中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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成体干细胞及其在运动医学中的研究与应用
成体干细胞可塑性的发现更新了人们对成体干细胞的认识,使成体干细胞研究成为干细胞研究的热点,为临床应用和运动医学领域的研究奠定了基础.成体干细胞亦具有自我更新、再生能力和可塑性等分化潜能的显著特征,但成体干细胞大多处于休眠状态,分裂很慢或很少分裂,而且数量较少.在运动医学领域,成体干细胞研究的重点是如何将成体干细胞诱导培养成所需要的细胞类型用于防治一些常见的运动性疾病,诸如由于利用成体干细胞技术治疗膝关节半月板损伤,其创伤小、方便易行且没有后遗症.研究发现长期系统的运动锻炼能够增强神经干细胞的迁移能力,促进神经功能恢复.另外运动锻炼还可以提高成体干细胞对运动造成的神经系统变性性疾病、糖尿病、心脏病、骨骼及肌肉组织损伤等运动性疾病的康复效果.
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骨髓干细胞移植梗死心肌区域交感神经重构的研究与进展
心肌梗死后存在着交感神经重构现象,表现为交感神经再生和过度再生.交感神经的过度再生与心肌梗死慢性期室性心律失常和猝死的发生关系密切.骨髓干细胞心肌移植可增加有功能的心肌细胞数目,体外研究表明骨髓干细胞可促进神经元的生长,植入动物心肌梗死心脏后,可使神经生长凼子生成增多,其交感神经密度增加.干细胞植入心肌后刺激心肌神经萌生的机制仍不明确,干细胞植入后足否有神经细胞形成再迁移至心肌梗死远隔区,另外有町能是干细胞分化成过表达神经营养因子和其他生长因子的细胞,转而刺激神经萌生还需探讨.目前骨髓干细胞移植所面临的问题包括移植时选用的细胞类型、横向分化的调控机制不明、移植时机及移植方式、移植的安全性等.
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神经干细胞移植治疗小儿脑性瘫痪及所存在的问题
脑性瘫痪是儿童时期常见且终生存在的运动性残疾,目前尚无有效治疗手段,细胞移植和基因治疗技术的飞速发展为治疗此类疾病带来了希望.近两年国内外出现有关神经干细胞移植治疗脑性瘫痪的撤道,这给脑性瘫痪的治疗研究提供了新的思路.文章阐述了小儿脑性瘫痪的神经干细胞机制,并回顾近年来国内外关于神经干细胞移植在动物实验及临床中的有效应用,为神经干细胞治疗小儿脑性瘫痪的可行性提供依据.但神经干细胞移植治疗脑性瘫痪还存在一些问题:移植仍然存在免疫排斥反应:如何促进神经干细胞的快速增殖;如何实现神经干细胞的定向诱导分化;如何评价神经干细胞移植以后患儿的改善情况,移植时机,移植量,移植部位,移植方式等一系列问题均有待于基础和临床学科的共同研究和探讨.
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控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植对猴损伤脊髓髓鞘的修复
背景:髓鞘再生障碍是导致脊髓损伤后功能障碍的因素之一.目的:探讨骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞与控释胶质细胞源性神经营养因子联合移植后,对猴损伤脊髓的皮质脊髓束髓鞘的修复效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-05/07在北京市垂杨柳医院病理科完成.材料:选择2004 01/2005-01中山大学邓字斌教授课题组研究的猴脊髓石蜡标本12例作为回顾性实验分析对象,其中联合移植组4例、细胞移植组4例、模型对照组4例.方法:密度梯度法体外分离培养猴骨髓间充质干细胞,取传至第5～8代细胞诱导为神经元.3.组动物均建立急性重度脊髓损伤模型,10d后联合移植组取丹参酮预诱导1.5 h的猴骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞3.0×106个/kg,与含2 μg胶质细胞源性神经营养因子的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体混合,加入200 μL磷酸盐缓冲液制成混悬液,分5点注射到脊髓损伤部位;细胞移植组单纯给予含等量丹参酮诱导的骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞的磷酸盐缓冲液,模型对照组给予等量磷酸盐缓冲液.主要观察指标:皮质脊髓束髓鞘苏木精-伊红染色、砂罗铬花青染色结果及髓鞘平均吸光度.结果:砂罗铬花青染色结果示联合移植组对皮质脊髓束髓鞘的修复作用存范围、单位视野密度等方面优干细胞移植组,而苏木精-伊红染色不能区分这种差别;模型对照组皮质脊髓柬结构严重破坏,观察不到髓鞘结构.图像分析结果显示,联合移植组、细胞移植组皮质脊髓束髓鞘平均吸光度基本相似(t=1.725,P＞0.05).结论:控释胶质细胞源性神经营养因子可以增强骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞对猴损伤脊髓皮质脊髓束髓鞘的修复效果.
