子区域位于-279bp～+110 bp之间,在 293T 细胞和 MEF 细胞中其转录活性相似.结论 成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了E-phA3 基因的核心启动子区域.
关键词： EphA3基因 启动子 荧光素酶报告基因载体 转录活性 -
JNK3抑制NF-κB转录活性的研究
目的 研究人c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N-terminal kinases 3,JNK3)对核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)转录活性的影响.方法 构建人JNK3真核表达载体pcDNA3.1-JNK3,与3×κB-luc报告基因质粒共转染人胚胎.肾细胞293(HEK293),分别进行如下处理:共转染50 ng pCMV-Myc-p65质粒;转染24 h后,加入浓度为10 ng/ml的TNF-α或IL-1β刺激6 h,收集细胞,检测荧光素酶活性.结果 成功构建了peDNA3.1-JNK3真核表达载体;提高细胞内p65水平,加入TNF-α或IL-1β刺激均可明显激活NF-κB的转录,JNK3对NF-κB的转录活性有明显抑制作用,且随着JNK3转染剂量的增加,抑制作用增0强.结论 示JNK3能明显抑制NF-κB的转录活性.
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缺氧诱导因子与恶性肿瘤
缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible Factor 1, HIF-1)是细胞在缺氧条件下产生的一种核转录因子,它作用于靶基因,使其转录活性发生改变,介导组织细胞产生一系列的缺氧适应性反应.本文就近年来国内外对HIF-1在恶性肿瘤发生发展中的作用方面的研究进行讨论.
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RNA激活研究进展
近年的研究发现非编码RNA(ncRNA)分子能在多个水平参与基因表达的调控机制,其中小分子双链RNA(dsRNA)对相关蛋白表达的特异性抑制作用已经进行了广泛而深入的研究,如小干扰RNA(siRNA)能够诱导与其分子核糖核苷酸排列序列相一致的mRNA降解,或可使相应基因启动子区域DNA的同源序列段CpG岛发生甲基化[1,2],并导致相应的基因失去转录活性,造成特定基因沉默.细胞内源性的microRNA(miRNA)也可在基因转录和翻译水平抑制基因的表达[3-5],体现出ncRNA分子在基因表达调控中的多样性.
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DNA甲基化对Ki-67启动子转录活性的影响
目的 观察DNA甲基化对Ki-67启动子转录活性的影响.方法 使用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,使用甲基化酶(M.SssI、M.HpaII、M.HhaI)诱导Ki-67启动子DNA片段发生不同程度的甲基化,将甲基化的启动子片段插入pGL3-Basic载体得到甲基化Ki-67启动子荧光素酶报告质粒,并以非甲基化Ki-67启动子荧光素酶报告质粒作为对照,分别转染正常细胞(HL-7702、HUVEC)和肿瘤细胞(A549、EJ、Kert-3、Hela和SGC-7901),使用双荧光素酶报告基因检测系统测定甲基化的Ki-67启动子在这些细胞中的转录活性.结果 甲基化Ki-67启动子的转录活性均有不同程度的下降,其下降幅度依次为M.SssI处理组＞M.HhaI处理组＞M.HpsII处理组,其中M.SssI处理组启动子的转录活性几乎完全消失.结论 Ki-67启动子的甲基化抑制了其转录活性,抑制程度与DNA甲基化程度和甲基化位置有关.
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细胞内钙在人胃癌细胞缺氧诱导因子-1表达及转录激活中的作用
目的 观察细胞内钙变化对氧调节性亚单位HIF-1α表达及其HIF-1转录激活的影响.方法 常氧时,采用通透性细胞内钙的螯合剂BAPTA-AM或钙的离子载体Ionomycin降低或升高细胞内钙,用Western-blot检测其对SGC7901细胞中HIF-1α蛋白表达的影响,然后采用间接免疫荧光法、双荧光素酶报告系统及ELISA法检测改变细胞内钙对HIF-1α转位、HIF-1转录活性及其靶基因血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌的影响.结果 用BAPTA-AM降低细胞内钙,能诱导HIF-1α的表达,促进HIF-1α的转位,增强HIF-1的转录活性,增加HIF-1调节基因VEGF的分泌.用Ionomycin升高细胞内钙,虽然也有微弱的促HIF-1α稳定及转位作用,但对HIF-1转录活性及VEGF的分泌并无明显影响.结论 螯合细胞内钙能诱导胃癌细胞中HIF-1α的表达及HIF-1的转录激活,提示细胞内钙变化可能在胃癌细胞的缺氧信号转导过程中发挥了重要作用.
