FOXO蛋白在动物细胞的分化、增殖、免疫、衰老调节中的作用

目的:总结FOXO亚家族在动物细胞的分化、生长、增殖、代谢、免疫及衰老调节方面的多样性功能,为进一步开展FOXO研究提供新思路.资料来源:应用计算机检索Medline 2000-01/2005-05关于FOXO的文章.检索词"foxo",文章的语种类采用系统默认值.同时利用计算机检索中国期刊全文数据库2000-01/2004-05相关的文章,限定文章语言种类为中文,检索词"foxo"或"forkhead转录因子".资料选择:收集到119篇文献,对资料进行初审,排除重复性研究,选择重点研究FOXO蛋白在动物细胞的分化、增殖、免疫、衰老等调节功能方面作用的相关文献47篇,其中研究相似的以发表在较权威杂志者优先.资料提炼:将筛选到的47篇文献按照FOXO蛋白在动物细胞的分化、增殖、免疫、衰老等调节功能方面的作用分类.其中有11篇主要关于FOXO信号转导方面的文献,9篇与细胞的分化和增殖有关,5篇与生长发育有关,13篇与代谢明显有关,6篇与免疫有关,5篇与繁殖有关,9篇与衰老调节有关.资料综合:47篇文献共涉及到了从线虫、果蝇低等低等动物到哺乳动物(小鼠、大鼠与人)等多种动物或细胞的有关FOXO亚家族在细胞的分化、生长、增殖、代谢、免疫及衰老调节方面的调节功能.结论:FOXO是Fox蛋白亚家族的成员之一,其位于很多信号转导途径的交叉点,在动物细胞的分化、生长、增殖、代谢、免疫及衰老调节方面具有重要的多样性功能.

慢病毒载体的构建及优化

目的:针对慢病毒载体的基因组装、转导及基因表达的优化论述,及不同种属的慢病毒载体的低活性加以说明,同时对慢病毒遗传体系的产生、转导效率和生物安全性进行总结.资料来源:应用计算机检索Pubmed以及美国SCI和Medline数据库2000-01/2004-12有关慢病毒载体的论文,检索词"lentivirus vectors,immunodeficiency",并限定文章语言种类为English.同时应用计算机检索中国期刊网数据库1995-01/2005-12有关慢病毒载体构建的文章,限定文章语言种类为汉语,检索词"慢病毒载体".资料选择:对检索到的相关信息及文章进行整理,选取针对性强的文章.纳入标准:①临床研究性文章.②基础研究文章.排除标准:①其他病毒载体的结构文献以及重复性资料.②诸多病毒实验应用性文献.③重复同一研究.资料提炼:共收集到198篇关于慢病毒结构原理的相关文献,其中包括英文文献150篇,中文文献48篇,有21篇符合纳入标准.资料综合:介绍不同源慢病毒载体的构建和慢病毒的基因位点.影响基因转移的一个主要因素是细胞的基因表达.人类转基因载体的一个重要特点是可以调节转基因的表达.调节转基因信号的另一个途径是运用可切割的前病毒产物.转基因载体是建立在逆转录病毒之上,主要包括肿瘤逆转录病毒和慢病毒,这些病毒载体系统是哺乳动物细胞外源基因传递、整合和表达的有效途径.结论:蛋白酶、rev.慢病毒蛋白和VSV/G糖蛋白均具有细胞毒性和抑制细胞的作用,当连续表达时要求使用诱导表达系统.

体外培养成骨细胞的影响因素

目的:成骨细胞是骨形成和骨代谢的核心部分,成骨细胞体外培养是研究骨代谢和成骨机制的重要手段.因此,研究体外培养成骨细胞的影响因素有重要意义.资料来源:应用计算机检索Medline 1980-01/2004-12相关体外培养成骨细胞的影响因素的文献,检索词"osteoblasts,culture in vitro,influencing factors",限定文献语言种类为English.同时计算机检索CBM 1995-01/2004-12相关文献,检索词为"成骨细胞,体外培养,影响因素",限定语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的文献查找全文.纳入标准:影响体外培养成骨细胞的因素,包括:①物理因素.②微量元素.③生长因子.④激素.排除标准:综述文献、重复研究.资料提炼:共收集到105篇关于体外培养成骨细胞影响因素的文献,排除重复或类似的同一研究,纳入17篇符合标准的文献.资料综合:①物理因素:电离辐射、微重力、外力、氧压等.②微量元素:微量元素缺乏其可能使骨骼发育受到障碍,甚至畸形,成骨细胞的增殖分化的过程与某些微量元素有着密切的关系,主要包括锌、铝、氟、铜、锰、钙、镁等.③生长因子:与骨生成有关的生长因子主要有骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、成骨生长肽等.④激素:促进成骨细胞的增殖分化的激素有生长激素、雌激素、甲状腺激素、甲状旁腺激素、糖皮质激素等.结论:体外培养成骨细胞的影响因素较多,了解这些影响因素有助于研究有效的体外培养成骨细胞方法及组织工程学的研究.

功能性电刺激脚踏车系统在康复医疗中的研究与应用

目的:综合分析功能性电刺激脚踏车系统的研究历史和新进展,简要介绍目前几种较为成熟的功能性电刺激脚踏车系统,展望该研究领域的发展前景.资料来源:应用计算机检索PubMed和EI数据库1980-01/2005-01相关功能性电刺激技术脚踏车系统文献,检索词"FES,FNS,FES Cycling"限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库、维普数据库1995-01/2005-03相关功能性电刺激的文章,检索词"功能性电刺激,脊髓损伤",限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,选取研究功能性电刺激脚踏车系统在医疗康复中应用及其系统开发等方面的相关文献.通过摘要来查找全文,纳入标准:是否对患者起到康复作用.排除标准:综述文献、重复研究、Meta分析类文章.资料提炼:共收集到35篇相关文献,20篇文献符合纳入标准,排除15篇.资料综合:20篇文献对功能性电刺激脚踏车进行原理性介绍,涉及功能性电刺激脚踏车的软硬件设计,提出相应的实验、优化设计方法,此外还指出功能性电刺激脚踏车在医疗康复方面起到的作用.结论:功能性电刺激脚踏车训练系统能显著的改善脊髓损伤患者身体状况,甚至将康复医疗器械变为患者的日常工具或者娱乐设施.功能性电刺激脚踏车系统的易于实现性,能给患者带来恢复正常生活的希望.因此,投入更多的精力在功能性电刺激脚踏车系统上是非常有必要的.

ActiGait植入式神经电刺激仪对足下垂患者步态的改善

目的分析ActiGait植入式神经电刺激仪对足下垂患者步态的改善情况.方法植入式神经电刺激产品Actigait应用植入式多通道刺激接收器(丹麦Neurodan公司研制),通过电极刺激膝上方腓总神经,引发小腿前方足背屈肌肉收缩,从而产生抬足动作.每次刺激均由一个置于鞋内位于足跟的非植入式无线开关在每次行走足跟着地时触发.结果Actigait可有效改善患者步态,未出现与手术植入物或外部仪器相关的并发症.问卷调查术前患者对Actigait的接受度及术后患者对Actigait的满意度均良好.结论与传统的植入式足下垂治疗刺激器相比,Actigait具有多通道刺激系统,便于医生在仪器植入后对刺激产生的足部动作随时进行调整,以获得平衡、有效的背屈抬足动作,从而更好的改善步态,提高患者生活质量.

节段性骨缺损修复材料的类型及其应用

目的节段性骨缺损的治疗是骨科领域的一大难题,作为治疗的主要手段,植骨材料的研究取得很大进展.针对其总结经验、查找不足、选择正确方向.方法应用计算机检索Medline和万方数据库1999-01/2005-03与节段性骨缺损修复相关的文章,对修复机制及支架材料进行归纳总结和分析.结果①节段性骨缺损修复机制涉及骨传导、骨生成和骨诱导三方面.②支架材料可分为自体骨、异体骨、异种骨和人工骨四大类.③每种支架材料均有各自的优势和不足,取长补短是其应用的前提条件.结论复合性植骨材料和联合移植方法是治疗节段性骨缺损的必然趋势和有效手段.

小夹板加动态肩外展矫形器治疗肱骨干骨折的优势

目的观察小夹板加动态肩外展矫形器对肱骨干骨折愈合及肩功能恢复的效果.方法选择唐都医院全军骨肿瘤研究所2001/2004收治的肱骨干骨折患者55例,随机分为治疗组(小夹板加动态肩外展矫形器外固定)35例和对照组(常规夹板外固定)20例,治疗后4,6,8,12周进行X射线评分评估骨痂生长情况、并比较骨折愈合时间及功能恢复情况.结果①X射线评分:治疗后各时间点治疗组均低于对照组(P＜0.05,0.01).②无论临床愈合时间或骨性愈合时间治疗组均短于对照组(P＜0.05,0.01).③功能恢复治疗组优于对照组.结论矫形器治疗肱骨干骨折能达到理想的复位和维持稳定的固定效果,可有效地遏制骨延迟愈合、骨不愈合等并发症的发生.

睾酮浓度与人脐静脉组织因子途径抑制物的表达

目的:观察生理及超生理浓度睾酮对人脐静脉内皮细胞合成、分泌组织因子途径抑制物的影响.方法:实验于2005-01/06在汕头大学医学院药理实验室完成.将人原代脐静脉内皮细胞复苏后于37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱中静置培养,所用细胞为两三代.将消化好的细胞移入96孔板,接种密度为1×108 L-1,每孔100 μL.24 h后分为不同浓度睾酮组(3×10-9,3×10-8,3×10-6,3×10-5 mol/L)及单纯培养液对照组,继续孵育48 h,吸取上清,酶联免疫吸附法测定各组组织因子途径抑制物蛋白含量.反转录-聚合酶链反应法观察各组组织因子途径抑制物基因表达水平.结果:①人血管内皮细胞组织因子途径抑制物含量:对照组,3×10-9,3×10-8,3×10-6,3×10-5 mol/L睾酮组组织因子途径抑制物含量分别为(6.43±0.61),(9.8±1.18),(9.8±1.05),(6.43±1.19),(5.43±0.66)μg/L,生理浓度睾酮可明显增加内皮细胞上清液中组织因子途径抑制物含量,而3×10-5 mol/L组的组织因子途径抑制物含量明显低于对照组(P＜0.05).②不同浓度睾酮组组织因子途径抑制物mRNA水平:3×10-9,3×10-8 mol/L组组织因子途径抑制物mRNA水平明显高于对照组(P＜0.05),而3×10-5 mol/L组组织因子途径抑制物mRNA水平又显著降低(P＜0.05).结论:生理浓度睾酮通过雄激素受体促进组织因子途径抑制物合成、分泌,增强抗凝系统活性,有利于预防男性冠心病及心肌梗死等血栓性疾病的发生.

兔角膜新生血管形成过程中三氧化二砷的抑制作用

目的:观察兔角膜碱烧伤后创面愈合过程中应用不同浓度三氧化二砷对角膜新生血管形成的抑制.方法:本实验于2005-03/2005-09在哈尔滨医科大学第一临床医学院动物实验室及中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病实验室完成.①建立兔角膜碱烧伤模型.②随机将48只兔分为对照组和3个实验组(三氧化二砷0.1 mL组,0.3 mL组和0.5 mL组),每组12只.对照组结膜下注射0.3 mL生理盐水;3实验组结膜下分别注射浓度为1 g/L的三氧化二砷0.1 mL,0.3 mL,0.5 mL,2次/周.③分别于碱烧伤后第7,14,28天,用裂隙灯显微镜观察兔角膜新生血管的生长情况.各组于各时间点随机处死4只实验动物,利用反转录-聚合酶链反应方法检测兔角膜血管内皮生长因子的表达.结果:①兔角膜碱烧伤后的大体情况:兔角膜的一般状态,实验组比对照组好,并随三氧化二砷剂量的增加而一般状态渐好.②兔角膜碱烧伤后角膜新生血管面积:在各时间点上,各实验组角膜新生血管面积均小于对照组,各实验组分别与对照组比较,差异均有显著性意义(P＜0.05).③生理盐水及不同剂量三氧化二砷对兔碱烧伤后角膜血管内皮生长因子的作用:在角膜碱烧伤后7 d血管内皮生长因子有较高表达[对照组,0.1 mL组,0.3 mL组,0.5 mL组依次为(233.52±11.84),(158.28±9.62),(108.94±11.48),(0.01±0.00)ng],14 d达到高峰[对照组,0.1 mL组,0.3 mL组,0.5 mL组依次为(290.01±30.40),(181.13±10.64),(13320±14.76),(0.01±0.00)ng],28 d时明显降低,且对照组明显高于实验组(P＜0.000 1),各实验组血管内皮生长因子的表达随三氧化二砷剂量的增加而减少(P＜0.0001).结论:①低剂量的三氧化二砷对碱烧伤后兔角膜新生血管的形成具有明显的抑制作用.局部应用低浓度三氧化二砷未见眼部不良反应发生.②血管内皮生长因子的表达和角膜新生血管形成呈正相关.三氧化二砷通过抑制细胞血管内皮生长因子的表达而抑制血管的生成.

三种不同载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应

目的:比较牛松质骨粒、磷酸三钙、天然珊瑚载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应.方法:实验于1998-12/2002-06在第四军医大学骨科实验室完成.①重组人骨形态发生蛋白2与牛松质骨粒、天然珊瑚和磷酸三钙按相同比例复合形成3种载体释放系统.②取昆明小鼠90只,随机分为3组,牛松质骨粒组、天然珊瑚组和磷酸三钙组,每组30只.于小鼠股部肌袋一侧植入重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统,另一侧单纯植入0.2 mg重组人骨形态发生蛋白2.③分别于植入后7,14,21 d周麻醉状态下每组各处死10只,取材行组织学检查、成骨量分析和碱性磷酸酶活性测定.结果:90只小鼠全部进入结果分析.①组织学检查术后不同时间牛松质骨粒组和磷酸三钙组成软骨和成骨能力较强,而天然珊瑚组成骨能力稍差.21 d的成骨量分析显示牛松质骨粒组、磷酸三钙组和天然珊瑚组分别较对照组成骨量放大了5.47倍、4.90倍和1.65倍.②牛松质骨粒组、磷酸三钙组之间碱性磷酸酶活性没有显著差异(P＞0.05),均显著大于天然珊瑚组(P＜0.05),3组的碱性磷酸酶活性高峰出现在术后第21天[依次为(285.09±52.29),(256.48±45.99),(177.92±22.69)nkat/g].结论:比较3种不同的重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统,异种松质骨粒表现较强的成骨能力,提出载体放大效应应成为重组人骨形态发生蛋白2载体选择标准之一.