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人脐血单个核细胞移植在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的迁移及分化
背景:研究发现脐血单个核细胞脑内移植后可以存活,并减轻缺氧缺血性脑损伤程度,显著改善脑损伤大鼠的远期行为学,但作用机制仍未阐明.目的:将人脐血单个核细胞绎侧脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内,观察植入细胞在脑内的迁移与分化.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2007-12/2008-08在潍坊医学院分子影像学研究中心完成.材料:脐血来源于健康、足月妊娠产妇,由潍坊医学院附属医院产科提供.清洁级健康7 d龄SD新生大鼠50只,由山东省中医药大学动物中心提供.方法:Ficoll法体外分离培养人脐血单个核细胞,移植前3 d行BrdU标记.50只大鼠均采用Rice-Vannucci法复制缺氧缺血性脑损伤模型,造模后24 h,在左侧侧脑室(AP:-0.5 mm,ML:-2 mm,DV:-2 mm)注入脐血单个核细胞悬液,2 μL点,共1×105个活细胞.分别干细胞移植后24 h,3 d,7 d,14 d,28 d取材制备脑组织切片,10只,时间点.主要观察指标:采用免疫荧光双标法检测移植脐血单个核细胞的脑内迁移、神经干细胞的表达、分化情况.结果:50只大鼠均进入结果分析.①移植后24 h侧脑室内可见BrdU+细胞;移植后3,7 d移植细胞迁移到室管膜下区;移植后14,28 d移植细胞迁移到大脑皮质及海马.②移植后24 h侧脑室内可见BrdU+nestin+细胞:移植后3 d室管膜下区出现BrdU+nestin+细胞;移植后7 d BrdU+nestin+细胞数增加;移植后14 d BrdU+nestin+细胞数下降.③移植后14 d大脑皮质、海马开始出现BrdU+NSE+细胞与BrdU+GFAP+细胞,移植后28 d双阳性细胞数进一步增加,BrdU+NSE+细胞及BrdU+GFAP+细胞占BrdU+的比例也增加.结论:脐血单个核细胞侧脑室移植入脑内后可以继续存活,并迁移到大脑皮质与海马部位,分化为成熟的神经元与神经胶质细胞.
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CD34+细胞联合许旺细胞移植脊髓全横断大鼠:移植细胞的存活分化及后肢运动和痛温觉反应
背景:CD34+细胞和许旺细胞在单独移植情况下均有促进脊髓修复的功能,且各自分泌和表达成纤维细胞生长因子受体及配体.目的:探讨CD34+细胞与许旺细胞联合移植对脊髓全横断损伤大鼠的后肢运动及感觉功能恢复的影响,并观察体内移植后细胞的存活、迁移、分化及表型变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-07/2008-09在昆明医学院神经科学研究所完成.材料:SPF级健康雌性SD大鼠60只,随机分为模型对照组、免疫对照组、CD34+细胞组、许旺细胞组、细胞联合组,12只/组.SPF级6～8周龄ICR小鼠2只,用于分离培养骨髓CD34+细胞.SPF级一两天龄ICR新生鼠30只,用于分离培养许旺细胞.方法:各组大鼠均建立脊髓全横断损伤模型.造模后2周,CD34+细胞组、许旺细胞组将体外培养并荧光标记好的对应细胞悬液经多点注射入横断瘢痕及瘢痕上下各一个脊髓节段,共6个注射位点,每点注射5 μL,每只大鼠共移植60万个细胞量;细胞联合组移植方法相同,但CD34+细胞、许旺细胞注射量各60万个.移植后除模型对照组外,余4组均使用免疫抑制剂环孢素腹腔给药.主要观察指标:通过BBB评分判定大鼠后肢运动功能的恢复情况,测定热痛阈值和机械痛阈值的变化,形态学及组织学鉴定移植细胞的存活、迁移、分化、表型变化.结果:移植后12周内CD34+细胞组BBB评分高(P＜0.05),至移植后24周时细胞联合组BBB评分高,恢复效果佳,许旺细胞组次之,CD34+细胞组差(P＜0.05).与CD34+细胞组比较,移植后12周细胞联合组热痛闽值明显降低(P＜0.05),随移植时间延长,各组机械痛闽值均明显降低(P＜0.05),但热痛阈值没有发现类似规律.CD34+细胞在有许旺细胞参加的情况下存活数量较多,在移植后12周尤为明显.移植后4周荧光细胞集中在针道附近,第12周荧光细胞迁移到瘢痕上下一两个节段,且较集中分布于脊髓灰质,白质中少见.与CD34+细胞组比较,移植后4,8,12周细胞联合组成熟神经元特异性标记物Neu-N阳性率、胶质纤维酸性蛋白阳性率均明显升高(P＜0.05),成熟少突胶质细胞标记物APC阳性率明显下降(P＜0.05);CD34+细胞组、细胞联合组早期少突胶质细胞标记物O4阳性率均明显下降(P＜0.05).移植后4,8,12周,许旺细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达率逐渐增高.结论:CD34+细胞联合许旺细胞移植对脊髓全横断大鼠后肢功能及感觉功能恢复效果优于单纯CD34+细胞移植,并得到了体内实验的证实.
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改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析析☆
背景:目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低,且缺乏较为统一的鉴定方法.目的:对传统的体外分离培养脐带血问充质干细胞方法加以改良,以提高细胞培养成功率,并进行生物学特性观察.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-04/2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成.材料:取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份,由上海市红房子医院产科提供,经产妇和家属同意.方法:无菌条件下取新牛儿脐带血,以密度梯度离心法分离单个核细胞,以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基进行体外培养,原代培养5～7 d后半量换液,后每隔三四天全量换液一次.待细胞贴壁后,按处理方法不同分为2组:改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养:改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基换为含体积分数为15%小牛血清的α-MEM培养液,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基.取第5代脐带血间充质干细胞,进行体外成骨及成脂诱导.主要观察指标:显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红染色检测绌胞诱导分化能力.结果:28份脐带血中20份培养出贴壁细胞(改良1组6份/10份,改良2组14份/18份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率为46.4%,可传至22代且形态无变化,强烈表达CD105、CD29等问充质干细胞表面标志,而CD34、CD45和CD106等呈阴性表达.在特定诱导条件下,脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞.结论:脐带血中存在问充质干细胞,具有多向分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定,体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率.