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Smad3在转化生长因子β1调控人牙本质基质蛋白1基因表达中的作用
目的:观察Smad3在转化生长因子β1(TGF-β1)调控人牙本质基质蛋白1(DMP1)转录表达中的作用并对DMP1基因启动子上的结合位点进行初步定位.方法:将Smad3瞬时转染至具有矿化活性的人牙髓干细胞(HDPSC)中,观察Smad3蛋白表达和转位情况,并检测在有无TGF-β1的刺激下细胞中pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86启动子活性的变化.pGL3-P-505～+86与Smad3共转染至细胞中,10 ng/ml TGF-β1刺激2 h后,提取细胞核蛋白,EMSA法检测DMP1基因启动子-505～-193 bp区存在的Smad3结合位点.结果:HDPSC中瞬时转染Smad3后,其主要表达于细胞胞浆中,随着TGF-β1刺激不同时间后,Smad3在细胞中的表达出现从胞浆到胞核的转位.Smad3可明显加强TGF-β1下调pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86启动子活性的作用,在DMP1基因启动子-505～-193 bp区至少有一个Smad3结合区域为-209～-201 bp区的GTCTAGTCA序列.结论:Smad3是TGF-β1信号通路的下游作用分子,可介导TGF-β1下调DMP1基因转录过程,DMP1基因启动子-209～-201 bp区序列为Smad3结合区域.
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端粒酶应用于诊断肺癌的研究进展
端粒(telomere)是真核细胞线形染色体末端的DNA序列，含有TTAGGG简单的重复结构，它能防止染色体发生降解、端－端融合、重组和染色体丢失，起到稳定染色体的作用。随着细胞分裂次数的增多，端粒DNA逐渐缩短，终导致细胞死亡。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体，具有逆转录活性，能以自身RNA为模板从头合成端粒序列，以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短[1]。近期研究表明，端粒酶与细胞增生、分化和不死性有着极为密切的关系，端粒长度的缩短和端粒酶活化是细胞获得永生和癌症发生的重要因素。自从1989年Morm首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，利用端粒酶作为肿瘤的特异性标记物用以诊断和评估预后，并通过抑制端粒酶活性来治疗肿瘤已成为近年肿瘤研究的热点。端粒酶可作为肺癌诊断的标记物，其活性的测定对诊断肺癌恶性程度和病理分期具有重要价值。
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Ag-NORs与人肝细胞活性的研究
目的:通过正常肝细胞和肝癌细胞增殖活性的核仁组成区嗜银蛋白(Ag-NORs)测定,定性分析正常肝细胞和肝癌细胞细胞核的大小并统计Ag-NOR的数目.方法:同一个实验室分别培养正常肝细胞和肝癌细胞,用胰酶分别洗脱贴壁生长的细胞,用核仁银染法制片,显微镜下观察并比较肝细胞与肝癌细胞Ag-NOR数目,肝细胞1～3个,肝癌细胞4～8个,且肝癌细胞较正常肝细胞大、形态不规则.结果:正常肝细胞和肝癌细胞活性相差较大,正察常肝癌细胞的活性与核仁组成区相关嗜银蛋白(Ag-NORs)的关系较密切.结论:本实验说明AgNOR颗粒数目对肝癌细胞活性具有较高估测价值.
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Ag-NORs与人头发毛囊细胞活性的研究
目的：通过对男女性头发毛囊细胞增殖活性的核仁组成区嗜银蛋白(Ag-NORs)测定，定量分析男女头发、白发与黑发性的活性与核仁组成区相关嗜银蛋白(Ag-NORs)的关系。方法：分别收集50名男女老少性的头发，提取毛囊细胞，用核仁银染制片，显微镜下分别计数1100个男女老少及白发毛囊细胞核并统计Ag-NOR的数目。结果：年轻男女毛囊细胞活性相差不大，而老人白发与年轻人的头发毛囊细胞活性相差较大。结论：我们的实验说明AgNOR颗粒数目对细胞活性具有较高估测价值。
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过表达E2F1保护神经元依赖其转录活性
目的 探讨E2F1对小脑颗粒神经元死活的影响及机制.方法 构建表达质粒pcDNA-E2F1(pE2F1)及突变体pcDNA-E2F1-m132(pm132),转染293细胞验证表达,转染小脑颗粒神经元用6×E2F-1uciferase报道基因检测转录活性.转染神经元24 h或48 h后Hoechst 33258核染色,统计转染pE2F1及pm132神经元(GFP阳性细胞)的核固缩率(即凋亡率);或者转染48 h后进行25K、5K处理12hr,统计凋亡率.结果 构建质粒表达E2F1及突变体E2F1-m132成功,E2F1具有转录活性而E2F1-m132没有;表达E2F1及E2F1-m132均未诱导神经元凋亡(P>0.05);表达E2F1抑制5K诱导的神经元凋亡(P<0.05),而E2F1-m132没有抑制效应.结论 E2F1抑制神经元凋亡依赖其转录活性.