溶胶-凝胶法制备磷灰石-硅灰石多孔生物活性玻璃陶瓷的生物活性

背景:磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷是生物活性优异的骨修复材料,一般通过高温熔制法制备.目的:观察新型溶胶-凝胶法制备磷灰石-硅灰石生物活性玻璃陶瓷及其生物活性.设计:材料工艺设计实验,活体外生物活性实验.单位:四川大学材料科学与工程学院.材料:磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷.方法:实验于2002-08/2003-05在四川大学材料科学与工程学院生物材料研究实验室完成.采用溶胶-凝胶法及后续热处理工艺制备磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷,试样在模拟体液中于37℃浸泡7 d,通过观察表面磷灰石的形成情况考察材料的生物活性.采用JL-1155型激光粒度仪、X射线衍射仪、傅立叶红外转换光谱仪、扫描电子显微镜进行表征分析.主要观察指标:①新工艺溶胶-凝胶法制备的玻璃陶瓷材料的晶型结构、显微结构.②模拟体液中材料表面磷灰石形成情况.③多孔型溶胶-凝胶硅灰石/磷灰石玻璃陶瓷孔径.结果:①溶胶-凝胶工艺制备出玻璃陶瓷材料,其主晶相为羟基磷灰石、氟磷灰石和β-硅灰石,微观结构包括大量2.0～3.0μm微孔.②溶胶-凝胶磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷生物活性优异:体外模拟体液浸泡7 d后,表面生成大量磷灰石颗粒.③多孔支架材料孔隙形态优异,为300～400μm直径相互贯通的大孔结构.结论:通过溶胶-凝胶工艺制备了具有优异生物活性的磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷;此材料可望成为优异的骨修复材料及骨组织工程支架材料.

云南省勐海县布朗族头面部器官的形态观察

目的:对云南省勐海县布朗山布朗族头面部器官28个头面部形态观察项目和5个头面部指数进行全面系统的观察.方法:以2002-05/2002-10云南省西双版纳勐海县布朗山世居布朗族人为观察对象,用随机方法抽取布朗族人200人,男性100人,年龄20～60岁,平均32.83岁;女性100人,年龄18～55岁,平均31.09岁;头颅及颌面部器官形态及功能正常.令被测者端坐,用头颅固位仪将被测者头颅固定,使其眶耳平面(或称法兰克福平面)与水平面平行,用记号笔在头面部对测量点进行标记;在距被测者5 m处用摄像机摄录被测者头面部图像;将所取图像(正面、侧面、仰面)输入计算机存盘备用;采用自行编制的微机测量软件对所取图像进行头面部指数的测量.观察项目:①5个头面部各指数:头长宽指数、头长高指数、头宽高指数、形态面指数、鼻指数.②28个头面部形态指标:上眼睑皱褶、眼裂高度、眼裂倾斜度、鼻翼突度、鼻根高度、鼻根点凹陷、鼻梁横断面、鼻梁侧面观硬骨部、鼻侧面观软骨部、鼻梁整体侧面观、鼻尖形状、鼻尖方向、鼻基部、鼻翼高度、鼻孔形状、鼻孔大径、鼻翼沟显著性、上唇高度、唇的厚度、上唇侧面观、口裂宽度、耳的类型、耳垂类型、面型、眉嵴发达程度、颏部突出度、面部水平观、颧部突出度.结果:参加调查的200人全部进入结果分析.①头面部各指数分型统计结果:头长宽指数均以短头型为主,男女各占46%,45%;头长高指数均以高头型为主,男女各占100%,99%;头宽高指数均以狭头型为主,男女各占73%,81%;形态面指数均以超狭面型为主,男女各占100%,99%;鼻指数均以狭鼻型为主,男女各占74%,69%.②眼部特征:有上眼睑皱褶,男女各占70%,68%;眼裂高度以中等为主,男女各占66%,54%;眼裂倾斜度以眼内外角同一水平为主,男女各占82%,89%.③鼻部特征:鼻翼突度均以微突为主,男女各占75%;鼻根高度以中等为主,男女各64%,70%;鼻根点凹陷以凹陷明显为主,男女各占70%;鼻梁横断面以中等为主,男女各占68%,70%;鼻梁侧面观硬骨部以直的为主,男女各占98%,91%;鼻梁侧面观软骨部以直的为主,男女各占98%,91%;鼻梁整体侧面观以直的为主,男女各占95%,89%;鼻尖形状以钝圆形为主,男女各占64%,58%;鼻尖方向以水平为主,男女各占65%,62%;鼻基部以水平为主,男女各占65%,62%;鼻翼高度以中等为主,男女各占87%,95%;鼻孔形状以三角或卵圆形为主,男女各占87%,81%;鼻孔大径是倾斜方向,男女各占92%,85%;鼻翼沟显著性以中等为主,男女各占75%.④口唇部特征:所有男性呈高度唇高,女性唇高居高者占98%;男性唇厚度以厚凸和厚为主,各占54%,45%,女性以厚为主占63%;男女均以正唇为主,各占86%,91%;口裂宽度以宽型为主,男女各占92%,82%.⑤耳部特征:耳的类型均以缺耳尖型为主,男女各占57%,64%;耳垂类型均以三角形为主,男女各占83%,82%.⑥面部特征:男性面型以卵圆形为主占61%,女性以卵圆形和椭圆形为主,各占43%,27%;男性眉嵴发达度以甚显为主占67%;女性则以中等为主占69%;颏部突出度均以直平为主,男女各占73%,79%;男性面部水平观是以中等型为主占64%;女性以直角型为主占63%;男性颧部突度以中等为主占69%;女性则以扁平者为主占60%.结论:①眼部特征:大多数人有上眼睑皱褶,眼裂处于同一水平,眼裂高度男女两性均以中等为主.②鼻部特征:大多数人属狭鼻型,鼻背较直,鼻根高度中等,鼻根点凹陷明显,鼻尖圆钝,鼻尖和鼻基方向以水平向前为主,鼻孔呈三角形或卵圆形,鼻孔大径倾斜状,鼻翼微突,鼻翼沟中等.③口唇部特征:多数人口唇高度居高,男性唇厚红度以厚凸和厚为主,女性以红唇厚度以厚唇为主,为正常唇,口裂宽.④耳部特征:大部分人缺少达尔文结节,耳垂以三角形居多.⑤头面部其他特征:多数人属短头型;男性卵圆形面型居多,女性则以卵圆形和椭圆形为主,男性眉嵴发达度较明显居多,女性中等为主,面部水平观及颧骨突出度以中等型为主.

人工全髋关节置换骨水泥和无骨水泥假体股骨近端广泛骨溶解的定量分析

背景:目前国内文献只对股骨近端骨溶解进行形态学的观察,尚无定量研究的报告.目的:通过股骨近端骨密度的变化规律,定量分析人工全关节置换术后股骨近端骨溶解改变情况.设计:患者自身前后对照观察.单位:解放军第四军医大学唐都医院骨科.对象:选择1994-03/2004-03第四军医大学唐都医院骨科完成的人工全髋关节置换术患者26例28髋,男14例16髋,女12例12髋.假体类型:改良Moore型骨水泥假体16例17髋为骨水泥假体组,平均年龄57岁;无骨水泥表面微孔型假体10例11髋为无骨水泥假体组,平均年龄55岁.术前患者诊断均为创伤性关节炎,术前Harris髋关节评分平均49(20～77)分.两组患者在年龄、性别、术前诊断方面均匹配.方法:用计算机图像分析方法测两组患者X射线片灰度值,取相对值,即同一张X射线片分别测髂骨、股骨大转子处1.0～2.0 cm2面积上平均灰度值,二者差值代表股骨大转子处骨密度的相对值,并定量分析骨密度改变的规律.主要观察指标:术前1周、术后1周、随访期两组患者股骨大转子处骨密度相对值.结果:26例患者(28髋)随访9个月～10年6个月,全部进入结果分析.随访期骨水泥组和无骨水泥组股骨大转子处骨密度相对值均较术后1周有不同程度的增大,骨溶解发生率100%;无骨水泥组股骨大转子处骨密度相对值随访期平均值72.8(14～130),骨水泥组平均值57.4(9～118),两组差异无显著性意义(P＞0.05).早发生骨溶解为术后9个月,术后2～4年内骨溶解改变明显,第6年呈减缓趋势.结论:人工全髋关节置换术后骨溶解在骨水泥假体和无骨水泥假体都存在,二者无显著差异.

海带多糖L01对血管内皮细胞表达血管性假血友病因子影响的体内外实验

目的:采用体内外实验方法,观察海带多糖对血管内皮细胞释放血管性假血友病因子的影响,探讨海带多糖抗血栓作用.方法:实验于2005-02/06在广西医科大学生理学实验室完成.①体内实验:健康成年SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只.采用肾上腺素法制备血管内皮细胞的损伤模型,模型组为注射肾上腺素,生理盐水替代治疗;海带多糖L01高剂量组、低剂量组分别为注射肾上腺素,予以高、低剂量海带多糖治疗;正常对照组注射生理盐水.用免疫组化的方法检测动脉内膜血管性假血友病因子表达情况以观察胸主动脉内皮细胞损伤的程度,用酶联免疫吸附双抗体夹心法测定血浆中血管性假血友病因子水平.②体外实验:在体外培养的内皮细胞实验中,分为肾上腺素组,肾上腺素加海带多糖L01高、低剂量组和空白对照组,分别测24和48 h上清液中血管性假血友病因子水平.结果:实验大鼠40只均进入结果分析.①海带多糖高剂量组和低剂量组内皮层完整程度明显高于模型组[海带多糖高剂量组(75.00±7.35)%,海带多糖低剂量组(74.67±8.95)%,模型组(53.63±11.62)%,P＜0.05].②海带多糖高剂量组和低剂量组血浆血管性假血友病因子浓度明显低于模型组[海带多糖高剂量组(61.59±6.60)%,海带多糖低剂量组(62.44±7.97)%,模型组(75.51±8.88)%,P＜0.05].③肾上腺素加海带多糖高剂量组和低剂量组细胞培养上清液24和48 h血管性假血友病因子浓度明显低于肾上腺素组[肾上腺素加海带多糖高剂量组(29.35±6.35)%,(30.68±6.71)%;肾上腺素加海带多糖低剂量组(29.00±7.23)%,(32.59±7.40)%;肾上腺素组(39.15±9.56)%,(41.64±7.94)%,P＜0.05].结论:海带多糖抗血栓作用与其保护血管内皮细胞,降低内皮细胞表达血管性假血友病因子水平有关.

重组人红细胞生成素对大鼠急性心肌梗死区域及缺血区毛细血管密度的影响

目的:应用重组人红细胞生成素治疗大鼠急性心肌梗死,观察其对心肌梗死区域细胞凋亡以及缺血区毛细血管密度变化和心功能的影响.方法:实验于2004-06/2005-06在南京大学模式动物研究所完成.选取健康雄性Wistar大鼠16只,随机分为急性心肌梗死组、重组人红细胞生成素组,8只/组.①两组大鼠均结扎左冠前降支建立急性心肌梗死模型,局部心肌变紫色、室壁膨出为模型成功标志.②重组人红细胞生成素组围手术期每天腹腔注射重组人红细胞生成素3000 IU/kg,共3 d(即手术前1 d、手术当天、手术后1 d),在术后第14,15,16天以同等剂量再连续注射3 d.急性心肌梗死组术后各时间点给予等量生理盐水.③左冠状动脉前降支结扎术后3周末测定缺血区毛细血管密度、Bcl-2和Bax的水平,2 d及3周末采用二维超声心动图检查两组大鼠心腔结构及心功能.结果:实验选取大鼠16只,全部进入结果分析.①两组术后3周末毛细血管密度测量结果:与急性心肌梗死组比较,重组人红细胞生成素组毛细血管密度明显增加[(10.4±1.5),(6.3±0.7)个/视野,P＜0.05].②两组术后3周末心肌组织Bcl-2和Bax蛋白的表达:与急性心肌梗死组比较,重组人红细胞生成素组Bax表达明显减弱[(0.146 5±0.013 8),(0.124 8±0.009 8)A,P＜0.05],而Bcl-2表达则明显增强[(0.103 0±0.005 6),(0.116 3±0.005 0)A,P＜0.05].③两组术后3周末心功能各项指标的变化:与急性心肌梗死组比较,重组人红细胞生成素组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径均显著降低[(6.25±0.32),(5.51±0.35)mm;(4.22±0.21),(3.45±0.24)mm;P均＜0.05],左室射血分数明显升高[(69.08±2.23)%,(75.24±3.64)%,P＜0.05].结论:重组人红细胞生成素能减少缺血区心肌细胞凋亡及促进缺血区毛细血管的生成,从而改善和提高心肌梗死大鼠的心脏功能.

胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖条件下成骨细胞的影响

目的:观察胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ在高浓度葡萄糖条件下对成骨细胞增殖和矿化的影响,探讨胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对糖尿病性骨质疏松和骨质减少治疗的作用.方法:实验于2004-07/2005-09在第四军医大学唐都医院感染病中心完成.健康新生24 h内的SD仔鼠3只.①采用组织块培养法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞,分别给以不同葡萄糖浓度的培养液,即正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)和高浓度葡萄糖(25.5 mmol/L).在高糖条件下分别加入胰岛素(10-6 mmol/L)和胰岛素样生长因子Ⅰ(10-7 mmol/L).所有实验分为四组:正常浓度葡萄糖组,高浓度葡萄糖组,高浓度葡萄糖+胰岛素样生长因子Ⅰ组,高浓度葡萄糖+胰岛素组.②MTT法检测不同培养条件对成骨细胞增殖的影响.③原子能吸收法检测钙离子吸收量和体外诱导骨结节的形成来评价成骨细胞的分化.结果:①MTT比色法显示连续培养5 d,不同组吸光度值均成比例增加,与正常浓度葡萄糖相比,高浓度葡萄糖显著促进细胞的增殖,细胞生长率显著高于其他组.胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ下调了高浓度葡萄糖导致的细胞增殖,除第1天以外,该两组细胞的生长率与正常浓度葡萄糖组的结果相似.②从第17天到第32天,各组的钙吸收量显著增加,但高糖组的钙吸收量明显低于其他组.胰岛素样生长因子Ⅰ组的钙吸收量高于胰岛素组,与正常浓度葡萄糖组的钙吸收量相比没有明显差别(P＞0.05).在第32天,高糖组的骨结节数明显低于其他组,而且多数细胞仍处于增殖阶段,钙化的细胞很少.胰岛素样生长因子Ⅰ组的骨结节数多于胰岛素组(P＜0.05),少于正常葡萄糖组(P＞0.05).结论:高浓度葡萄糖刺激成骨细胞增殖但抑制细胞矿化可能直接导致了糖尿病性骨病的病理改变;胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对其矿化的促进作用可能是治疗糖尿病性骨质减少和骨质疏松的机制之一.

自固化磷酸钙人工骨黏附颗粒骨复合物的生物学效能

目的:以自固化磷酸钙人工骨有效地将微小颗粒骨聚集为一体,以增强其植骨修复骨缺损的效能.方法:实验于2004-04/10在哈尔滨医科大学第二附属医院科研楼完成.选取公羊1只,自固化磷酸钙人工骨5g.以自固化磷酸钙人工骨与羊髂骨制取的颗粒骨按10%质量比制成9个固化圆柱状复合物标本.另制取9个单纯颗粒骨标本作为对照,但单纯颗粒骨松散无法聚集塑形.将复合物标本分别置入羊血制取的血清中浸泡4周,观察自固化磷酸钙人工骨黏附颗粒骨的效果.扫描电镜观察复合物标本被浸泡前及被浸泡后1,2周表面及断面的形貌.结果:①自固化磷酸钙人工骨黏附颗粒骨的效果:复合物标本制作固化后及浸泡初期,其表面粗糙,颗粒骨间大间隙达0.5 mm.血清浸泡4周后,复合物标本未解体,浸泡标本的血清清澈、透明.随浸泡时间延长,标本表面有新物质生成,逐渐变光滑,标本表面颗粒骨间的间隙也逐渐增大.②复合物标本血清浸泡前表面及断面形貌扫描电镜观察结果:复合物标本浸泡前表面及断面形貌一致.颗粒骨表面光滑,颗粒骨表面部分被自固化磷酸钙人工骨所覆盖,自固化磷酸钙人工骨呈现磷酸钙的叶片状晶体形貌.③复合物标本血清浸泡1,2周后表面及断面形貌扫描电镜观察结果:复合物标本于血清中浸泡1,2周后,表面及断面形貌均呈现一致变化.复合物中自固化磷酸钙人工骨叶片状晶体形貌被某种新生成物的细颗粒状形貌所取代.结论:自固化磷酸钙人工骨可有效地将颗粒骨聚集为一体,且血清浸泡后复合物表面及断面均能够生成类骨磷灰石.证明与羊髂骨质量比为10%的自固化磷酸钙人工骨颗粒骨复合物具有良好的骨传导性.

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒.方法:实验于2005-03/2005-10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成.①通过聚合酶链反应对pcDNA3.1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点,将其分别定向连入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子,通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒.②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞,通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA的表达.结果:①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定:将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作Xho I/Mlu I和Xba I/Not I双酶切,经10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见1.2 kbp的人骨形成蛋白2条带和592 bp的血管内皮生长因子165条带,酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置.经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实,目的基因插入片段方向正确,DNA序列无突变.②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165 mRNA的表达:以转染pIRES空质粒为阴性对照,48 h后提取转染细胞的RNA分别用P1,P2和P3,P4作为引物进行反转录-聚合酶链反应.结果表明转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1.2 kbp及592 bp两条带.证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA.结论:成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒,为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础.

辛伐他汀对人脐静脉内细胞CD40/CD40L表达的影响

目的:探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激下的人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L表达的影响.方法:实验于2004-03/06在中南大学湘雅二医院实验室完成.实验所用脐带于无菌条件下取自本院产房健康新生儿,产妇知情同意,实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准.辛伐他汀原粉由杭州默沙东制药公司提供.原代培养人脐静脉内皮细胞,实验在第4代有70%细胞汇合的情况下进行.低密度脂蛋白快速分离后加入含10μmol/L硫酸铜的磷酸盐缓冲液氧化修饰24 h,在准备后15 d内用于实验.采用流式细胞技术检测CD40/CD40L在细胞上的表达,采用逆转录多聚酶链式反应检测NF-κB P65mRNA,同时行细胞免疫化学染色检测细胞NF-κB P65的表达.观察辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40/CD40L分子和NF-κB P65mRNA的影响实验中,共分5组:①空白对照组,给予磷酸盐缓冲液.②氧化低密度脂蛋白刺激组,80 mg/L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h.③低浓度辛伐他汀组,先予1 μmol/L辛伐他汀干预1 h,再予80 mg/L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h.④高浓度辛伐他汀组,先予10 μmol/L辛伐他汀干预1 h,再予80 mg/L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h.⑤单纯辛伐他汀组,10μmol/L辛伐他汀干预25 h.免疫化学检测人脐静脉内皮细胞NF-κB P65分子表达的实验中,共分3组:①空白对照组,给予磷酸盐缓冲液.②氧化低密度脂蛋白刺激组,80 mg/L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h.③辛伐他汀组,10μmol/L辛伐他汀干预1 h,再予80 mg/L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h.结果:①氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞后CD40/CD40L的表达情况:20～80 mg/L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h后,CD40/CD40L的表达以浓度依赖和时间依赖的方式增加.②辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激的人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L表达的影响:预先给予辛伐他汀(1μmol/L和10 μmol/L)干预1h明显降低氧化低密度脂蛋白所致的CD40/CD40L表达,与单纯氧化低密度脂蛋白刺激组比较,差异显著(P均＜0.05);10 μmol/L的高浓度辛伐他汀较1 μmol/L的低浓度辛伐他汀作用更明显(P＜0.05);而单纯给予10 μmol/L的辛伐他汀干预不影响人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L的表达.③辛伐他汀对NF-κB P65 mRNA在人脐静脉内皮细胞表达的影响:人脐静脉内皮细胞中加入80 mg/L氧化低密度脂蛋白培养24 h后NF-κB mRNA的表达明显高于空白对照组(0.53±0.06,0.08±0.01,P＜0.01).而预先给予1 μmol/L辛伐他汀孵育1h显著降低氧化低密度脂蛋白刺激升高的NF-κB P65 mRNA,明显低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组(0.31±0.04,0.53±0.06,P＜0.01).高浓度组(10 μmol/L)作用更显著,显著低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组(0.14±0.04,0.53±0.06,P＜0.01),而单纯给予辛伐他汀(10 μmol/L)不影响人脐静脉内皮细胞NF-κB P65 mRNA的表达.结论:氧化低密度脂蛋白以浓度和时间依赖的方式刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40/CD40L,而辛伐他汀以剂量依赖的方式减轻氧化低密度脂蛋白刺激下人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L的表达,可能与其抑制人脐静脉内皮细胞的NF-κB P65的表达有关.提示辛伐他汀可通过抑制高脂血症患者炎症信号通路而到达抗动脉硬化的作用.

高压氧对同种异体肝移植术后肝动脉血栓患者肝功能及肝坏死的影响

目的:分析高压氧治疗对肝移植后肝动脉血栓患者肝功能以及肝坏死的影响.方法:选取2004-11/2005-01解放军总医院肝胆外科收治的同种异体肝移植后肝动脉血栓患者4例,手术方式均为原位背驮式肝移植,术后常规使用普乐可复及强的松口服抗排异.1例明确肝移植动脉血栓行溶栓治疗无效后即行高压氧治疗,3例行高压氧治疗时已明确有肝坏死.高压氧治疗1次/d,2 h/次,2个绝对大气压.治疗前教导患者学习调压动作,预防中耳气压伤发生.结果:按意向处理分析,实验选用同种异体肝移植后肝动脉血栓患者4例均进入结果分析.①1例术后早期明确诊断后即行高压氧治疗,术后3个月肝功能良好,影像检查肝脏无坏死灶形成;3例出现肝坏死后行高压氧治疗,病情均得到很好控制,坏死灶较治疗前好转,临床症状治愈,术后1～4个月,无高压氧相关并发症发生.②高压氧治疗后患者肝功能检查结果:血清总胆红素水平明显低于治疗前[(19.0±5.9),(93.0±31.0)μmol/L,t=4.403,P＜0.05],且血清丙氨酸转氨酶水平亦明显低于治疗前[(2.04±1.68),(26.51±8.16)nkat/L,t=7.106,P＜0.01].结论:高压氧治疗肝移植后肝动脉血栓效果良好,可明显改善肝功能,防止肝坏死的发生,提示针对肝移植后动脉血栓的治疗,高压氧具有较高的应用价值.

重组人质粒pEGFP-人内皮一氧化氮合酶的构建

目的:构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因的人内皮一氧化氮合酶重组质粒,为细胞转染提供实验依据.方法:实验于2005-05/10在首都医科大学宣武医院完成.用EcoRⅠ酶切pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒,获得人内皮一氧化氮合酶基因,设计引物进行聚合酶链反应扩增.将人内皮一氧化氮合酶与pMD 18-T simple平滑载体连接后,行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,回收人内皮一氧化氮合酶,然后将其与经过酶切处理的含有增强绿色荧光蛋白报道基因的载体pEGFP-C1进行连接,形成8.4 kb的质粒,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切进行电泳筛选、鉴定和测序.结果:①目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA的获得:pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒经EcoRⅠ酶切后,电泳可见3 kb及3.7 kb处各出现一条条带,与质粒图谱所示相符,证明质粒正确.加人上下游引物行聚合酶链反应扩增后,电泳可见3.7 kb处出现一条条带,证明人内皮一氧化氮合酶cDNA的获取成功.②人内皮一氧化氮合酶cDNA的酶切处理:人内皮一氧化氮合酶与pMD 18-T simple平滑载体连接后,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳分析可见3.7 kb和2.7 kb处各出现一条条带,证明两者连接成功.③pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的筛选:载体pEGFP-C1与人内皮一氧化氮合酶cDNA的连接后,EcoRⅠ单酶切电泳可见8.4 kb处出现一条条带,再用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳可见4.7 kb和3.7 kb处各出现一条条带,证明连接正确.④pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的序列测定:序列测定结果与pEGFP-C1插入点序列及目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA两端序列对比相同,证明重组质粒构建成功.结论:pEGFP-人内皮一氧化氮合酶重组质粒的成功构建,可用于细胞转染,为人内皮一氧化氮合酶基因转移治疗在心血管疾病中的应用提供实验基础.

体外修复血管平滑肌细胞的方法学研究

目的:采用不同方法体外培养人脐动脉平滑肌细胞,选择以获得体外修复受损平滑肌细胞的佳方法. 方法:实验于2004-12/2005-10在哈尔滨医科大学附属第一医院实验中心卫生部细胞移植重点实验室进行.①取新生儿脐带约5 cm长(家属志愿提供)原代分离血管平滑肌细胞;分别用贴块法和胰酶/胶原酶酶解法分离、培养血管平滑肌细胞.②贴块法:将血管平滑肌细胞组织块20%M199完全培养基(200 mL/L胎牛血清+10 mL/L双抗+5 mL/LL-谷氨酰胺)贴壁24 h后,补足完全培养基培养;胰酶/胶原酶酶解法:第1步胰酶消化:将脐动脉剪成1 mm×1 mm大小.装入含2.5 g/L胰酶培养瓶中,消化15～30 min,加入20%M199完全培养基终止消化.第2步胶原酶消化:将上述处理过的组织块放人含1 g/LⅠ型胶原酶的无血清M199培养基中,过夜,离心,收集细胞,以1×104个细胞/cm2密度接种培养皿中,补足20%M199完全培养基培养.③对两种方法培养的细胞生长形态、数量及平滑肌a-肌动蛋白表达情况进行观察和检测.结果:①贴块法:组织块种植后2周时,多数细胞已贴壁伸展.4～6周细胞达80%融合时,镜下成"峰与谷"样,可传代培养,传代间隔期一般是两三周;胰酶/胶原酶酶解法:细胞多为伴有胞质突起的多角形大细胞,达到生长融合时细胞密度低.2周左右细胞融合,可传代培养.传代间隔期一般是一两周.②贴块法获得的细胞初期生长速度慢,但达到融合前细胞数量多,细胞得率高;胰酶/胶原酶酶解法获得的细胞初期生长速度快,群体倍增时间短,但达到融合前细胞数量少于贴块法,细胞得率低.③胰酶/胶原酶法α-肌动蛋白阳性细胞率高于贴块法(93.1%,71.4%,x2=4.626,P＜0.05).结论:两种方法均可成功培养人血管平滑肌细胞;贴块法合成表型细胞比例大,胰酶/胶原酶酶解法收缩表型细胞比例大,后者所获得的细胞更适合用作修复血管平滑肌细胞的种子细胞.