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骨髓间充质干细胞与急性皮肤放射损伤的修复
背景:皮肤放射性损伤难治愈易复发常成为临床上难以解决的问题.随着干细胞丁程与组织学工程的进展,骨髓间充质干细胞实际应用研究日益受到重视,特别是其多向分化的潜能,显示了在创伤修复领域诱人的应用前景.目的:观察骨髓间充质干细胞对皮肤局部急性放射损伤的修复作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-06/08在苏州大学附属第二医院血液病实验室完成.材料:雄性昆明小鼠46只,体质量(25+2)g,其中40只用于建立皮肤局部Ⅲ度放射损伤模型.方法:随机选取40只小鼠以3.6%水合氯醛腹腔麻醉,以能量为4 MeV的电子线(1 Gy/min)照射小鼠臀部皮肤,面积为2.0 cm×1.5 cm,总吸收剂量为40 Gy,后将小鼠随机分为实验组和对照组,每组20只.实验组照射后即刻经尾静脉注射经CFDA SE标记的骨髓间充质干细胞注射液0.1 mL(浓度为2×1010 L-1),对照组注射等量生理盐水,剩余6只不做照射处理,仅经尾静脉注射等量骨髓间充质干细胞.主要观察指标:实验组与对照组小鼠创面损伤情况及照射后2,3周皮肤病理变化,免疫组织化学分析皮肤新生血管;观察不同时间骨髓间充质干细胞在实验组小鼠皮肤及其他组织的分布情况.结果:将骨髓间充质干细胞经尾静脉移植入实验组小鼠后,实验组皮肤创面愈合速度比对照组快4～6 d.实验组创面损伤面积较对照组小,病理表现中表皮、毛囊、皮脂腺及胶原纤维的损伤程度均较同时期的对照组小鼠轻.皮肤创面中的新生毛细血管数高于对照组.实验组骨髓间充质干细胞在皮肤及其他组织中广泛分布且数量明显高于未照射的小鼠.结论:骨髓间充质干细胞对局部皮肤放射损伤创面有明显有效的修复作用,其作用是在干细胞与创伤局部微环境相互作用下实现的.
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序贯法诱导小鼠胚胎干细胞向神经元样细胞的分化
背景:目前小鼠胚胎干细胞体外向神经方向诱导分化的研究报道诸多,但其分化的过程很难控制,很多实验的操作方法复杂,分化比率也很低.目的:建立一种稳定、高效、简便的实验方法,将小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞.设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-08/2008-01在中国医科大学发育生物学教研室完成.材料:小鼠胚胎干细胞系AB2.1,由美国南加州大学医学院惠赠.方法:在饲养层细胞上培养小鼠胚胎干细胞,采用"序贯诱导法",优化实验条件,将小鼠胚胎干细胞向神经方向诱导,列诱导后细胞进行成熟神经细胞标志物签定,并用流式细胞仪测定诱导分化比率.主要观察指标:①倒置荧光显微镜下观察小鼠胚胎干细胞形态特征.②优化序贯诱导法的3个实验条件.③实验条件优化后诱导至第10天分化细胞的形态特征.④诱导后第10天细胞免疫荧光法和蛋白免疫印迹检测神经细胞特异性标志物的表达.⑤蛋向免疫印迹检测诱导分化第4天和第10天细胞的神经细胞β-微管蛋白J1的表达.⑥流式细胞仪检测神经元特异性核蛋向阳性细胞百分比.结果:①生长于饲养层上的未分化鼠胚胎干细胞聚集呈圆形或椭圆形集落样生长,细胞排列紧密,集落边界清楚.②优化后的"序贯诱导法"在诱导时首次接种所用培养液的血清浓度为12.5%,小鼠胚胎干细胞首次接种佳密度为1.0×108 L-1,完全更换为无血清培养液的时间为第5天.⑨诱导至第10天分化细胞出现的突起可达胞体长度的10倍以上.也有小部分分化细胞胞体呈多边形,有多个短突起,仅有一个细长突起,出现突触样结构和生长端样结构,类似神经元.④诱导后第10天细胞免疫荧光法检测神经元特异性标志物巢蛋白、神经细胞β-微管蛋白J1、神经元特异性核蛋白、神经细胞黏附分子1表达阳性,神经胶质细胞标志物胶质细胞纤维酸性蛋白表达阴性.⑤与未分化鼠胚胎干细胞相比,诱导分化第4天和第10天的细胞蛋白免疫印迹检测神经细胞β-微管蚩白J1表达升高(P＜0.05).⑥流式细胞仪检测神经元特异性核蛋白阳性细胞百分比,计算出诱导第10天胚胎干细胞分化比率为(89.91±2.03)%.结论:应用优化后的"序贯诱导法",可稳定、简便的诱导小鼠胚胎干细胞高比率分化为神经元样细胞.