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硫化氢通过KDR／mTOR／miR－640／HIF1 A途径促进血管新生
硫化氢（ H2 S）是一种能够促进血管新生的气体信号分子。本实验中，我们证实了H2 S在整体实验和体外实验中均能够促进血管新生。 MicroRNAs是一类小的、保守的非编码RNA，能够在缺血性损伤和肿瘤形成过程中调节血管新生。经NaHS （ H2 S供体）处理的人脐静脉内皮细胞中，miR－640水平显著下降；过表达miR－640阻断H2 S的促血管新生效应。同时，双萤光素酶实验结果表明HIF1A是miR－640的一个直接靶基因，常氧条件下H2 S升高HIF1A的蛋白水平和转录活性，而敲低HIF1A阻断H2 S的促血管新生作用。进一步实验结果显示，H2 S通过KDR－mTOR途径调节miR－640和HIF1A。 miR－640可能是血管新生相关疾病的一个治疗靶点。
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低浓度MNNG引起vero细胞PKA途径激活及CREB磷酸化
紫外线、离子辐射及烷化剂等理化因子不但能直接攻击DNA,还可能通过激活细胞内信号系统引起一系列后继的基因外事件,包括基因表达的改变.已经证明0.2 μmol/L MNNG能在vero细胞中引起DNA聚合酶β转录增加,而其启动子中能为转录因子CREB二聚体结合的CRE基序则被认为是转录激活所必需的.PKA等蛋白激酶能催化CREB丝氨酸-133的磷酸化并激活其转录活性.
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核受体FXR硫氢化修饰后缓解非酒精性脂肪肝
目的：随着饮食习惯和生活方式改变，非酒精性脂肪肝发病率近十年来明显增高。 FXR在胆汁酸代谢及糖脂代谢中起重要作用， FXR硫氢化修饰后对糖脂代谢影响机制尚不清楚。方法：本研究主要用modified biotin switch assay 检测FXR硫氢化修饰。分别用CSE腺病毒和siRNA过表达和敲低H2 S观察FXR变化。 Real－time PCR和Weastern blot等方法检测FXR及下游信号通路关键分子mRNA和蛋白水平变化。用高脂喂养小鼠给予H2 S供体，观察肝脏形态学变化。结果：内源性和外源性H2 S都可使FXR发生硫氢化修饰，并增强其转录活性，抑制糖脂代谢关键分子SREBP1－C表达，其下游FAS、ACC、PEPCK、G6Pase等脂肪酸从头合成基因和糖异生基因受到抑制，动物实验部分高脂饮食小鼠给予H2 S供体腹腔注射后，肝脏HE染色和油红O染色均表明脂滴变小，脂肪肝减轻。结论：研究提示FXR硫氢化修饰后抑制脂质合成，减轻脂肪肝。
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低氧调控Sirt6的表达及其机制研究
低氧是肿瘤的重要微环境，它主要通过低氧诱导因子实现对肿瘤发生发展的调控。近，我们报道多梳蛋白CBX4通过SUMO化修饰低氧诱导因子HIF－1，进而增加其转录活性，促进肿瘤新生血管生成和肿瘤转移（ Cancer Cell，2014，25：118－131）。我们随后的研究发现，经CBX4进行SUMO化修饰的HIF－1α不能结合Sirt6。后者是去乙酰化酶sirtuin家族中的一员，也可能是HIF－1转录活性的共遏制因子。有趣的是，我们发现低氧能够下调Sirt6蛋白而非mRNA的表达。通过siRNA技术分别将低氧下发挥重要作用的两个转录因子HIF－1α／HIF－2α进行knockdown后发现，HIF－2α而不是HIF－1α介导了低氧对于Sirt6的调控。在常氧下转染HIF－2α能够剂量依赖地减少Sirt6的表达。低氧和过表达HIF－2α都能够缩短Sirt6蛋白的半衰期。同时，在分别加入蛋白酶体抑制剂MG132、PS－341或溶酶体抑制剂CQ，发现Sirt6是通过蛋白酶体途径而非溶酶体途径发生降解。在此基础上，我们进一步通过双荧光蛋白检测系统寻找低氧下加速Sirt6降解的泛素E3连接酶。