医用EC耳脑胶粘合修复半月板裂伤

目的:建立半月板裂伤动物模型,采用EC耳脑胶粘合裂伤的半月板,观察半月板裂伤的愈合情况,探讨EC耳脑胶在半月板裂伤治疗上的可行性.方法:实验于2004-01/07在锦州市中心医院动物实验中心及病理科、锦州医学院电镜室完成.健康成年新西兰兔20只,同体对照设计,将每只兔两侧膝关节外侧半月板制造裂伤,右膝外侧半月板为实验组,左膝外侧半月板为对照组,实验组用EC耳脑胶粘合裂伤,对照组裂伤不作任何处理.术后3,6,12,24周分批随机抽取动物5只,麻醉状态下处死,对裂伤半月板进行肉眼观察,光镜和电镜组织学观察.结果:①两组兔半月板肉眼观察:实验组3,6,12,24周各期半月板均无变形、变性.24周时修复组织与正常半月板组织相似,裂伤愈合.对照组3,6,12,24周各期半月板形态无明显变化.各期肉眼所见半月板裂伤仍有哆开.②两组兔半月板光镜组织学观察结果:实验组3周时镜下半月板裂伤粘合处修复组织主要为肉芽组织.6周时镜下半月板裂隙已被纤维结蒂组织及纤维软骨组织连接.24周时镜下半月板裂伤断端已被成熟的纤维软骨组织连结,愈合良好.对照组3,6,12,24周各期半月板裂伤光镜下均未见完全愈合,裂口分离.③两组兔半月板电镜组织学观察结果:同期电镜下观察也有同样结果.实验组3周时镜下半月板裂伤粘合处可见多种细胞成份,其中纤维软骨细胞少,胞核有变性.24周时镜下半月板裂伤处纤维软骨组织紧密连结,排列整齐、粗大的胶原纤维通过断端,裂伤缘消失.对照组3,6,12,24周各期半月板裂伤均未见完全愈合.两组兔24周时半月板裂伤愈合情况比较,差别有显著性意义(P＜0.01).结论:用EC耳脑胶粘合兔半月板的裂伤可使之愈合.此结果为临床半月板裂伤修复提供一基础研究依据.

不同类型人工膝关节假体的功能与其临床应用效果回顾性分析

目的:回顾性分析不同类型人工膝关节假体的临床应用及其疗效.方法:选择解放军总医院2002-01/2005-01收治的398例患者(523个置换膝关节),其中单膝关节置换术276例,276膝,双膝同时置换122例,244膝.诊断分别为骨性关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、色素绒毛结节性滑膜炎.根据患者病情适当选择不同类型人工膝关节假体进行全膝关节置换术.假体的类型包括:①按置换范围,分单髁、全髁型;在全髁置换分为后交叉韧带保留型和后交叉韧带替代型假体.②按限制程度又分限制性、非限制性和半限制性.③按是否模拟半月板功能,又分为胫骨平台垫可旋转滑动型和固定型.半年后对以上患者进行随访,膝关节评分采用美国特种外科医院膝关节评分系统(HSS评分,满分为100分,85分以上为优;70～84分为良),髌骨评分采用Feller等评分标准,随访时调查膝前区疼痛轻重、膝关节活动范围及稳定程度比较,拍摄膝关节正、侧及髌骨30°,90°轴位X射线片.结果:完成随访372例(490膝),随访率93.4%.①疗效:手术优良率89%.患者术后在疼痛、功能方面都有明显改善,尤其在缓解疼痛及膝关节活动范围方面效果显著.②患者术后随访的HSS评分、髌骨评分、膝前痛评分、髌骨功能评分、大屈膝度均较术前显著增加(P＜0.01).③不同类型人工膝关节假体置换术后的HSS评分、髌骨评分、膝前痛评分、髌骨功能评分、大屈膝度、股胫角比较差异无显著意义(P＞0.05).结论:依据各种人工膝关节假体的适应证、禁忌证及预期可达到的功能与使用寿命,根据不同的病情,慎重选择适当的假体,均可达到良好的疗效.

转录因子NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞的增殖

目的:探讨转录因子NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸单独或联合应用对猪血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其机制.方法:实验于2004-05/2005-08在瑞金医院内科实验室完成.①原代培养小型猪胸主动脉平滑肌细胞,体外合成转录因子NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸,将细胞分为6组:正常对照组、NF-κB decoy寡核苷酸组、E2F decoy寡核苷酸组、NF-κB+E2F decoy寡核苷酸组、NF-κB错配寡核苷酸组、E2F错配寡核苷酸组,以脂质体为载体转染细胞、采用激光扫描共聚焦显微术观察FITC标记的寡核苷酸细胞内定位情况.②各组细胞经同步化处理后,予体积分数为0.1的胎牛血清刺激,采用四甲基偶氮唑盐法检测NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸对细胞增殖的抑制作用.③免疫印迹法检测增殖细胞核抗原表达水平.④流式细胞仪碘化丙啶法及磷脂结合蛋白V法分析细胞周期及细胞凋亡情况.结果:①FITC标记的寡核苷酸主要聚集于细胞核内,转染效率为(46.67±5.77)%.②体积分数为0.1的胎牛血清刺激24 h后,NF-κB decoy寡核苷酸组、E2F decoy寡核苷酸组和NF-κB+E2F decoy寡核苷酸组均可明显抑制细胞增殖[(34.96±6.35)%,(38.75±0.14)%,(49.60±5.07)%],并且decoy寡核苷酸组抑制作用普遍强于错配寡核苷酸组,联合应用组作用强于单独应用组(P＜0.01).胎牛血清刺激48 h后NF-κB decoy寡核苷酸组和NF-κB+E2F decoy寡核苷酸组仍可明显抑制细胞增殖[(36.35±5.24)%,(42.60±4.21%)],但E2F decoy寡核苷酸组增殖反而超过正常对照组[(-24.22±9.68)%](P＜0.01).③胎牛血清刺激24 h后NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸单独或联合应用组均可降低增殖细胞核抗原的表达.④decoy寡核苷酸使停滞在DNA合成前期的细胞百分数增加,早期凋亡增加.结论:在原代培养的猪的血管平滑肌细胞,NF-κB decoy寡核苷酸和E2F decoy寡核苷酸单独或联合应用可以抑制细胞增殖,但E2F decoy寡核苷酸单独应用只能短期抑制细胞增殖,decoy寡核苷酸抑制作用主要是通过阻碍细胞周期进程、促进细胞凋亡实现的.

构建工作型大鼠异位心脏模型的实验

目的:建立工作型大鼠腹部异位心脏移植模型,探讨模型建立手术并发症的原因及预防措施,为进一步研究心脏移植奠定基础.方法:实验于2004-07/2005-01在解放军南京军区南京总医院动物实验科完成.供心完全停跳后,下腔和上腔静脉分别结扎离断,切断主、肺动脉,切开左心耳,供心肺动脉与左房端侧吻合,钝性游离出腹主动脉和下腔静脉并阻断,供心主动脉与受体腹主动脉连续缝合,左室血液经供心主动脉吻合口进入受体腹主动脉,从而模型的左右心室均有输出功能,进行预实验96只,正式实验20只. 结果:116只SD大鼠纳入结果分析.①预实验96只和正式实验20只手术成功率分别为56%和90%.预实验中并发症的发生率为43.8%,主要并发症包括麻醉意外、吻合口出血及狭窄、截瘫、供心保护不良、休克、内环境紊乱、术后早期供心失活.正式实验中并发症的发生率为10%.②吸氧状态下,吻合口前后的氧分压分别为(20.4±1.9),(11.2±1.3)kPa,差异极显著(P＜0.01);未吸氧状态下吻合口前后的氧分压分别为(9.9±1.2),(6.7±1.2)kPa,差异极显著(P＜0.01),吸氧后吻合口前氧分压较未吸氧明显升高(P＜0.01). 结论:针对手术相关并发症的发生原因进行预防、处理,可使工作型大鼠腹部异位心脏移植模型达到稳定的高成功率.

神经生长因子对胎兔许旺细胞培养的影响

目的:应用神经生长因子培养胎兔许旺细胞,观察许旺细胞生长的情况.方法:实验于2002-02/2004-05在河北医科大学第三临床医学院中心实验室和细胞培养室完成.怀孕28 d的新西兰白兔,剖腹取出胎兔,取胎兔坐骨神经,剥干净外膜,用植块加差速贴壁联合法培养胎兔许旺细胞,纯化传代后的胎兔许旺细胞分成2组培养,一组加含神经生长因子的培养液,即实验组,另一组加常规培养液,即对照组.细胞传代后24 h在每个培养皿中随机选取3个视野,开始初次细胞计数,以后在统一视野每天进行许旺细胞计数.增殖指数=各次观察细胞数/初次观察细胞数.结果:实验用剖腹取出胎兔8只,坐骨神经16根.60个观察视野,均进入结果分析.①在第6天见细胞从胎兔神经组织块周围爬出.②第8天细胞沿组织块向外生长,可见大量梭形的胎兔许旺细胞;第14天植块周围细胞长势好.③有两种细胞,一种为细胞形态梭形,有突起,多为双极,偶尔可见3个细长突起,胞核呈椭圆形,胞体周围有光晕,即生长晕,为许旺细胞.偶尔可见另一种细胞,胞体大,呈扁平状,外形不规则,突起短而多,细胞核较浅,核仁明显,有2～3个核仁,为成纤维细胞.④根据许旺细胞特有的特征性形态以及细胞免疫组化染色可证实为许旺细胞.⑤实验组许旺细胞的分裂增殖速度明显比对照组加快[传代培养后第3天:(1.41±0.12),(1.05±0.10);第4天:(1.85±0.26),(1.21±0.22);第5天:(2.36±0.43),(1.23±0.32);第6天:(3.52±0.11),(1.94±0.33);第7天:(6.25±0.38),(3.14±0.27),P＜0.001].结论:用神经生长因子可促进胎兔许旺细胞生长分裂,能够获得大量的胎兔许旺细胞,满足组织工程对许旺细胞的需求;此外胎兔许旺细胞作为组织工程的种子细胞也可以减轻免疫排斥反应的发生.

人工心脏辅助装置硬段相改性新型聚氨酯材料的血液相容性

目的:应用硬段相改性的新型聚氨酯材料建立犬心脏辅助转流模型,观察这种用于制造人工心脏辅助装置的新型材料与血液的相容性.方法:实验于2002-03/2004-12在西京医院完成.选取杂种成年犬12只,随机分为硬段相改性新型聚氨酯材料组和未改性医用聚氨酯材料组,6只/组.①两组动物采用戊巴比妥钠肌肉注射麻醉后,气管插管呼吸机辅助呼吸,股静脉置管测中心静脉压及输液,股动脉插入动脉测压管并接生理监护仪有创压换能器,四肢连接监护仪心电标准肢体导联电极.②犬仰卧位,正中切口开胸,悬吊心包,肝素化后于升主动脉插入人工辅助装置血泵主动脉供血管,于左心耳插入引流管,分别连接血泵出入口.为防止出现心律失常,给予利多卡因100 mg静推,以自行研制的动力装置给予辅助装置动力支持.③硬段相改性新型聚氨酯材料组选用材料硬度90A的硬段相改性医用聚氨酯,未改性医用聚氨酯材料组选用未改性的医用聚氨酯材料建立犬心脏辅助转流模型,分别测定两组材料表面对血小板的黏附情况.④于左心辅助转流开始后0,1,4,12,24,48,72 h检测两组动物游离血红蛋白含量的变化以及纤维蛋白原、白蛋白的吸附情况.结果:实验选取杂种成年犬12只,全部进入结果分析.①两组血小板黏附情况:与未改性医用聚氨酯材料组比较,硬段相改性新型聚氨酯材料组表面血小板黏附数量明显减少[(12.5±2.7),(5.2±1.2)/视野,P＜0.01].②两组左心辅助转流后不同时间点游离血红蛋白含量的变化:左心辅助转流4 h前两组材料对血液破坏程度均较轻,组间比较基本相似(P＞0.05).4 h后未改性医用聚氨酯材料组游离血红蛋白含量明显升高,而硬段相改性新型聚氨酯材料组游离血红蛋白含量上升趋势缓慢(P＜0.05).③两组左心辅助转流后不同时间点吸附纤维蛋白原吸光度值的比较:两组材料随转流时间的延长,对纤维蛋白原的吸附含量均逐渐增加,但硬段相改性新型聚氨酯材料组在左心辅助转流后各时间点吸附纤维蛋白原均低于未改性医用聚氨酯材料组(P＜0.05).④两组左心辅助转流后不同时间点吸附白蛋白吸光度值的比较:两组材料随转流时间的延长,对白蛋白的吸附含量均逐渐增加,但硬段相改性新型聚氨酯材料组在左心辅助转流后各时间点吸附白蛋白均高于未改性医用聚氨酯材料组(P＜0.05).结论:硬段相改性的新型医用聚氨酯材料比未改性的常见医用聚氨酯材料更具有良好的血液相容性,可作为人工心脏辅助装置的首选材料进一步推广应用.

周围神经组织工程载体去细胞神经基膜管的免疫原性研究

目的:为周围神经组织工程中载体的去细胞神经基膜管进行免疫学方面的半定量研究及其进一步的应用提供理论基础.方法:实验于2001-06/2003-03在蚌埠医学院附属医院中心实验室与蚌埠医学院病理学教研室进行并顺利完成.①将18只成年SD大鼠的左侧坐骨神经于坐骨大切迹下稍下方锐性切断其胫神经束,近端结扎,远端任其自由变性.②术后2周,再次手术,切取大鼠左侧远段预变性胫神经和右侧相同部位正常新鲜神经组织段,分别长约30 mm.③将预变性和新鲜的神经组织段分别放入相同浓度(5 g/L)的十二烷基磺酸钠溶液中进行化学萃取处理,分别得到一种没有细胞及细胞碎片的、空的神经基膜管,即预变性的去细胞神经基膜管和未预变性的去细胞神经基膜管.④分别就预变性神经组、新鲜神经组、预变性去细胞神经基膜管组和未预变性去细胞神经基膜管组进行一般观察、HE染色、锇酸染色、经层粘连蛋白和主要组织相容性复合体抗原Ⅱ标记的免疫组织化学观察、计算机图像和透射电镜等方法分析.结果:①经过十二烷基磺酸钠萃取的预变性和未预变性神经组织,均基本能够彻底地去除细胞、髓鞘、轴突及其碎片,成为中空的、基底膜结构较完整去细胞基膜管.②经过十二烷基磺酸钠萃取的预变性和未预变性神经组织保留有大量的层粘连蛋白,前者阳性率变化均值为25.8±2.9,后者为13.9±1.8,二者统计学差异具有显著性(P＜0.05),其中前者具有优越性.③经过十二烷基磺酸钠萃取的预变性和未预变性神经组织中的主要组织相容性复合体抗原Ⅱ的阳性率极低,同萃取前相比,统计学差异具有显著性(P＜0.01).结论:经过化学萃取后的去细胞未预变性和预变性神经基膜管结构保留均较完整,免疫原性低,可作为组织工程中神经载体,其中预变性组更具有优越性.