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激光调控内源性神经干细胞的增殖与分化
背景:大量研究表明增强脑内源性神经细胞的自我修复和增殖能力将成为治愈缺血缺氧性脑损伤有价值的方法之一.目的:探讨氦氖激光对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤内源性神经干细胞增殖及分化的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-12/2008-05在郑州大学护理学院完成.材料:7 d龄健康Wistar新生大鼠36只,随机分为假手术组、模型组、激光治疗组,12只/组.氦氖激光多功能治疗仪由桂林电子仪器厂生产.方法:模型组、激光治疗组新生大鼠通过结扎左颈总动脉后,再吸入低浓度氧(含体积分数为8%的O2、体积分数为92%的N2)建立缺血缺氧性脑损伤模型:假手术组不结扎左颈总动脉,置于正常空气中.造模后第2天开始,激光治疗组给予氦氖激光照射,激光波长632.8 nm,激光功率4 mW,光斑直径3 mm,功率密度56.62 mV,能量密度33.975 J/cm2,10 min/次,1次,d,10 d为1个疗程,共2个疗程,两疗程间隔2 d.穴位选取顶骨正中的"百会"穴,以及第7颈椎与第1胸椎间、背部正中的"大椎"穴.疗程结束后制备腑海马切片,分别进行巢蛋白和微管关联蛋白2免疫组织化学染色.主要观察指标:大鼠脑内巢蛋白标记的神经干细胞和微管关联蛋白2标记的神经元的表达情况.结果:36只大鼠全部进入结果分析.①大鼠内源性神经干细胞的表达:与假于术组比较,模型组、激光治疗组齿状回内巢蛋白免疫阳性细胞均明显增多(F=122.36,P＜0.05),且激光治疗组增多幅度大于模型组(P＜0.05).②神经元特有结构蛋白的表达:激光治疗组大脑皮质微管关联蛋白2表达相当广泛,强阳性染成棕褐色的树突呈条索样、流星样放射状分布,海马各区锥体神经元和齿状回颗粒细胞层神经元排列比较整齐,树突连续阳性染色呈树枝状交叉分布于分子层.假手术组与激光治疗组染色所见无明显差别.模型组微管关联蛋白2表达明显减弱.结论:激光治疗能够促进缺血缺氧性脑损伤新生大鼠脑内源性神经干细胞增殖,并诱导其向神经元方向分化.
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成人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的诱导分化:佳诱导剂与诱导时间
背景:近年发现,骨髓间充质干细胞可以向神经细胞分化,但其佳诱导剂及诱导分化时间尚无公论.目的:寻求一种将成人骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的佳诱导剂及诱导时间.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2007-10/2008-08在郑州大学第二附属医院完成.材料:取郑州大学医学院第二附属医院血液科穿刺的健康成人骨髓,性别不限.方法:将细胞转至24孔培养板中培养,将诱导剂脑源性神经营养因子(brain-derived nemotrophic factor,BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-dedved neurotrophicfactor,GDNF)配成质量浓度为20 μg/L的溶液,维甲酸配成质量浓度为0.3 mg/L的溶液,用加样器加入含DMEM、体积分数为2.5%胎牛血清的细胞中,诱导剂的终浓度为2.5 9/L,实验分为4组:GDNF+维甲酸组,BDNF+维甲酸组,GDNF+BDNF+维甲酸组,空白对照组(未加诱导剂).主要观察指标:分别于诱导后12,24,48,96 h后于倒置显微镜下观察各组细胞形状,并进行细胞计数,锥虫蓝检测细胞活力,并行免疫组织化学鉴定.结果:①诱导12 h后,GDNF+维甲酸组有16.28%的细胞出现分化,其他3组未发现分化细胞,行免疫组织化学检测显示4组细胞胞浆均显示蓝色为阴性表现,即未有神经元样细胞出现.②诱导24 h后,GDNF+维甲酸组有14.83%的细胞出现分化,BDNF+维甲酸组分化率为10.66%,GDNF+BDNF+维甲酸绀为4.53%,空白对照组未发现分化细胞.免疫组织化学检测4组均为阴性.⑨诱导48 h后,4组细胞分化率分别为(63.91±2.19)%,(23.15+3.00)%,(19.69+1.98)%,0,免疫组织化学检测结果GDNF+维甲酸组为阳性,即有神经元样细胞出现,其余3组均为阴性.④诱导96 h后,4组细胞分化率分别为(51.29+3.75)%,(25.13+2.88)%,(23.61±1.94)%,0,免疫组织化学检测均为阴性.结论:实验中骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的佳诱导剂为GDNF+维甲酸,佳诱导时间为48 h.
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细胞毒药物对小鼠肺组织和骨组织间充质干细胞增殖和分化的影响
背景:肿瘤患者接受高剂量化疗时,细胞毒药物不仅对肿瘤细胞产生杀伤作用,对正常组织细胞甚至组织干细胞也产生一定损伤.目的:探讨细胞毒药物体外对小鼠肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞增殖及分化能力的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-05/2008-08在解放军军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学室和解放军北京军区总医院肿瘤科完成.材料:清洁级3～5周龄C57BL/6小鼠3只,由解放军军事医学科学院实验动物中心提供.方法:从胶原酶消化的小鼠肺组织和骨片中分离培葬肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞,并在含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液中培养、传代、扩增.采用MTT法测定马利兰、阿霉素、环磷酰胺、足叶乙甙,甲氨蝶呤、长春新碱、顺铂对两种间充质干细胞生长增殖的影响,参照文献设置药物浓度范围,并设立窄白对照,仅加入含体积分数为10%胎生血清的α-MEM培养液.药物作用后,分别诱导两种间充质干细胞向脂肪和成骨细胞分化.主要观察指标:不同药物作用后,肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞的生长抑制、增殖情况及分化能力.结果:①在治疗剂量范围内,肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞对环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤耐受,而对长春新碱、足叶乙甙、顺铂、阿霉索中度敏感.肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞对环磷酰胺、马利兰的敏感性相似,但小鼠肺组织间充质干细胞对甲氨蝶岭、长春新碱、足叶乙甙、阿霉素的敏感性均低于骨组织间充质干细胞,对顺铂的敏感性高于骨组织间充质干细胞.②与空白对照比较,环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤作用后对两种间充质干细胞的增殖能力影响较小.⑨在环磷酰胺、马利兰、甲氨蝶呤、长春新碱和足叶乙甙等约物作用24 h内,两种间充质干细胞仍能被诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞.药物作用72 h后,两种间充质干细胞向脂肪和成骨细胞的分化能力减弱甚至消失.环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤对肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞的分化功能影响相对较小.结论:细胞毒药物对小鼠肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞具有毒性作用,但不同组织器官来源的间充质干细胞对细胞毒药物的敏感性存在一定差异;药物作用后可影响两种间充质干细胞的增殖和分化能力.
