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IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响
目的 构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响.方法 应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-IRE1α、pAd-R+K.随后在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad-IRE1α、Ad-R+K.用直接PCR法鉴定重组腺病毒,后者体外感染软骨干细胞ATDC5,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪分别检测在内质网应激(ERS)和非ERS状态时重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响.结果 酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd-IRE1α、pAd-R+K.流式细胞仪检测结果显示,在ERS状态时,重组腺病毒质粒Ad-IRE1α、Ad-R+K感染后ATDC5细胞G1期比例明显降低,S期细胞比例明显升高(P＜0.05),细胞凋亡率明显增高(P＜0.05).结论 含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5细胞的增殖和凋亡.
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佩兰对2型糖尿病合并脂代谢紊乱大鼠肝脏肌醇必需酶1α表达的影响
[目的]研究佩兰中药颗粒对2型糖尿病合并脂代谢紊乱大鼠肝脏肌醇必需酶1α(IRE1α)表达的影响.[方法]将造模成功的合并脂代谢紊乱的2型糖尿病大鼠按随机数字表法随机分为模型组 、佩兰中药组 、吡格列酮组,每组9只,另设空白对照组10只.佩兰中药组予佩兰中药颗粒按3 g/(kg·d)灌胃给药,吡格列酮组0.3 mg/(kg·d)灌胃,模型组及空白对照组予生理盐水灌胃,持续给药5周,检测各组大鼠血糖、血清甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、血清游离脂肪酸(FFA)水平,检测肝脏IRE1α基因及蛋白表达水平.[结果]经治疗后,佩兰中药组大鼠的血清TG、TC水平明显低于模型组,肝脏IRE1α的基因及蛋白表达水平明显高于模型组.[结论]佩兰可以提高2型糖病合并脂代谢紊乱大鼠肝脏中IRE1α的表达.
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内质网应激跨膜蛋白IRE1α及下游信号分子ASK1、JNK在PTSD大鼠中缝背核应答URP的分子机制
目的 从蛋白和基因水平上观察PTSD大鼠中缝背核神经元IRE1 α、ASK1及其下游信号分子JNK表达量变化.方法 采用国际上公认的单一延长应激(single-prolonged stress,SPS)的方法建立PTSD大鼠模型;采用Morries水迷宫测试SPS刺激后大鼠的空间记忆和学习能力;采用免疫组化、Western blot及Real TimePCR检测PTSD大鼠中缝背核神经元IRE1α、ASK1、JNK蛋白及mRNA水平表达.结果 模型组大鼠平均逃避潜伏期显著高于正常对照组,在目标象限停留的时间百分比明显低于正常对照组.经SPS刺激后,PTSD大鼠中缝背核神经元IRE1α、ASK1、JNK在蛋白和基因水平上阳性表达增多.结论 SPS刺激激活PTSD大鼠中缝背核神经元的IRE1α-ASK 1-JNK细胞凋亡信号通路,诱发下游的级联反应,导致中缝背核神经元的凋亡.
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IRE1α-XBP1通过上调IL-6表达促进黑色素瘤细胞增殖的分子机制
目的 阐述内质网应激中IRE1α-XBP1信号通路在黑色素瘤细胞增殖中的作用及分子机制.方法 收集61例来自复旦大学附属中山医院的黑色素瘤患者的临床资料并进行分析,病理组织切片行XBP1s免疫组化染色并测定XBP1s的mRNA水平.过表达IREIα和XBP1s,检测正常黑色素细胞系(HEMn-MP)及黑色素瘤细胞系(Mel-RMu)中IL-6和XBP1s的表达.在黑色素瘤细胞系中过表达IRE1α和XBP1s,联合使用IL-6中和抗体,检测黑色素瘤细胞增殖.结果 人黑色素瘤组织中XBP1s表达显著升高,在正常黑色素细胞系HEMn-MP和黑色素瘤细胞系Mel-RMu中,过表达IRE1α和XBP1 s均可上调IL-6表达,且在黑色素瘤细胞系Mel-RMu可促进其增殖,给予IL-6的中和抗体后可部分抵消其促增殖作用.结论 IRE1α-XBP1s-IL-6信号通路通过分泌IL-6介导黑色素瘤细胞的增殖,终效应由分泌IL-6来实现.