海藻酸钙微球与海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹对不同种类细胞生长的影响

目的:观察海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹对不同特性细胞生长的影响.方法:实验于2004-04/2005-04在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学研究室完成.细胞:牛肾上腺嗜铬细胞、Swiss小鼠胚胎成纤维细胞株(3T3)、人早幼粒白血病细胞株.仪器和试剂:加拿大Sun氏静电微囊发生仪;体视显微镜;海藻酸钠,聚赖氨酸、氯化钙、柠檬酸钠.制备海藻酸钙微球和海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊,分别用其包裹3T3细胞、牛肾上腺嗜铬细胞及人早幼粒白血病细胞.按照细胞的不同及包裹材料的不同,分为裸细胞组、海藻酸钙微球组、海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊组.在光镜下观察体外培养的微球、微囊及细胞的形态、存活率、增殖率.细胞增殖率=培养后细胞数-培养前细胞数/培养前细胞数×100%.结果:光镜下见包裹后即刻海藻酸钙微球和海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊呈大小均一的半透明圆球,直径150～300 μm,表面光滑.培养24 h时,牛肾上腺嗜铬细胞、3T3或人早幼粒白血病细胞均呈单个细胞,均匀分散于微球或微囊内.培养120 h时,牛肾上腺嗜铬细胞、3T3和人早幼粒白血病细胞在海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内聚集成团块,而在海藻酸钙微球内仍呈单个细胞散在分布.①海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内高增殖活性的3T3或人早幼粒白血病细胞的存活率显著高于牛肾上腺嗜铬细胞(74.38±7.72,89.08±3.05,87.48±3.43,92.40±7 56,72.67±2.08,89.33±5.13,P＜0.01);海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内细胞存活率均显著高于海藻酸钙微球内同一种细胞的存活率(87.88±3.38,89.08±3.05,89.63±5.55,85.33±4.86,92.40±7.56,95.08±3.81,83.67±5.51,89.33±5.13,85.33±2.08,P＜0.01).②在不同状态下,培养72和120 h时,人早幼粒白血病细胞或3T3细胞的增殖率存在差异,海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内同种细胞的增殖率显著高于裸细胞组(2.54±0.65,5.20±2.38,2.30±0.70,2.26±0.83,3.89±1.89,13.37±16.14,P＜0.05);而在不同状态下牛肾上腺嗜铬细胞的增殖率差异无显著性(P＞0.05).③在相同状态下,培养72和120 h时,人早幼粒白血病细胞增殖率明显高于3T3或牛肾上腺嗜铬细胞(18.66±7.76,39.11±16.06,P＜0.01);而3T3与牛肾上腺嗜铬细胞的增殖率差异无显著性(P＞0.05).④对同一种细胞,培养24,72和120 h时,海藻酸钙微球与海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊相比,其细胞的增殖率差异均无显著性(P＞0.05).结论:在培养条件下,海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹似更利于该3种细胞的生长;海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹较海藻酸钙微球包裹更利于同种细胞的生长.

正常与一次性力竭运动小鼠骨骼肌基因表达谱差异的基因芯片检测

目的:利用基因芯片技术了解小鼠骨骼肌基因表达谱,以及一次性力竭运动后小鼠骨骼肌基因表达谱的变化.方法:实验于2005-04/2005-06在卫生部北京老年医学研究所完成.①实验小鼠6只分为两组,正常对照组和一次性力竭运动组各3只.②从实验小鼠的骨骼肌组织中抽提总RNA;纯化后合成双链cDNA;体外转录合成生物素标记的cRNA;cRNA纯化后片段化为300 bp左右的探针片断.③生物素标记的cRNA探针与涵盖了14 000个明晰基因的Affymetrix基因表达谱芯片Mouse Genome 430A 2.0杂交,分别检测正常对照组小鼠和一次性力竭运动组小鼠的骨骼肌基因表达谱.④利用生物信息学方法对检测结果进行分析.结果:6只实验小鼠进入结果分析.分别得到了正常对照组和一次性力竭运动组小鼠骨骼肌基因的表达谱,一次性力竭运动组与正常对照组相比,共筛选出差异表达基因189条,78条基因表达增加,111条基因表达降低.结论:利用基因芯片技术在阐明了小鼠骨骼肌基因表达谱的同时,提示运动性疲劳的产生涉及多个方面,为进一步研究运动性疲劳产生的机制提供了依据.

血管内皮生长因子在大鼠静脉窦血栓模型水肿脑组织中的表达与影像学评估指标的关系

目的:分析血管内皮生长因子在静脉窦血栓的血管源性水肿中的作用.方法:实验于2004-10/2005-5在解放军沈阳军区总医院放射诊断科完成.Wistar大鼠14只,随机选取7只结扎上矢状窦,定为实验组.另外7只不结扎上矢状窦,定为正常对照组.24 h后行大鼠脑组织磁共振检查弥散加权成像,计算表观弥散系数值.并将脑组织标本分别进行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色,观察血管内皮生长因子的表达,分析表观弥散系数值与血管内皮生长因子的关系.结果:血管内皮生长因子表达与血管源性水肿相关,在表观弥散系数图上表现为高信号[实验组血管源性水肿区域血管内皮生长因子免疫阳性细胞数为(21.00±2.23)个/高倍视野,表观弥散系数值(0.81±0.05)×10-3 mm2/s.正常对照组血管内皮生长因子免疫阳性细胞数为(3.34±1.05)个/高倍视野,表观弥散系数值(0.75±0.03)×10-3 mm2/s].结论:血管内皮生长因子表达在急性期静脉窦血栓的血管源性水肿脑组织中明显增强,并与影像学指标变化一致.

神经干细胞移植治疗脑卒中后遗症50例临床效果分析

目的:观察应用神经干细胞移植治疗改善脑卒中患者功能独立性的临床疗效.方法:选择2004-01/2005-06哈尔滨医科大学附属第二医院和北京武装警察部队总医院收治的脑卒中患者50例.男31例,女19例;平均55岁;末次发病至接受神经干细胞移植时间平均为3.4年.其中基底节病变39例,脑干病变3例,其他部位(丘脑、大脑半球)8例,累计多部位的病变6例.所有患者腰椎穿刺蛛网膜下腔植入神经干细胞,1次/周,共计3次.采用美国功能独立性评测评分对患者术前,术后6月进行评定.主要评价6个方面的能力:生活自理能力,括约肌控制能力,活动能力,行动能力,理解交流能力,社会认识能力.分值高表示功能独立性好.结果:50例患者全部进入结果分析.脑卒中患者干细胞移植后6个月功能独立性评分显著高于移植前(99.86±7.61,95.84±7.51,P＜0.01).结论:神经干细胞移植可以一定程度地改善脑卒中患者的后遗症,提高患者生活质量.

海马神经干细胞与胶原蛋白海绵及明胶海绵的生物相容性

背景:在应用组织工程修复周围神经的研究中,载体的选择至关重要.理想的载体应与细胞外基质类似,与活体细胞有良好的生物相容性.目的:评价豚鼠海马神经干细胞与胶原蛋白海绵和明胶海绵的生物相容性,探讨它们作为周围神经组织工程载体材料的可行性.设计:随机对照实验.单位:郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科,郑州大学基础医学院解剖教研室.材料:实验于2005-07/2005-12在郑州大学基础医学院解剖教研室神经生物学研究室完成.健康新生(＜24 h)杂色豚鼠12只,清洁级,雌雄不限,体质量50-70 g,由郑州大学医学院实验动物中心提供.方法:新生(＜24 h)豚鼠,10 g/L水合氯醛腹腔麻醉,体积分数为0.75乙醇消毒,无菌操作分离出海马组织.体外无血清培养海马神经干细胞,传至第2代,将浓度调整为1×1010 L-1后分别与胶原蛋白海绵、明胶海绵联合体外培养,一周后取材,进行细胞计数,倒置相差显微镜及扫描电镜观察,并测定两种材料与细胞的吸附率. 主要观察指标:①观察神经干细胞在胶原蛋白海绵和明胶海绵上的生长、黏附情况,并测定其细胞总数与载体材料的吸附率.②免疫细胞化学染色分化细胞形态观察.结果:①神经干细胞可以在胶原蛋白海绵和明胶海绵上生长,逐渐黏附,胶原蛋白海绵细胞吸附率高于明胶海绵(37.17%和14.87%,x2=4.819,P＜0.05).②对照组、胶原蛋白海绵组、明胶海绵组细胞总数差异无显著性[(53.17±3.5)×104,(53.25±2.6)×104,(52.04±4.05)×104,F=0.233,P＞0.05].结论:胶原蛋白及明胶两种材料,尤其是胶原蛋白,具有良好的神经干细胞相容性,可以作为周围神经组织工程的支架材料应用于临床.

骨髓干细胞移植对正常和心肌梗死大鼠心电图的影响

目的:观察骨髓干细胞移植对正常和心肌梗死大鼠心电图的影响及其治疗作用.方法:实验于2003-03/2004-03在哈尔滨医科大学附属第一医院动物研究室完成.取自哈尔滨医科大学附属第一医院饲养的Wister大鼠作为实验对象,体质量(50±10)g幼鼠20只做为干细胞的来源,将体质量(300±50)g Wister雄性大鼠80只作为细胞移植的受体,并将其随机分成4组,每组20只.①正常对照组:用1 mL注射器取200 μL细胞培养液基质移入到正常心肌组织中.②心肌梗死对照组:取200 μL细胞培养液基质移入到心肌梗死大鼠瘢痕组织中.③正常移植组:在正常心肌组织中移入200 μL干细胞悬液.④心梗移植组:在心肌梗死后瘢痕组织中移入干细胞悬液.通过结扎左冠状动脉3周形成心肌瘢痕模型.观察骨髓干细胞移植前、移植后即刻和饲养4周的心电图变化.结果:80只实验大鼠中,在心肌梗死模型制作和细胞移植过程中死亡39只,终进入结果分析大鼠41只,其中心肌梗死对照组7只,心肌梗死移植组8只,正常对照组和正常移植组各13只.①幼鼠骨髓干细胞经体外培养、5-溴脱氧尿核苷标记和5-氮杂胞嘧啶核苷诱导能形成幼稚的心肌样细胞.将其移植到大鼠正常心肌组织和心肌梗死后的瘢痕心肌组织中4周后发现不同心脏组织环境中能生存增殖良好,替代坏死心肌.②正常对照组大鼠心电图显示Ⅱ,Ⅲ,avF主波向上,avR主波向下,心率为(300±50)次/min.心肌梗死对照组QRS波增宽,ST段抬高,可出现各种心律失常.正常移植组和心肌梗死移植组大鼠均表现为心律不稳,ST段下移或抬高等一过性缺血或损伤性改变;细胞移植后4周,正常移植组和心梗移植组大鼠均未见有害的心律失常出现,而且,心肌梗死移植组大鼠与心肌梗死对照组(或移植前)相比QRS波变窄,R波相对升高,ST段回到基线.结论:骨髓干细胞移植到心肌梗死后瘢痕心肌组织后,能使心肌梗死大鼠心电图有所改善.移植手术仅产生一过性心肌损害.

自体骨髓间质干细胞移植治疗急性心肌梗死

目的:将大体动物自体骨髓间质干细胞移植至心肌梗死后的心肌瘢痕组织中,观察细胞在梗死区的存活以及对心功能的改善情况.方法:实验于2003-04/2004-03在徐州医学院第二附属医院介入导管室完成.①选择21只中国小型家猪,三四个月龄,体质量30～40 kg.随机分为实验组11只和对照组10只,应用闭胸经股动脉介入的方法制作动物心肌梗死模型.②10余天后实验组将培养的自体骨髓干细胞移植于梗死区,对照组在梗死区植入营养液.③8周后,以心脏彩超及放射性核素心肌扫描观察梗死心肌的恢复及心功能的变化.④后行组织学分析.结果:①21只家猪,实验过程中死亡3只,1只建模未成功,进入结果分析实验组9只,对照组8只.②心脏彩超显示实验组移植后左室射血分数较移植前增加[(42.07±2.06)%,(47.00±2.36)%,P＜0.05].③99Tcm-MIBI显示实验组梗死面积比移植前缩小[(34±12)%,(21±10)%].④实验组微血管密度较对照组显著增加(8.32±1.26)个/0.2mm2,(4.61±1.32)个/0.2mm2,P＜0.05].结论:自体骨髓间质干细胞移植至梗死区后,可使梗死面积缩小,心脏功能改善.

联合神经生长因子诱导小鼠胎肝间充质干细胞向神经外胚层分化

目的:观察小鼠胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子的作用下向神经细胞分化的能力.方法:实验于2004-03/09在暨南大学血液病研究所完成.健康BABL/c小鼠按雌雄2:1的比例合笼过夜,第2天分开并检查.以见到阴栓为怀孕的标准,计为孕0.5 d.分离孕13.5 d BABL/C胎鼠肝脏,贴壁法收获胎肝间充质干细胞.用以下方案进行诱导:碱性成纤维生长因子(10 μg/L)4 d;碱性成纤维生长因子(10 μg/L)和成纤维生长因子8(10μg/L)4 d;碱性成纤维生长因子(10μg/L)、脑源性神经营养因子(10μg/L)以及2%的B27 4 d.观察诱导细胞的形态学变化.于诱导0,4,12 d收获细胞,反转录聚合酶链反应检测神经特异性基因表达;免疫细胞染色检测神经特异性蛋白的表达.以上实验均重复3次.结果:①形态学变化:经贴壁法分离的胎肝间充质干细胞呈均质梭形.碱性成纤维生长因子诱导3 d,胎肝间充质干细胞开始变圆并聚集,呈神经干细胞样形态.经成纤维生长因子8和脑源性神经营养因子的进-步诱导后,大部分细胞呈现典型的神经元样细胞形态,极少数细胞呈星形胶质细胞样形态.②胎肝间充质干细胞经过神经生长因子的顺序诱导后,表达神经特异性基因:未诱导的胎肝间充质干细胞巢蛋白(nestin神经干细胞特异性)、低分子量神经丝蛋白(神经元特异性)、胶质纤维酸性蛋白基因(星形胶质细胞特异性)表达与看家基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的比值分别为(0.06±0.02),0,0;诱导4 d分别为(0.59±0.11),(0.46±0.23),(0.20±0.96);诱导12 d分别为(0.21±0.07),(0.85±0.31),(0.13±0.10).每种基因在不同诱导时间的表达具有统计学差异(P＜0.01).③经过神经生长因子的顺序诱导,胎肝间充质干细胞表达神经特异性蛋白:未诱导的细胞不表达巢蛋白(神经干细胞特异性)、微管蛋白Tubulin(神经元特异性)以及胶质纤维酸性蛋白(星形胶质细胞特异性);诱导4 d,圆形细胞及细胞团nestin染色阳性,Tubulin阳性细胞为(62.3±3.5)%,仅有(6.0±1.6)%的细胞显示胶质纤维酸性蛋白阳性;诱导12 d,巢蛋白阳性细胞开始减少,Tubulin阳性细胞达(90.3±1.5)%;胶质纤维酸性蛋白阳性细胞为(4.7±1.5)%.诱导12 d的细胞微管蛋白Tubulin阳性表达率与诱导4 d的细胞相比有统计学差异;而诱导12 d的细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达率与诱导4 d的细胞相比没有统计学差异.结论:胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子提供的信号作用下可以分化为神经元样细胞,诱导结束后,细胞表现为典型的神经元形态并表达神经元特异性蛋白Tubulin.