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大鼠海马83 ku蛋白诱导神经干细胞向乙酰胆碱酯酶阳性神经元的定向分化
背景:神经干细胞的临床应用还尚待时日,现阶段需要解决如何诱导神经干细胞分化为特定表型的神经元以替代丢失、变性的神经元细胞.目的:探讨大鼠海马组织83 ku蛋白对神经干细胞向乙酰胆碱酯酶阳性神经元分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2003-10/2008-04在南通大学医学院完材料:清洁级SD大鼠12只,17 d龄SD胎鼠多只,均由南通大学实验动物中心提供.方法:取6只正常大鼠及6只切割海马伞后14 d大鼠的海马组织制成匀浆,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据染色结果切取含有83 ku差异蛋白条带进行电洗脱,定量后调整蛋白浓度为300 mg/L.取胎鼠前脑组织,体外分离培养神经干细胞,设立3组:空白对照组加入单纯DMEM/F12无血清培养基;83 ku蚩白正常组、83 ku蛋白切割组分别加入含10 mg/L来自正常/割海马伞大鼠海码组织83 ku蛋白的DMEM/F12无血清培养基,诱导12 d.主要观察指标:用乙酰胆碱酯酶组织化学染色榆测神经干细胞分化为乙酰胆碱酯酶阳性神经元的情况.结果:诱导12d后,83 ku蛋白切割组乙酰胆碱酯酶阳性神经元较多,胞体大且分化较好,突起粗且长;83 ku蛋白正常组乙酰胆碱酯酶阳性神经元较少,胞体小,突起短;空白对照组仅见少量乙酰胆碱酯酶阳性神经元.组间乙酰胆碱酯酶阳件神经元数比较差异有显著性意义(P＜0.05),83 ku蛋白切割组＞83 ku蛋白正常组＞空白射照组.结论:大鼠海马组织中83 ku蛋白可成功诱导神经干细胞定向分化为乙酰胆碱酯酶阳性神经元.
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无血清培养肾癌干细胞及其鉴定
背景:肿瘤干细胞理论的产生,对肿瘤的发生、发展及其发病机制有了更新的认识,为肿瘤研究提供了新的方向,通过无血清培养技术已从许多肿瘤中分离并鉴定出特定的肿瘤干细胞.目前,无血清培养已成为培养肿瘤干细胞的经典培养方法.目的:运用无血清培养的方法从肾癌细胞中获取肾癌干细胞,并进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-02/2009-02在江苏大学完成.材料:肾癌细胞株OS-RC-2由上海中科院细胞库提供.方法:取处于对数生长期的肾痛细胞OS-RC-2,悬浮于预先配好的DMEM/F12无血清培养基中(含表皮生长因子20 μg/L,碱性成纤维细胞生长因子20 g/L),观察生长情况,培养7 d后运用流式细胞仪测定CD133及CD34的表达.以不含细胞因子的高糖DMEM/F12培养液培养细胞作为阴性对照.另外收集无血清培养7 d的肾癌细胞球,重悬于含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM,F12培养基中,进行干细胞分化实验观察.主要观察指标:①倒置显微镜下观察肾癌干细胞生长情况.②流式细胞仪检测肾癌干细胞及肾癌细胞中CD133及CD34的表达.③收集无血清培养7 d后的肾癌干细胞重新常规培养并观察其分化情况.结果:①肾癌细胞接种于含细胞因子的无血清培养基2 d后可见有细胞球生成,7 d后细胞球明显增多,体积增大.对照组肾癌细胞则贴壁生长,未见细胞球生成.②流式细胞仪检测显示,肾癌细胞球中CD133+CD34-表达率(8.33±1.26)%,对照组肾癌细胞表达率(1.24±0.36)%(t=19.71,P＜0.05).③肾痛细胞球重新悬浮于含体积分数为10%胎牛血清的培养液2 d后可见细胞球分散为单个细胞,恢复原来贴壁生长特点,CD133及CD34表达与阴性对照相同.结论:利用含细胞因子表皮牛长因子和碱性成纤维细胞生长因子无血清培养的方法可以从肾癌细胞中获取肾癌干细胞.