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IRE1α通过UPR影响非洲爪蟾胚胎发育
目的:探讨IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中是否介导未折叠蛋白反应(UPR),并在衣霉素(tunicamycin,TM)诱导的胚胎发育畸形中发挥挽救作用.方法:利用TM处理胚胎激发内质网应激；应用显微注射mRNA方法实现基因过表达,通过注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)实现基因封闭;RT-PCR检测XBP1剪切情况.结果:XBP1剪切随IRE1α过表达及封闭而增加或减少:TM处理导致胚胎发育畸形,xBP1剪切增加,封闭XBPI可部分挽救发育畸形；封闭IRE1a可明显挽救发育畸形,XBP1剪切恢复.结论:IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中介导UPR,封闭IRE1α可逆转TM诱导的胚胎发育畸形,部分通过XBP1途径发挥作用.
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内质网应激分子IRE1α、JNK在难治性颞叶癫痫患者脑组织中的表达
目的 观察难治性颞叶癫痫患者颞叶皮层内质网应激相关分IRE1α、JNK的表达,探讨内质网应激在难治性颞叶癫痫脑损伤中的作用.方法 应用免疫荧光、Western b lot方法检测25例难治性颞叶癫痫患者手术切除的颞叶皮层脑组织IRE1α、JNK的表达,并与性别、年龄相匹配的对照组进行比较.结果 与对照组相比,IRE1α、JNK在癫痫组表达明显上调(P＜0.05).结论 内质网应激分子IRE1α、JNK可能参与了癫痫后脑损伤,从而为癫痫脑损伤的治疗提供新的靶点.
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IRE1α和IRE1β在DSS诱导的小鼠慢性结肠炎中的表达及意义
目的 探讨肌醇需求酶1(IRE1)α和IRE1β在葡聚糖硫酸钠(DSS) 诱导的小鼠慢性结肠炎中的表达及意义.方法 选择8~10周龄的C57BL/6雌性小鼠随机分为两组:对照组10只,正常饮水;慢性炎症组10只,先给予1.0% DSS自由饮用7 d,然后正常饮水14 d如此作为一个周期,循环3个周期建立小鼠慢性结肠炎模型.通过疾病活动指数(DAI)评分、结肠长度测定和HE染色等方法评估肠道炎症程度.采用实时定量PCR技术检测小鼠结肠组织中炎症因子、内质网应激因子IRE1α、IRE1β、非剪接型X-盒结合蛋白1(XBP1u)、剪接型X-盒结合蛋白1(XBP1s)和黏蛋白(MUC)2 mRNA表达,免疫组织化学方法检测IRE1α、IRE1β和MUC2表达.结果 对照组小鼠无肠炎表现,而慢性炎症组在3个周期末结肠出现炎症表现.实时定量PCR结果显示白介素(IL)-6、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA在慢性炎症组高于对照组(P<0.05);XBP1s 和IRE1α mRNA在两组表达无明显差异;XBP1u mRNA在慢性炎症组表达低于对照组(P<0.05).IRE1β和MUC2 mRNA在慢性炎症组表达均低于对照组(P<0.05).IRE1α蛋白主要表达于结肠上皮的刷状缘、浆细胞等细胞的胞质中,其表达量在炎症组高于对照组,IRE1β蛋白和MUC2蛋白主要表达于结肠上皮细胞胞质中,两者表达量在炎症组低于对照组(P<0.05).结论 IRE1α可能通过对XBP1进行剪接来参与肠道炎症反应,并且IRE1α还有可能通过其他机制来调节自身的表达来参与炎症过程;IRE1β和MUC2可能与结肠上皮的功能维持有关,在肠道炎症过程中IRE1β和MUC2表达功能受到抑制而影响炎症的发生和发展.