贴壁法体外培养大鼠骨髓间质干细胞的生物学特点

目的:观察大鼠骨髓间质干细胞在体外的提取、分离、培养和传代的特征,为进一步的研究工作提供实验基础.方法:实验于2004-06/12在上海第二医科大学附属仁济医院神经病学实验室完成.选取幼年雄性SD大鼠,处死后分离骨髓,采用贴壁法在体外培养、传代、扩增、纯化其骨髓间质干细胞,分别观察原代和传代后第2,4,6,8代的细胞生长情况,并绘制生长曲线和贴壁率曲线.生长曲线:以平均每孔的细胞数(千个)为纵坐标,天数(d)为横坐标;贴壁率曲线:以贴壁率(%)为纵坐标,时间(h)为横坐标.贴壁率又称接种存活率:贴壁率(%)=贴壁细胞数/接种的细胞总数×100%.结果:①骨髓细胞刚接种时呈圆型,24 h后可见细胞贴壁,贴壁细胞以单核细胞为主,在72 h后逐渐转变为多种形态的细胞.②大鼠骨髓间质干细胞原代细胞第1周生长速度较慢,贴壁时间长,而1周后生长加快;生长曲线及贴壁率曲线显示,传代后7代以内细胞生长速度、贴壁率基本相同;而第8代以后生长速度明显变慢,贴壁率也下降.结论:骨髓间质干细胞有一定的增殖能力,但其增殖不是无限的,为进一步了解和掌握骨髓间质干细胞的生物学特性和研究应用打下基础.

脐带血树突状细胞的体外诱导及其特征鉴定

目的:探讨在体外无需预先分离CD34+造血祖细胞即可有效诱导脐带血单个核细胞而获得脐带血树突状细胞的方法,并对人脐带血树突状细胞的生物学功能进行鉴定.方法:实验于2003-12/2004-10在吉林省肿瘤防治研究所完成.健康孕妇正常胎儿脐带血由吉林省妇幼保健院提供,孕妇签署知情同意书.无菌采集健康孕妇正常胎儿脐带血50 mL左右,肝素抗凝.生理盐水稀释后加入甲基纤维素使终浓度为1 g/L,室温沉降45 min,取上层富含细胞的血浆层,1 500 r/min离心10 min,弃上清,沉淀加两倍体积的生理盐水稀释,以1:1体积叠加于淋巴细胞分层液上,分离出脐带血中的单个核细胞,体外培养24 h后去除悬浮细胞,加入粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素4联合刺激脐带血单个核细胞分化为脐带血树突状细胞.在光镜和透射电镜下观察培养的脐带血树突状细胞的形态学特征.碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联法测量脐带血树突状细胞表面分子CD1α、人类白细胞抗原-DR的表达水平.四甲基偶氮唑蓝法测定不同细胞密度的树突状细胞刺激同种T淋巴细胞增殖的能力.结果:①不同诱导时间体外培养的脐带血树突状细胞形态学观察:倒置显微镜下,淋巴细胞经细胞因子诱导后第3 d聚集成均匀散布的细胞聚体,部分细胞变形,胞体拉长;第7 d可见不明显突起,细胞形态不规则,呈疏松贴壁生长或悬浮生长;14 d集落样生长,具有典型的树突状细胞形态.透射电镜下可见树突状细胞呈不规则形,细胞表面粗糙,突起明显;细胞核呈肾形或马蹄形,核浆比增大;胞浆中富含线粒体,较少溶酶体.②细胞因子诱导前后脐血淋巴细胞表型的变化:诱导前脐带血淋巴细胞表面不表达CD1α,诱导后CD1α的表达上升为(22.00±4.36)%;人类白细胞抗原-DR由诱导前的(3.67±2.08)%表达上升为(61.67±7.02)%.③脐带血树突状细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响:脐带血树突状细胞具有明显刺激同种T淋巴细胞增殖的功能,且其数量的不同对T淋巴细胞的刺激能力亦不同.脐带血树突状细胞与淋巴细胞比值为1:10时平均刺激指数为3.95,比值为1:100时平均刺激指数为2.16.结论:采取粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素-4联合刺激可成功诱导出形态典型、纯度较高的脐带血树突状细胞,且体外培养后具有明显的刺激同种T淋巴细胞增殖的能力.

自体骨髓单个核细胞心肌移植对猪慢性缺血心肌心功能的影响

目的:探讨自体骨髓单个核细胞心肌移植对猪慢性缺血心肌心功能的改善作用.方法:实验于2005-01/2005-10在香港大学动物实验中心进行.①取健康巴马小型猪17只,开胸后在左回旋支起始部放置Ameroid环.②将存活的16只巴马小型猪随机分成2组,自体骨髓单个核细胞移植组9只,对照组7只.术后4周在C型臂X射线机的引导下心肌定位注射导管进入左心室,移植组猪于心肌缺血部位注射自体骨髓单个核细胞,将细胞总数为1.5×108的细胞悬液1.5 mL进行15个点的注射,每个点注射0.10 mL.对照组按照同样的方法注射相同数量的生理盐水.③移植后4周进行心脏超声检查,检测心脏功能.结果:17只猪中1只因肺部感染于术后21 d死亡,其余16只均进入结果分析.①猪第1次手术后1月左右冠状动脉造影显示左冠状动脉回旋支均闭塞,左前降支通畅.②心脏M型超声检查显示移植组左室侧后壁运动较对照组明显增强,二维超声心动图检查显示移植组较对照组室壁明显增厚、运动度增强.移植组较对照组的心功能有明显改善.结论:自体骨髓单个核细胞心肌移植可改善慢性缺血心肌的心功能,可用于缺血性心脏病的治疗.

胰岛干细胞和脐血间充质干细胞体外分离培养的形态学特征观察

背景:干细胞是具有自我更新能力和高度增殖能力和多种分化潜能的较原始细胞,在一定的条件下,干细胞可以分化成机体内的多种功能细胞.胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以治疗相应系统的疾病,但是目前有关这两类干细胞的培养仍有困难.目的:探讨胰岛干细胞和脐血间充质干细胞分离和培养的方法,并观察在培养过程中两类干细胞的形态学变化.设计:完全随机分组设计,重复测量实验.单位:郑州大学医学院生理学教研室干细胞研究中心材料:实验于2004-04/2005-01在郑州大学医学院干细胞中心完成.选用鼠龄1～3 d新生SD大鼠10～15只进行胰岛干细胞培养,采集年龄24～35岁的足月妊娠健康产妇(经过产妇知情同意)新鲜脐带血进行脐血间充质细胞的培养.方法:取新生SD大鼠,无菌条件下剖腹取胰,眼科剪反复剪切后V型胶原酶消化分离胰岛.连续转瓶法纯化胰岛.取新鲜采集脐带血,用1.077 g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞.将胰岛细胞和脐血单个核细胞接种于37℃,体积分数0.05 CO2培养箱内培养.于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况.主要观察指标:胰岛干细胞和脐血间充质干细胞的分离培养方法以及在细胞生长过程中的形态学变化.结果:①培养中可见梭形胰岛祖细胞贴壁呈极性生长,并且不断增殖,约12～14 d长满瓶底,可连续多次传代.撤去生长因子和血清后有圆形细胞团开始形成.②从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,瑞士染色显示这些细胞大多数为粒系的集落,7 d后出现贴壁的扁平状的上皮样细胞和长梭形的成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂.随着培养时间的延长,细胞数目不断增加.结论:胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以在体外分离和培养,用于进一步相关实验工作.

慢性压迫性脊髓损伤后神经前体细胞的增殖

背景:关于成年哺乳类动物脊髓损伤后神经前体细胞的增殖特征和来源以及星形胶质细胞在其中的作用尚无肯定性结论.目的:通过分析成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤及减压后巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达的变化,探讨神经前体细胞的增殖特征和来源以及星形胶质细胞在其中的作用.设计:完全随机对照实验.单位:兰州大学第二医院骨科研究所.材料:实验于2003-03/10在兰州大学第二医院骨科研究所完成,选择成年健康Wistar大鼠50只.随机分为正常对照组、慢性压迫性脊髓损伤中度组(压迫物占椎管矢状径的40%)、重度组(压迫物占椎管矢状径的60%)及重度压迫损伤24 h后减压3 d、10 d组,每组10只.主要观察指标:①各组大鼠压迫临近段(距压迫边缘至5 mm)脊髓灰质和白质内nestin的阳性表达并测量其灰度值.②各组大鼠脊髓内胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:50只大鼠均进入实验分析.①中度压迫组(白质235.33±6.48,灰质196.28±6.55)、重度压迫组(白质190.45±4.91,灰质173.15±5.98)及重度压迫损伤减压后3 d组(白质198.39±3.24,灰质180.38±4.51)和减压后10 d组白质(202.55±3.54)中巢蛋白均有明显表达(P＜0.05),以重度压迫组为显著(P＜0.01).减压10 d组的灰质和脊髓中央管室管膜细胞的巢蛋白表达与正常对照组相比,差异无显著性意义(P＞0.05).②与正常对照组相比,各损伤组脊髓内胶质纤维酸性蛋白表达增强,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数目增多、胞体肥大,突起增粗、增长.结论:成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤及减压后早期存在神经前体细胞的增殖.星形胶质细胞参与神经前体细胞的增殖与迁移,对脊髓具有重要的营养修复作用.

胰酶消化后新生鼠成肌细胞生长方式与规律以及模拟转基因电穿刺激对冻存和复苏细胞的损害

目的:采用原代培养技术进行大鼠原代细胞的培养与增殖,并模拟基因转染中的电穿刺激,探讨大鼠成肌细胞在基因转染技术中可能的应用前景.方法:实验于2000-04/10在四川大学华西医院病理实验室完成.①选取SD新生鼠10只,消毒后切开皮肤,分离大腿肌肉,高浓度磷酸盐缓冲液浸泡,5 min后剪碎组织块至1 mm3以下,加入胰酶使用液,37℃水浴消化,胎牛血清终止消化过程,弃上清.再加入生长培养基重悬细胞,置于CO2孵箱中进行接种.②弃去培养基,重新加入等量生长培养基,3～5 d更换1次.显微镜下细胞若出现间隙或变圆即中止消化.细胞计数后按所需密度接种于培养瓶,1:2或1:3传代.③细胞的冻存与复苏:冻存液的配制比为二甲基亚砜:胎牛血清:Dulbecco改良的Eagle培养基=1:4:5.消化细胞后离心去上清,将沉淀细胞移至冻存管内,加入冻存液,-80℃过夜,第2天取出后先行液氮保存,后迅速投入37℃水浴中振荡,使其1 min内完全溶解.收获进入对数生长期的细胞,15×106个/次,加入一次性电转杯内.电压0.3 KV,电场强度0.5 KV/cm,电容950μF,电阻250Ω条件下电击24ms.结果:①胰酶消化后新生鼠成肌细胞的生长方式:成肌细胞呈圆形,悬浮于培养液中,大约两三天开始贴壁生长,五六天后细胞几乎全部贴壁.②新生鼠成肌细胞的生长规律:胰酶消化五六天后,成肌细胞进入对数生长期,增殖明显加快,细胞间隙变窄,呈极性生长现象,数量可达1×106个/mL.传代培养可至20代以上,生长速度明显减缓.③模拟转基因电穿孔条件下对冻存和复苏细胞的损害:电穿孔后出现大量细胞碎片,约有一半左右细胞在一两天内死亡,10～14 d后残留细胞开始增殖,贴壁生长.结论:以原代培养技术培养、冻存成肌细胞并模拟电穿孔刺激,大鼠成肌细胞的培养效率高、细胞胞膜稳定且存活周期长,提示成肌细胞是一种较理想的基因转染包装细胞.

嗅鞘细胞移植治疗陈旧性脊髓损伤48例

背景:通过改变脊髓损伤局部环境的方法,能够促使损伤的神经修复、再生和恢复脊髓部分神经功能.嗅鞘细胞移植能够改善脊髓损伤的局部内环境.目的:探讨嗅鞘细胞移植治疗对陈旧性脊髓损伤患者脊髓及神经功能修复的作用及安全性.设计:自身对照实验.单位:山东省泰安荣军医院外科病房.对象:纳入山东省荣军医院外科2004-06/2005-07收住院的陈旧性脊髓损伤患者48例.男39例,女9例;年龄7～59岁,平均36岁.方法:①细胞培养:取流产胎儿的嗅球消化成单个嗅鞘细胞,培养纯化1～2周,后制成单细胞混悬液.②手术及细胞移植:在全麻下进行,将纯化好的嗅鞘细胞的单细胞悬液(约0.05～0.20 mL)用自制的直经0.45 mm的注射器分多点注射于相应脊髓损伤处,术后10～14 d伤口拆线.③脊髓功能评定:术前1 d及术后2周～2个月,采用美国脊髓损伤学会制订的脊髓损伤学会评分标准进行评分对比,并进行统计学处理.④术后3周～1年观察或电话随访48例患者脊髓功能情况.主要观察指标:①患者术后感觉功能变化.②患者术后运动功能的变化.③患者术后植物神经功能的变化.结果:①48例患者中均有脊髓功能的改善,且在术后3周～1年的观察或电话随访中仍呈继续改善的趋势.②感觉功能脊髓损伤学会评分术后高于术前(触觉:56.9,51.2,P＜0.01;痛觉:55.2,48.3,P＜0.01),感觉功能改善以感觉平面下移明显,一般在两个节段以上.③运动功能脊髓损伤学会评分术后高于术前(44.8,40.7,P＜0.01),运动功能改善出现较慢.④植物神经功能脊髓损伤学会评分术后高于术前(18.0,14.5,P＜0.01),植物神经功能改善如:出汗、肠蠕动增加出现早.结论:嗅鞘细胞移植对脊髓损伤晚期患者的脊髓及神经功能的恢复有促进作用,治疗方法安全.