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年龄对人骨髓间充质干细胞体外生长与衰老的影响
背景:随着传代次数的增加,体外培养的人骨髓间充质干细胞被发现逐渐呈现衰老细胞的特征,但是,年龄是否影响人骨髓间充质干细胞的衰老进程则报道罕见.目的:观察年龄对体外培养的人骨髓间充质干细胞数量、增殖和衰老以及氧化应激的影响.设计、时间及地点:单因素设计,细胞学体外对比观察,于2007-07/12在中南大学湘雅二医院完成.材料:骨髓来源于中南大学湘雅二医院门诊28名健康自愿者,其中健康老年人14名,男10名,女4名;年龄60～73岁,平均65岁.健康年轻人14名,男9名,女5名;年龄18～28岁,平均25岁.方法:无菌条件下穿刺健康自愿者髂后上嵴,抽取骨髓2.0～3.0 mL,注入含肝素的无菌抗凝管中,加等体积的无菌PBS稀释,离心后以1×105/cm2骨髓来源的有核细胞接种于6孔板培养,于接种4 d后换液,去除未贴壁细胞,以后每3 d换液.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,流式细胞仪检测表面抗原,比较两组原代细胞集落形成数量、首次传代和第2代骨髓间充质干细胞传代时间、早代龄骨髓间充质干细胞经衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性的衰老细胞计数及其上清液丙二醛水平.结果:两组体外培养的原代和第2代骨髓间充质干细胞在形态上无差异,早期呈集落样生长.流式细胞仪检测显示,两组骨髓间充质干细胞的免疫表型一致,CD44、CD105阳性表达,不表达CD34.老年人骨髓间充质干细胞首次传代与次代传代时间显著长于年轻人,集落形成单位显著少于年轻人(P＜0.05).第5代老年人骨髓间充质干细胞开始出现较多宽大扁平的衰老细胞,经β-半乳糖苷酶染色胞浆呈蓝绿色.第5代年轻人骨髓间充质干细胞大多保持梭形细胞外观,β-半乳糖昔醮染色阴性.老年人骨髓间充质干细胞上清液中丙二醛水平随代数增加而逐渐升高.骨髓间充质干细胞的β-半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比和上清液丙二醛水平显著高于同代年轻人(P＜0.05).结论:人骨髓间充质干细胞的数量和增殖随年龄增长而降低;体外培养的早代龄老年人骨髓间充质干细胞出现衰老征象,伴随氧化应激而增高.
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小鼠胚胎干细胞来源平滑肌细胞的鉴定及其功能分析
背景:胚胎干细胞来源的平滑肌细胞是血管组织工程潜在的细胞来源之一,但这些细胞是否具有成熟平滑肌细胞的表型和功能仍不清楚.目的:对小鼠胚胎干细胞分化的甲滑肌细胞进行表型鉴定及功能分析.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-05/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.材料:清洁级孕12.5 d昆明小鼠1只用于制备饲养层细胞,SD大鼠1只用干制备主动脉平滑肌细胞.小鼠胚胎干细胞系R1、小鼠微血管内皮细胞系由美国ATCC公司提供,转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1由本实验室制备.方法:①诱导分化及筛选:用转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1制备拟胚体,拟胚体悬浮培养5 d后贴壁培养1 d,第7天加入全反维甲酸诱导分化4 d,第11大用10 mg/L嘌呤霉素对诱导分化后的细胞筛选2 d.②表型鉴定:对筛选到的平滑肌细胞进行SM α-actin、SM22a、SM.MHC免疫荧光染色,以大鼠原代主动脉平滑肌细胞、未经筛选的第10天分化细胞作为对照,进行Western Blot分析.③收缩功能:10-5 mol/L卡巴可处理筛选到的平滑肌细胞30 min.④体外成血管功能:将等量的内皮细胞和筛选到的平滑肌细胞混合,在Matrigel上培养.主要观察指标:平滑肌细胞标志物的表达,平滑肌细胞的收缩,平滑肌细胞向内皮管腔样结构的募集.结果:分化的平滑肌细胞上要分布于贴壁生长的拟胚体的外周部位,胚胎干细胞来源的平滑肌细胞3种标志物SM α-actin、SM22a、SM-MHC免疫荧光染色均呈阳性表达,Western Blot结果显示其SM α-actin、SM22a表达水平与大鼠原代主动脉平滑肌细胞相似,高于未经筛选的第10天分化细胞.筛选剑的平滑肌细胞在10-5 mol/L卡巴可刺激下出现明显收缩,且能够募集到内皮管腔样结构周围.结论:小鼠胚胎干细胞来源的平滑肌细胞具有与成熟平滑肌细胞相似的表型和功能.
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脐带间充质干细胞的体外分离及生物学特性观察
背景:脐带组织依赖于母体免疫系统的保护,且胚胎自身免疫系统相对不发育、MHC表达低下,故来源于脐带的间充质干细胞的生物学特性已成为目前研究热点.目的:拟在体外分离培养人脐带组织间充质干细胞,并观察其多向分化能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-10/2007-05在四川大学组织工程重建实验室完成.材料:脐带来源于胎龄37～40周的健康新生儿,由四川大学华西第二医院产房提供.方法:取脐带沿血管长轴切开,去掉血管,再将脐带重新缝合形成环状,灌入胶原酶悬液,6～8 h后灌洗离心,获取细胞后贴壁法分离培养、扩增,细胞呈集落生长后传代.取传至第5代细胞,分别加入成骨、成脂诱导分化培养基.主要观察指标:脐带间充质干细胞的形态、生长状况、表面抗原分子的表达、多向分化潜能.结果:去除血管后获取脐带组织细胞的方法可获得贴壁生长的细胞,呈短棒状或梭形样细胞,易扩增和形成集落;高表达基质细胞抗原CD29,CD51,CD71,而不表达CD34,CD45及HLA-DR等造血干细胞抗原分子;成骨诱导后茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,碱性磷酸酶钙钴法染色胞质呈灰黑色,阳性细胞率＞85%;成脂诱导后油红O染色示胞浆充满油滴空泡.结论:脐带组织存在具有分化能力的间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,传代细胞表达基质细胞表面抗原,能够向成骨细胞、成脂肪细胞方向分化.