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Endostatin对小鼠巨噬细胞极化的影响及机制研究
目的：观察endostatin对小鼠巨噬细胞极化的影响。方法：Endostatin转染RAW264．7细胞和小鼠骨髓巨噬细胞（ BM－DMs）；RT－PCR、ELISA、HE染色和MTT检测其对RAW264．7细胞的影响；流式细胞术、ELISA、real－time PCR、Western blot和萤光素酶报告基因检测巨噬细胞极化标记物和NF－κB转录活性。结果：表达质粒能使RAW264．7细胞和BMDMs高表达en－dostatin；HE染色和MTT发现endostatin使RAW264．7细胞的形态发生变化并抑制其增殖；流式细胞术、ELISA和real－time PCR发现，endostatin能使RAW264．7细胞和BMDMs高表达NOS2、IL－6和IL－12p40（M1型巨噬细胞标志物），同时使CD206、IL－10和Arg－1（M2型巨噬细胞标志物）表达下降或不变；萤光素酶报告基因发现endostatin使NF－κB的转录活性增加；Western blot发现p－IκBα、p－p65和p－Stat1表达增加，而p－Stat3表达下降。结论：Endostatin可能通过调节NF－κB通路使小鼠巨噬细胞向M1型发生极化。
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p62参与柳氮磺吡啶抑制NF－κB信号途径和诱导人神经胶质瘤U251细胞凋亡机制的研究
目的：以人神经胶质瘤U251细胞为研究对象，从p62参与核转录因子κB（ NF－κB）信号途径活化角度，探讨柳氮磺吡啶（ SAS）抑制NF－κB信号途径和诱导U251细胞发生凋亡的机制。方法：构建p62 siRNA表达载体，MTT法检测细胞生存率，萤光素酶报告基因分析检测NF－κB转录活性，Western blotting法和间接免疫荧光法检测细胞自噬、凋亡。结果：SAS抑制U251细胞NF－κB转录活性，诱导细胞凋亡和自噬；抑制p62的表达可以增加SAS引起的NF－κB信号途径的抑制和凋亡；SAS通过自噬引起p62蛋白表达下降，抑制自噬可以拮抗SAS引起的NF－κB信号途径的抑制和凋亡。结论：p62蛋白水平在SAS诱导的NF－κB信号通路的抑制和凋亡中起重要作用，靶向抑制p62可能成为提高SAS抗肿瘤效果的新策略。
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缺氧大鼠脑线粒体能量代谢的研究
目的:观察急、慢性缺氧时大鼠脑线粒体能量代谢的特点,并初步探讨其分子机制.方法:将雄性Wistar大鼠随机分为3组:急性缺氧组(AH)、慢性缺氧组(CH)和对照组(C).急、慢性缺氧组大鼠分别连续置模拟海拔4000 m高原3 d(AH)和40 d(CH),23 h/d,对照组在平原同时喂养.急、慢性缺氧组在模拟海拔4000 m高原、对照组在平原分离脑线粒体,用Clark氧电极法测定线粒体呼吸功能,高压液相法测定线粒体内腺苷酸池含量和ATP生成能力,寡酶素抑制法测定F0F1-ATP酶活性,并用[3H]-UTP掺入法测定线粒体体外转录活性.结果:急性缺氧大鼠IV态呼吸(ST4)显著高于对照组,而呼吸控制率(RCR)、线粒体内ATP含量、ATP生成率和F0F1-ATP酶活性均显著低于对照组;慢性缺氧大鼠ST4显著低于急性缺氧组,而RCR、线粒体ATP含量和F0F1-ATP酶活性则显著高于急性缺氧组,而线粒体ATP含量和F0F1-ATP酶活性显著低于对照组;急性缺氧大鼠脑线粒体体外转录活性显著低于对照组,慢性缺氧组线粒体体外转录活性显著高于急性组,低于对照组;F0F1-ATP酶活性与线粒体体外转录活性呈线性相关.结论:急性缺氧可抑制脑线粒体呼吸功能和F0F1-ATP酶活性,使电子传递受阻,发生氧化磷酸化解偶联,线粒体ATP含量降低;慢性缺氧虽有所恢复,但仍未达到平原对照水平.急、慢性缺氧时大鼠脑线粒体体外转录活性的改变与F0F1-ATP酶活性的改变相一致,两者呈线性相关,提示mtDNA编码氧化磷酸化基因表达的改变可能参与了缺氧所致线粒体氧化磷酸化障碍的机制.