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IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究
目的 研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响.方法 在成功构建人IRE1α基因全长重组质粒的基础上,设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体(pS1;pS2);采用巢式PCR扩增XBP1启动子,插入到pGL3-Basic载体,构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1.分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBP1报告基因重组质粒共转染入SW1353细胞和Saos-2细胞中,48 h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用.结果 酶切及测序结果证实siRNA1α干扰质粒和XBP1启动子真核表达载体均构建成功,双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中,直接载体pcDNA3.15(-)IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组(P＜0.5),并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和;而siIRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低.免疫印迹结果显示,过表达IRE1α明显上调剪接型XBP1S蛋白的表达.结论 人恶性骨肿瘤细胞中,过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达,并能有效促进XBP1U剪切生成XBP1S;通过siRNA方法抑制IRE1α后,XBP1启动子的转录与表达受到抑制.本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础,为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据.
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siIRE1α重组腺病毒对内质网应激介导凋亡的影响
目的 构建内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1 α,IRE1α)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒,并探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)状态下其对C2C12细胞增殖凋亡的影响.方法 人工合成靶向IRE1α的siRNA序列,连接到穿梭载体pSES-HUS上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183感受态中进行同源重组,得到pAdSES-HUS-IRE1αsiRNA重组质粒.通过脂质体介导在HEK293细胞中包装并扩增重组腺病毒Ad-IRE1α siRNA,在C2C12细胞中采用RT-PCR和Western blot检测其干扰效果,并通过FCM法和MTT检测Tm诱导ERS时病毒对C2C12细胞增殖凋亡的影响(分为4组:NC组、Tm单独处理组、Tm+ Ad-RFP组和Tm+ Ad-IRE1 α siRNA组),Western blot检测C2C12细胞中Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达.结果 成功获得了病毒滴度约为4.3×1011 PFU/mL的重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA.RT-PCR和Western blot检测结果表明,该重组腺病毒有效地抑制了C2C12细胞中IRE1α的表达.FCM检测结果表明,ERS条件下,Tm+ Ad-IRE1α siRNA组S期的细胞比例分别比Tm单独处理组和Tm+ Ad-RFP组升高12.62％和14.80％ (P ＜0.05);凋亡率比Tm单独处理组和Tm+ Ad-RFP组降低16.64％和16.26％ (P ＜0.05).MTT实验结果与Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致.结论 重组腺病毒Ad-IRE1α siRNA在C2C12细胞中能有效抑制IRE1 α的表达;ERS状态下,RNA干扰IRE1α基因可促进C2C12细胞的增殖,抑制其凋亡.
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IRE1α促进人牙周膜成纤维细胞增殖
目的 研究内质网跨膜蛋白IRE1α对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)增殖的影响.方法 将成功构建的人IRE1α基因重组质粒染入hPDLFs细胞,采用免疫印迹法检测IRE1α重组基因在真核细胞内的表达情况,XTT法和流式细胞仪(FCM)检测转染后hPDLFs细胞增殖和细胞周期变化.结果 酶切及测序结果证实IRE1α重组质粒构建成功；免疫印迹分析结果证实,IRE1α重组质粒能在hPDLFs细胞内正确表达；在内质网应激(ERs)状态下,与衣霉素(tunicamycin,TM)对照组相比,XTT检测结果显示:IRE1 α实验组hPDLFs细胞增殖率明显增高(P＜0.01)；FCM结果分析显示:IRE1α实验组hPDLFs细胞s期比例增加而G1期减少(P＜0.05).结论 在ERS状态下,IRE1α促讲hPDLFs细胞增殖,促进hPDLFs细胞从G1期进入S期.