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物理学的力与工作中的压力之转折
人生怎能没有压力?这句话旱已被现代人说旧了.何为压力?又是什么样的压和什么样的力才能舍二而一为压力?我这当编辑的,咬文嚼字的"恶习"又上来了,便想将这其中的根源刨个肠清肚明.网海中对压力这个词可谓有多种的解释.若以词频来排序的话,要算物理学中常用"压力"了.
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重组人粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠星形胶质细胞表达的影响
背景:星形胶质细胞是中枢神经系统的主要成分之一,具有对各种损伤产生强烈反应的特性,脑出血后星形胶质细胞大量表达、活性增强,这种由常态转变为反应性状态的星形胶质细胞的病理生理学意义是目前研究热点.目的:探讨重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血后星形胶质细胞表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/11在泸州医学院中心实验室完成.材料:清洁级健康榷性SD大鼠50只,随机分为3组:假手术组10只、模型组20只、实验组20只.重组人粒细胞集落刺激因子为深圳新鹏生物工程有限公司产品.方法:模型组、实验组利用鼠脑立体定向仪、采用断尾取自体血法制备脑出血动物模型,假手术组用等量生理盐水代替自体血,余干预措施与模型组一致.造模1 h后,实验组大鼠腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子60 μg/kg,余2组未注射任何物质.主要观察指标:分别于干预后6 h,24 h,48 h,72 h,7 d采用免疫组织化学ABC法检测胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.结果:假手术组未见胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.模型组干预6 h即有少量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达,48 h后开始增多,至72 h胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量达高峰(P＜0.05),7 d后仍有大量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达,但较72 h时有所减少.实验组干预6 h时胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达与模型组相似,干预24 h,48 h,72 h,7 d时胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较模型组明显减少(P＜0.05),细胞变形程度减轻.结论:重组人粒细胞集落刺激因子能够抑制脑出血后星形胶质细胞的过度活化,可能对损伤脑组织重建和功能恢复起重要作用.
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造血干细胞与神经生长因子联合移植治疗脑梗死
背景:目前采用外周血造血干细胞移植治疗脑缺血方面的研究还比较少,缺乏大量、系统的实验数据.神经生长因子可调控神经元再生所需的微环境,对神经细胞的存活、增殖起重要作用.目的:观察造血干细胞移植后,神经生长因子对其在脑梗死大鼠脑内的存活、分化及神经功能的影响.设计:随机对照动物实验.材料:清洁级成年雄性SD大鼠120只,随机分为3组:单纯细胞移植组、细胞移植+神经生长因子组、模型对照组,40只/组.神经生长因子为北大之路药业有限公司产品.方法:大鼠颈部皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子后,密度梯度离心法分离培养造血干细胞,移植前行Brdu标记.3组大鼠根据改良Longa线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,造模后7 d,大鼠麻醉后暴露前囟,选取注射位点:前囟后方1.2 mm,中线向右旁开3 mm,硬膜下4 mm.单纯细胞移植组缓慢注入1×106个造血干细胞,细胞移植+神经生长因子组注入1×106个造血干细胞+200 ng神经生长因子,模型对照组给予等量磷酸盐缓冲液.主要观察指标:采用神经功能缺损评分检测神经功能的改善情况,免疫组化染色观察梗死半球Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞的分布,TCC染色观察梗死体积的变化.结果:与移植前比较,移植后1,2周仅细胞移植+神经生长因子组神经功能缺损评分均明显下降(P＜0.05),移植后3,4周各组神经功能缺损评分均明显下降(P＜0.05或0.01),且细胞移植+神经生长因子组下降幅度尤为显著(P＜0.01).移植后1周,细胞移植+神经生长因子组Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞数明显多于单纯细胞移植组(P＜0.01);第4周两组未见Brdu/CD34双阳性细胞,Brdu/Nestin较1周时减少,Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞均明显增多(P＜0.05),且细胞移植+神经生长因子组明显多于单纯细胞移植组(P＜0.01);模型对照组始终未见Brdu双阳性细胞.结论:神经生长因子对外源性移植的造血干细胞在局灶性脑梗死大鼠脑内存活、分化以及神经功能的恢复具有明显促进作用.