人表皮角质形成细胞桥粒芯糖蛋白4胞外区域基因片段的克隆

目的:扩增人表皮角质形成细胞桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1,EC2,EC3和EC4的核酸序列.方法:实验于2004-11/2005-09在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成.通过反转录聚合酶链反应法从人正常皮肤组织表皮角质形成细胞中抽提RNA,反转录合成cDNA,聚合酶链反应扩增表皮角质形成细胞桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1,EC2,EC3和EC4目的基因;应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET32a在T4DNA连接酶作用下相连接,转化E.coli DH5a感受态细菌,用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子DNA序列测定鉴定.结果:反转录聚合酶链反应法扩增产物经凝胶电泳得到均约为350 bp的4条条带;质粒载体pET32a连接的目的基因经序列测定后与在Genbank登录的桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1,EC2,EC3和EC4核酸序列完全一致,4个桥粒芯糖蛋白4胞外区域cDNA读码框架正确.结论:成功克隆得到的桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1,EC2,EC3和EC4多肽片断.

慢性髓细胞性白血病患者与健康人骨髓单个核细胞基因表达的差异

背景:慢性髓细胞性白血病是以造血干细胞的恶性克隆性增殖为特征.慢性期的慢性髓细胞性白血病患者如果不予以有效的治疗,必然演进为急变期,其预后往往非常差.因而,从全基因组水平上阐明慢性髓细胞性白血病的发生机制显得尤为重要,目的:应用Applied Biosystems表达芯片系统对慢性髓细胞性白血病患者骨髓单个核细胞的基因表达谱进行观察.设计:观察对比分析.单位:南方医科大学基因工程研究所.对象:两例骨髓样品(1例慢性髓细胞性白血病患者,1例健康者)来自于广州军区广州总医院血液科. 方法:实验于2004-10/2005-09在南方医科大学基因工程研究所完成.分别从一例慢性髓细胞性白血病患者与一例健康人的骨髓样品中分离单个核细胞,提取总RNA,纯化mRNA.通过逆转录体外线性扩增的方法对mRNA样品进行标记,将标记好的cRNA样品与芯片杂交.利用ABI 1700化学发光芯片分析仪对骨髓单个核细胞的基因表达谱差异情况进行分析.通过比较同一样品不同芯片间的数据信息,对芯片结果的可重复性进行评估.主要观察指标:①总RNA及标记后的cRNA质量的评定.②芯片可重复性验证.③芯片杂交结果.④半定量反转录-聚合酶链反应结果.结果:①利用统计学数据分析工具,通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达差异,总共发现了6 706个差异基因.其中,与慢性髓细胞性白血病密切相关的差异基因为68个,上调的有17个,下调的有51个.②位于C/EBPalpha信号通路和CD40受体信号通路中的大部分差异表达基因,其表达水平降低.③通过对重复实验结果的相关性及检测一致性分析,证实了芯片结果的可重复性较好.而两组重复实验间的相关系数分别是,慢性髓细胞性白血病组为0.991,健康组为0.988.④半定量反转录-聚合酶链反应验证了芯片分析结果的可靠性.结论:通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达谱的差异,发现了大量的差异表达基因.这些数据将为寻找可用于慢性髓细胞性白血病患者疾病治疗的分子靶标提供有用的信息.

胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤影响功能恢复的因素

目的:探讨胚胎嗅鞘细胞移植晚期脊髓损伤患者后,影响其功能恢复的因素.方法:①取胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后培养12～17 d待用.②选择2001-11/2004-01首都医科大学附属北京朝阳医院和北京西山医院收治的脊髓损伤、志愿接受胚胎嗅鞘细胞移植的患者300例,其中完全性损伤222例,不完全性损伤78例.病程0.5～31年,平均3.1年.将胚胎嗅鞘细胞移植到脊髓损伤部位的上下处.③所有患者在胚胎嗅鞘细胞移植手术前和手术后2～8周按ASIA标准评价和随访,比较年龄、受伤时间、性别、损伤程度和损伤水平对胚胎嗅鞘细胞移植后功能恢复的影响.结果:①按ASIA标准评价神经功能有部分功能快速恢复,其中运动功能由术前(39.1±20.6)分提高到(45.9±20.3)分(P＜0.001),轻触觉由术前(51.7±24.9)分提高到(63.4±23.0)分(P＜0.001),痛觉由术前(53.0±24.2)分提高到(65.3±22.7)分(P＜0.001).②手术前ASIA级别为A级者222例,术后38例改善为B级,46例为C级.③除损伤水平中颈段运动和轻触觉分数高于胸段外,年龄、受伤时间、性别、损伤程度和损伤水平等因素比较没有显著性差异.结论:胚胎嗅鞘细胞移植能快速帮助晚期脊髓损伤患者恢复部分神经功能,但除损伤水平中颈段运动和轻触觉分数高于胸段外,年龄、受伤时间、性别、损伤程度和损伤水平并不是影响胚胎嗅鞘细胞移植后功能恢复的因素.

白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合对骨髓源性神经干细胞体外诱导分化的影响

目的:比较白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合条件下骨髓基质细胞分化情况,探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件.方法:2005-03/09在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所进行.①实验分组:实验分为空白对照组;胶质细胞源神经营养因子+白细胞介素1α组,后者又分为10 μg/L+100 ng/L,10 μg/L+200 ng/L,20 μg/L+100 ng/L,20 μg/L+200 ng/L,1 000 μg/L+100 ng/L组.②细胞模型制作:用全骨髓法培养骨髓基质细胞.③骨髓基质细胞以5×108L-1接种,悬浮于本实验室配制的神经干细胞培养基中.空白对照组:血清终浓度为体积分数为0.1的胎牛血清.细胞接种48 h后,胶质细胞源神经营养因子+白细胞介素1α各组分别加入相应质量浓度的胶质细胞源神经营养因子+白细胞介素1α.④应用Olympus光学显微镜观察细胞抗-神经巢蛋白和D2受体阳性染色阳性细胞数目计数.结果:①加入胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α增殖培养48 h可见细胞分裂相.②诱导6 d,部分细胞有神经巢蛋白成分表达.③3周测出DA受体D2检测阳性,胶质细胞源神经营养因子+白细胞介素1α10μg/L+100 ng/L组细胞诱导分化率显著高于10 μg/L+200 ng/L,20μg/L+100 ng/L,20 μg/L+200 ng/L,1 000 μg/L+100 ng/L组及空白对照组[依次为:(11.70±0.55)%,(3.62±0.78)%,(4.14±0.41)%,(3.3±0.63)%,(4.92±0.34)%,(1.61±0.68)%,P＜0.05或0.01].结论:骨髓基质细胞在体外培养条件下,经过胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α诱导分化作用,配合使用高浓度(体积分数为0.1)血清可获得巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元;10μg/L+100 ng/L为佳诱导分化质量浓度.

增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞诱导其向神经元样细胞分化的示踪标记观察

目的:建立携带示踪标记的人骨髓间充质干细胞,并将其向神经元样细胞定向诱导分化.方法:实验于2003-10/2005-01在郑州大学干细胞研究中心完成.用阳离子脂质体转染法将增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞中,然后用表皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合诱导法将其向神经元样细胞诱导分化,并用反转录聚合酶链反应法对诱导后的细胞进行鉴定.结果:①转染48 h后,在荧光显微镜下观察,对照组的人骨髓间充质干细胞不发荧光,而实验组的人骨髓间充质干细胞开始发荧光,经G418筛选后得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的人骨髓间充质干细胞.②转染后的人骨髓间充质干细胞经重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导后,较多细胞出现了典型的神经元样形态,经反转录聚合酶链反应法证明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白2和神经丝亚单位-M表达增强.结论:应用阳离子脂质体转染法将增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞中可获得稳定表达,转染后的人骨髓间充质干细胞,经表皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合诱导后可以向神经元样细胞定向分化.

胚胎脊髓干细胞移植联合甲基强的松龙修复脊髓损伤的实验效果

目的:大剂量甲基强的松龙治疗脊髓损伤已被临床广泛应用,探讨胚胎脊髓干细胞移植与大剂量甲基强的松龙联合应用治疗脊髓损伤的效果.方法:实验于2003-05/2004-02在大庆市第四医院骨科完成.选用SD大鼠50只,随机分为甲基强的松龙联合胚胎脊髓干细胞组、甲基强的松龙组、胚胎脊髓干细胞组、单纯损伤组、空白对照组,每组10只.将前4组制作成T12脊髓右半切损伤动物模型(麻醉后暴露T12脊髓,制成约3 mm×3 mm的脊髓半切损伤区),甲基强的松龙联合胚胎脊髓干细胞组及胚胎脊髓干细胞组移取14 d孕鼠一段长约3 mm纯净颈胸段胚胎干细胞,立即移植入刚完成的脊髓损伤的半切损伤处.8 h内,甲基强的松龙联合胚胎脊髓干细胞组、甲基强的松龙组两组动物自鼠尾静脉推注甲基强的松龙30 mg/kg,其后的23 h按同样方法应用甲基强的松龙5.4 mg/(kg·h).单纯损伤组损伤后未予治疗.空白对照组未进行干预.治疗后即开始观察实验动物的一般状态及运动功能改变,并于第8周从每组中选取6只大鼠,对其损伤区脊髓横断面神经纤维数进行统计学分析.结果:①甲基强的松龙联合胚胎脊髓干细胞组损伤区神经纤维计数多于甲基强的松龙组、胚胎脊髓干细胞组、单纯损伤组(25.4±3.1,0,11.6±1.1,0,P＜0.05).②除甲基强的松龙联合胚胎脊髓干细胞组、胚胎脊髓干细胞组有部分感觉功能恢复外,各组均无行为学改变.结论:大剂量甲基强的松龙与胚胎脊髓干细胞移植联合应用可协同促进损伤脊髓的修复.

褪黑素替代治疗对去松果体成年大鼠齿状回神经干细胞增殖及学习记忆的影响

目的:分析褪黑素替代治疗对去松果体成年大鼠神经干细胞增殖及学习记忆的影响.方法:实验于2004-06/2005-03在广西医科大学基础医学院解剖学教研室完成.将40只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为5组:假手术组、去松果体组、褪黑素20 μg/kg、200 μg/kg和2 mg/kg组.术后第2天开始进行干预,分别按20μg/kg、200 μg/kg和2 mg/kg剂量将褪黑素溶于0.5 mL的50 g/L乙醇-生理盐水,每天在固定时间(18:00)腹腔注射1次,连续给药21 d.在相同条件下,每天给予假手术组或去松果体组的每只大鼠腹腔注射0.5 mL的50 g/L乙醇-生理盐水.用Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力,用免疫组织化学方法检测齿状回颗粒细胞下区的增殖细胞核抗原阳性细胞的变化.结果:40只大鼠实验中无死亡,全部纳入结果分析.①去松果体组大鼠平均逃避潜伏期较假手术组明显延长,差异有显著性[(32.02±2.54),(18.58±1.97)s,P＜0.01].褪黑素20μg/kg组和200 μg/kg组的平均逃避潜伏期较假手术组稍延长[(23.29±2.74),(24.94±2.81),(18.58±1.97)s,P＞0.05],但比去松果体组明显缩短,差异有显著性(P＜0.01).褪黑素2 mg/kg组的平均逃避潜伏期(30.57±2.43)s比假手术组、褪黑素20 μg/kg、200μg/kg组明显延长(P＜0.01),并接近去松果体组的水平(P＞0.05).②去松果体组大鼠平均游泳距离明显大于假手术组,差异有显著性[(826.24±32.28),(611.27±27.63)cm,P＜0.01].褪黑素20μg/kg和200μg/kg组的平均距离均明显小于去松果体组[(680.27±25.15),(692.96±26.42)cm,P＜0.01],而褪黑素2mg/kg组大鼠的平均距离(804.81±34.22)cm均明显大于假手术组、褪黑素20 μg/kg、200μg/kg组(P＜0.01),并接近去松果体组的水平(P＞0.05).③齿状回颗粒细胞下区的增殖细胞核抗原免疫反应产物定位于细胞核,呈棕黄色.增殖细胞核抗原阳性细胞核呈圆形、椭圆形或梭形,各组大鼠的增殖细胞核抗原阳性细胞核的形态无明显差异.去松果体组增殖细胞核抗原阳性细胞数较假手术组,差异有显著性[(58.50±7.73),(82.69±7.36)个/切片,P＜0.01].褪黑素20μg/kg、200μg/kg组的增殖细胞核抗原阳性细胞[(74.20±6.74),(72.00±6.77)个/切片]分别较去松果体组升高37.6%和23.1%,差异有显著性(P＜0.01),但仍未能达到假手术组的水平(P＜0.01).褪黑素2 mg/kg组的增殖细胞核抗原阳性细胞数(61.23±6.61个/切片)分别比假手术组、褪黑素20μg/kg、200μg/kg组下降25.9%、17.5%及14.9%,组间差异有高度显著性(P＜0.01),并接近去松果体组的水平(P＞0.05).结论:低剂量(20μg/kg,200μg/kg)的褪黑素替代治疗对去松果体成年齿状回颗粒细胞下区神经干细胞增殖及学习记忆能力均有相似的正性调节作用,而高剂量(2 mg/kg)的褪黑素替代治疗对上述指标具有负性调节作用;去松果体或褪黑素替代治疗与否,神经干细胞的形态均无明显的改变,提示褪黑素的作用可能是通过神经干细胞上的相应受体介导的机制使增殖细胞核抗原表达上调,加速细胞周期进程,促进神经干细胞增殖和分裂.

骨髓基质细胞静脉移植对脑创伤大鼠神经功能恢复和细胞凋亡的影响

目的:观察骨髓基质细胞移植于创伤性脑损伤大鼠模型后不同时间,对神经功能恢复和神经细胞凋亡的影响,分析骨髓基质细胞静脉移植治疗脑损伤的可行性.方法:实验于2004-10/2005-05在哈尔滨医科大学第一临床医学院中心实验室完成.选取清洁级3月龄Wistar大鼠72只,随机分为4组:细胞移植组30只,损伤对照组30只,正常对照组6只,假伤组6只.细胞移植组和损伤对照组根据处死时间不同分为术后3,7,14,21,28 d 5个时间点,每个时间点6只/组.①通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离纯化骨髓基质细胞,细胞传至第3代用于实验.②细胞移植组和损伤对照组采用改进Feeney's自由落体装置建立大鼠创伤性脑损伤模型,正常对照组不做处理,假伤组仅开骨窗不至伤.③大鼠骨髓基质细胞体外纯化、扩增并经Brdu标记后,细胞移植组无菌条件下将总体积1 mL的3×106个骨髓基质细胞经大鼠尾静脉注入,其余3组注入等量生理盐水.通过神经运动功能评分观察移植后大鼠神经行为学改善情况,通过组织学方法观察移植骨髓基质细胞脑内存活迁移情况和对损伤皮质细胞凋亡影响情况.结果:实验选用大鼠72只,全部进入结果分析.①神经运动功能评分情况:细胞移植组于术后7,14,21,28 d分别为(15.3±2.7),(16.4±2.5),(16.9±2.1),(18.3±1.7)分,明显高于损伤对照组(t=3.15,2.96,2.25,2.92,P均＜0.05).②细胞移植组Brdu免疫组化染色观察:除移植后28 d外,其他各时间点损伤皮质周边区均发现阳性细胞,阳性细胞为呈棕色,圆形或椭圆形的单核细胞.③术后不同时间各组原位末端标记检测法染色观察结果:正常对照组和假伤组镜下观察未见典型凋亡细胞,偶可见非特异性淡染细胞散在分布;细胞移植和损伤对照各时间点除移植后28 d外,在伤侧皮质区均可见有较多的凋亡细胞.④骨髓基质细胞移植后不同时间点伤侧皮质神经细胞凋亡的变化:与损伤对照组比较,细胞移植组伤侧大脑皮质神经细胞凋亡率在移植后7,14,21 d明显降低[(17.26±2.71),(11.78±2.52);(12.76±1.52),(7.66±1.54);(7.40±1.22),(3.32±1.51)%;t=3.62,5.78,5.14,P均＜0.01].结论:静脉移植骨髓基质细胞能够减少脑损伤后细胞的凋亡,从而明显促进脑损伤大鼠神经功能的恢复.提示骨髓基质细胞静脉移植治疗脑损伤具有一定的可行性.

脑源性神经营养因子与胰岛素样生长因子Ⅰ促进神经干细胞向神经元定向分化的作用差异

目的:选用脑源性神经营养因子及胰岛素样生长因子Ⅰ作为诱导分化剂,观察其对神经干细胞定向分化的作用及其效应差异.方法:实验于2004-12/2005-10在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成.以无血清培养法从孕14～17 d的胚胎大鼠脑组织分离培养获得神经干细胞后,分别加入20 μg/L脑源性神经营养因子,20 μg/L胰岛素样生长因子以及20μg/L脑源性神经营养因子+20μg/L胰岛素样生长因子诱导其定向分化.微管相关蛋白2抗体来鉴定所获得的神经元,流式细胞仪检测计数神经元的分化比例.结果:①原代培养获得了Nestin染色阳性的神经干细胞.②干细胞经诱导分化后,各组均获得了微管相关蛋白2染色阳性神经元.③脑源性神经营养因子组,胰岛素样生长因子Ⅰ组和脑源性神经营养因子+胰岛素样生长因子Ⅰ组及对照组(体积分数为0.01的胎牛血清)诱导分化后,流式细胞仪计数神经元的分化比例为47.8%,57.78%,61.94%和32.69%,三个实验组与对照组差异显著(P＜0.05),而胰岛素样生长因子Ⅰ组与脑源性神经营养因子+胰岛素样生长因子Ⅰ组间差异无显著性(P＞0.05).结论:神经干细胞具有多向分化潜能,脑源性神经营养因子与胰岛素样生长因子Ⅰ均能促进神经干细胞向神经元定向分化,但两者无明显的协同作用.

提高胚胎大鼠神经干细胞数量的实验方法

目的:通过培养了解神经干细胞的生物学特性,着重从胎龄选择、优化分离和换液方法上提高神经干细胞的增殖能力和生长数量.方法:实验于2004-04/2005-09在锦州医学院中心实验室完成.①雌性SD大鼠35只,每日做阴道细胞涂片,排卵期雌雄合笼,以出现精栓计为受孕第0.5天.分别于孕10.5,11.5,12.5,13.5,14.5,16.5,18.5 d取出大鼠胚胎体,每时间点各5只.②通过采用机械分离和酶消化分离相结合的方法分离培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞.③换液首次采用分瓶法以后采用低速离心半量换液.④采用免疫细胞化学技术分别检测神经干细胞特征性标志巢蛋白表达和用血清诱导分化为大量神经元微管组合蛋白2和神经胶质纤维酸性蛋白表达.结果:①胎龄为12.5 d的胎鼠提取的神经干细胞集落多,其次为13.5 d.②在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢蛋白阳性的神经球.③用血清诱导分化为大量表达微管组合蛋白2阳性的神经元和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经胶质细胞.结论:考虑到生长因子在孕13～15 d能够很好地发挥作用,故选择胎龄为13.5 d胎鼠作为实验材料较为合适.通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离和原液首次采用分瓶法显著提高了神经干细胞的培养数量,培养出的细胞具有自我更新能力和增殖能力,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞.

光动力疗法对人胃癌细胞MGC-803的杀伤性干预

目的:观察5-氨基乙酰丙酸介导的光动力学疗法对人胃癌细胞MGC-803的干预作用,探讨光动力学疗法治疗胃癌的可能作用途径.方法:实验于2004-03/2004-12在全军神经医学研究所完成.试剂5-氨基乙酰丙酸购自美国Sigma公司;MGC-803人胃腺癌细胞株购于中山大学实验动物中心.①分别使用不同浓度的5-氨基乙酰丙酸培养MGC-803胃癌细胞,浓度分别为0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 mmol/L,给予相同剂量的激光辐照.②使用相同浓度的5-氨基乙酰丙酸培养MGC-803胃癌细胞,给予不同剂量的激光辐照,能量分别为6.25,12.5,25.0,50.0,100 J/cm2.③使用不同浓度的5-氨基乙酰丙酸培养MGC-803胃癌细胞,浓度分别为0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 mmol/L,不予激光辐照.④给予不同剂量的激光辐照培养MGC-803胃癌细胞,能量分别为6.25,12.5,25.0,50.0,100 J/cm2,不给予5-氨基乙酰丙酸.以上4个实验均以四甲基偶氮唑盐法检测细胞活力,以不加5-氨基乙酰丙酸、无激光辐照培养的细胞作为空白对照,细胞存活率=处理组细胞吸光度值/对照组细胞吸光度值×100%.⑤培养MGC-803胃癌细胞,随机分为4组,即单纯MGC-803胃癌细胞组、单纯5-氨基乙酰丙酸组、单纯给予激光组及光动力学治疗组,使用吖啶橙-溴化乙锭染色法检测细胞凋亡情况.结果:①5-氨基乙酰丙酸浓度不同、激光辐射剂量相同:随5-氨基乙酰丙酸浓度逐渐递增,MGC-803细胞的存活率逐渐下降,各组细胞存活率之间差异有显著性意义(F=266.39,P＜0.01);但在浓度到达2.0 mmol/L后,细胞存活率不再随着5-氨基乙酰丙酸的浓度的增加而下降.②激光能量不同、5-氨基乙酰丙酸浓度相同:随着激光剂量的增加MGC-803细胞存活率显著下降,各组细胞存活率之间差异有显著性意义(F=226.31,P＜0.01).③5-氨基乙酰丙酸浓度不同、不给激光辐射:各组细胞存活率之间差异均无显著性意义(F=0.79,P=0.54).④激光辐射剂量不同、不给5-氨基乙酰丙酸:各组细胞存活率之间差异均无显著性意义(F=0.61,P=0.66).⑤只有光动力学治疗组出现细胞凋亡现象,而其他细胞组基本无凋亡细胞.结论:在较低的浓度范围内,5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法对人胃癌MGC-803细胞的杀伤作用随着5-氨基乙酰丙酸浓度的增加而增加,在较高浓度时则存在饱和现象,而且杀伤力与光剂量成正比.单纯激光不能产生光动力效应,5-氨基乙酰丙酸本身对细胞无毒性作用.5-氨基乙酰丙酸介导的光动力学治疗能够有效的治疗胃癌,光动力学疗法诱导肿瘤细胞凋亡是其可能作用途径之一.

人眼周边视野缺陷的定量分析方法研究

目的:对周边视野检查常常是根据临床经验判断病眼周边视野病变的大小及位置,存在主观影响.人眼周边视野缺陷定量分析方法可以减少人为因素的影响.方法:①周边视野检查采用的是弧形板视野计,对传统的仪器进行了改造,将记录针改为记录笔,在记录纸上记录一系列离散的点图,用CCD数字照相系统将纸记录转化为数字图像.②利用禁忌搜索算法对离散点进行搜索,找到病眼周边视野曲线,并将病眼视野曲线同标准视野曲线进行比较,得到视野缺陷图.利用图像处理中的区域标识与面积计算方法可得到视野缺损面积的定量结果.结果:①通过计算机可绘制周边视野图,将病眼曲线与标准曲线在同一视图中显示,或者将病眼的历次检查结果曲线在同一视图显示,便于医生对病情进展或治疗情况进行分析.②可以得到视野缺陷图,并可对视野缺陷面积进行定量分析.结论:此方法可以进行周边视野缺陷定量分析,为周边视野缺陷的准确分析提供可靠依据.

磁刺激场中传感器的设计

目的:设计可用于磁刺激场分布的准确测量的传感器.方法:实验于2005-03/04在天津大学精仪学院电磁屏蔽室内完成,以法拉第电磁感应原理为基础,对直径为1.0 mm规格的线圈进行了绕制和磁场的测量、分析.绕制产生磁场的线圈时所用到的工具和器材包括:漆包线、绕线机、绝缘骨架、绝缘胶条.提出一种用于磁刺激场测量的新型点磁场测量传惑器的设计,并从理论上加以论证.结果:通过对有解析表达式的刺激磁场实际测量和理论计算比较,传感器对点磁场测量误差小于±5%.结论:按照此种方法设计的传感器可用于磁刺激场分布的准确测量.

骨质疏松腰椎三维有限元数字化模型的建立

目的:探讨利用螺旋CT建立骨质疏松腰椎三维有限元模型的高度数字化方法,以为腰椎骨质疏松的生物力学实验提供标准模型.方法:实验于2004-06/10在南方医科大学生物力学实验室完成.选取老年男性正常人体脊柱标本1具,范围从L4～L5,先行X线检查以排除可见的脊椎病变及损害.经螺旋CT沿横断面1 mm层厚扫描,以jpg格式输出其断面图像并转入微机保存.利用三维重建软件Mimics建立L4～L5段正常脊柱骨性结构的三维模型,再经过自由造型系统进行表面光滑化处理及对1 mm层厚引起的数据丢失予以修补.利用有限元软件Ansys的前处理功能,在脊柱模型骨性结构的基础上,补充建立终板、椎间盘、髓核、前纵韧带、后纵韧带、黄韧带、棘间韧带、棘上韧带等结构.采用合适的材料性质和实体单元类型对模型进行智能有限元网格划分.结果:①正常腰段脊柱三维模型有限元网格划分结果:利用三维重建软件Mimics和有限元软件Ansys成功进行正常腰段脊柱三维模型有限元网格划分.共有82 563个单元,131 204个节点,建成后的三维有限元模型与实体组织具有良好的几何相似性.②骨质疏松腰椎三维有限元模型的建立:利用有限元软件Ansys的前处理功能,对不同组织的物理特性进行定义,椎体和后部结构的弹性模量均减少30%左右,符合真实的生物力学要求,真实模拟了骨质疏松椎体的材料特性,成功建立骨质疏松腰椎三维有限元模型.结论:建立的骨质疏松腰椎三维有限元模型接近真实的生物力学标本,是理想的研究骨质疏松腰椎生物力学的数字化模型,可应用于骨质疏松腰椎损伤程度的评估.

脑控双页虚拟键盘的设计与性能分析

目的:高位截瘫患者往往失去了基本的语言交流功能,为帮助他们实现与外界的交流,利用脑-机接口这种新颖的人-机交互模式构建一种基于"模拟自然阅读"视觉诱发电位的脑控拼写器.方法:使用者通过眼睛盯住计算机屏幕上一个虚拟键盘中的相应按键,选择需要键入的字符,脑-机接口装置通过头皮记录电极检测出使用者的脑电信号,再利用模式识别软件将这个视觉诱发电位从背景信号中提取出来.由于每个按键对应的诱发符号呈现的时间间隔不同,依次相隔100ms,因此,从提取特征信号出现的时刻,就知道用户盯住的是哪个按键.这样就构成了一个拼写装置,从而与他人进行交流.结果:在已有工作的基础上设计了一个改进的双页虚拟键盘,通过设置换页按钮,使单次选择作业的信息量加倍.对其通信速率分析表明,该模式能大幅提高系统的比特率,高可达160比特/min.结论:采用"模拟自然阅读"视觉诱发电位模式构建脑-机接口(双页虚拟键盘),由于巧妙地将信号特征模式编码为时间间隔,增大了每分钟选择作业的信息量,使通信速率较现有系统更高.

硕导园地