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不同大剂量环磷酰胺联合移植或不移植自体外周造血干细胞治疗重型系统性红斑狼疮23例
选择2004-10/2009-01桂林医学院附属医院风湿免疫科住院的23例重型系统性红斑狼疮患者,男3例,女20例,中位年龄(28±11)岁.分为4组:环磷酰胺10 mg/(kg·d)组12例,环磷酰胺20 mg/(kg·d)组5例,环磷酰胺30 mg/(kg·d)组4例,环磷酰胺40mg/(kg·d)组2例.对每组患者实施不同预处理剂量的环磷酰胺,×3d,存预处理前均采集自体外周血造血干细胞,保存细胞数为(1.7～3.8)×108/kg.所有受试者在任何时间点着白细胞低于0.5×109 L-1,血小板低于10×109 L-1即进行干细胞颈内静脉移植,回输细胞昔为(2.1～3.4)×108/kg.结果显示:环磷酰胺10 mg/(kg·d)组9例血小板和白细胞无下降,3例血小板和白细胞第7～9天下降,但能自行恢复.环磷酰胺20 mg/(kg·d)组1例血小板和白细胞无下降,4例血小板和白细胞第5～9天下降,但能自行恢复,均无需自体外周造血干细胞移植支持.环磷酰胺30mg/(kg·d)组4例血小板和白细胞第3～7天下降,其中1例于第5天回输干细胞,白细胞在移植后10,14 d低值分别为2.47×109 L-1,18.8×109 L-1;移植后30 d血小板为134×109 L-1.环磷酰胺40 mg/(kg·d)组2例血小板和白细胞第3,5天下降,其中1例于第4天回输干细胞,白细胞在移植后10,14 d低值分别为1.67×109 L-1,9.8×109 L-1;移植后30 d血小板为215×109 L-1.1例于第6天回输自体外周造血干细胞,白细胞在移植后10,14 d低值分别为2.18×109 L-1,16.5×109 L-1;移植后30 d血小板为96×109 L-1.所有移植病例均无移植物抗宿上病、肝静脉闭塞病、出血性膀胱炎和感染的发生.与环磷酰胺10 mg/(kg·d)组比较,环磷酰胺20,30,40 mg/(kg·d)组完全的临床缓解率明显升高.提示以自体外周血干细胞移植为后盾,采用移植或不移植干细胞的方法,将很可能使重型系统性红斑狼疮达到长期的完全临床缓解.
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人参皂甙Rb1及Rg1对许旺细胞神经生长因子表达的影响
背景:人参皂甙可以促智抗衰老,保护大脑皮质运动神经元,具有抗细胞凋亡作用,但作用机制不清.目的:观察人参皂甙Rb1和Rg1对许旺细胞神经生长因子表达的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2004-03/06在深圳市第二人民医院完成.材料:成人新鲜离体神经取自创伤离断无法再植的肢体,由深圳市第二人民医院提供.人参皂甙Rb1、Rg1由长春白求恩医科大学提供.方法:剥去神经外膜,剪成1.0～2.0 mm碎块,采用酶消化法分离许旺细胞,双30 min差速黏附法去除成纤维细胞,获得纯净度达95%以上的许旺细胞,将纯化的许旺细胞按每孔10万个细胞接种在预先涂有多聚赖氨酸的96孔细胞培养板上,设立3组:人参皂甙Rb1组分别加入含量为10,20,40,60,80 μg的人参皂甙Rb1 20 μL;人参皂甙Rg1组分别加入含量为10,20,40,60,80 μg的人参皂甙Rg1 20 μL;对照组加入PBS液20 μL.主要观察指标:流式细胞仪榆测许旺细胞神经生长因子的表达率.结果:与对照组比较,培养48 h后人参皂甙Rb1组、人参皂甙Rg1组许旺细胞神经生长因子表达率均明显升高(P＜0.05),且呈剂量依赖性增加,当人参皂甙Rb1和Rg1质量浓度达60 mg/L时许旺细胞神经生长因子表达率高.人参皂甙Rb1及Rg1相同剂量组之间比较,许旺细胞神经生长因子表达率差异无显著件意义(P＞0.05).结论:人参皂甙Rb1和Rg1可以通过促进许旺细胞分泌神经生长因子而具有潜在加速周围神经损伤修复的作用.
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葛根素抑制酒精导致人骨髓间充质干细胞的成脂分化
背景:葛根素属异黄酮类物质,研究发现其具有减轻酒精毒性和酒精成断症状的作用,此外还可以抗氧化、清除组织及细胞产生的氧自由基、减轻脂质过氧化对细胞的损害.目的:探讨葛根素对酒精导致的人骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-10在郑州大学基础医学院生物化学与分予牛物学教研室实验室完成.材料:骨髓取自健康成人志愿者,由郑州大学第一附属医院骨科提供.葛根素标准品由中国药品生物制品检定所提供.方法:采用梯度离心法分离培养入骨髓间充质干细胞,取传2代细胞,随机分为3组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基;模型组每天加入乙醇0.09 mol/L;实验组每天加入酒精0.09 mol/L,每两三天更换培养液时加入葛根素10-6moll/L.各组细胞培养7d.主要观察指标:采用RT-PCR法检测PPAR-γ2基因的表达,油红"O"染色进行脂肪细胞计数,测定细胞内碱性磷酸酶活性.结果:模型组PPAR-γ2 mRNA呈高表达,明显高于实验组和空白对照组(P＜0.05);实验组PPAR-γ2mRNA表达略高于对照组,但差异无显著性意义(P＞0.05).模型组脂肪细胞多,细胞内脂滴大而丰富;实验组脂肪细胞较模型组显著减少(P＜0.05);空白对照组脂肪细胞极少.与窄白对照组比较,模型组细胞内碱性磷酸晦活性明显降低(P＜0.05);与模型组比较.实验组细胞内碱性磷酸酶活性明显升高(P＜0.05).结论:葛根素能抑制酒精导致的骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化.
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自体骨髓干细胞移植治疗肢带型肌营养不良症33例
经解放军第四六三医院伦理委员会同意,纳入2007-12/2008-06在血液内分泌科住院的具有完整随访资料的肢带型肌营养不良症患者33例,男27例,女6例,年龄6～46岁,病程2～20年.患者皮下注射粒细胞集落刺激因子,动员4d后采集骨髓,Percoll梯度离心培养骨髓单个核细胞7-10d,配制浓度为2.48×1010 L-1的细胞混悬液,经静脉及四肢肌肉局部等量移植,单次移植提取的单个核细胞总量为(6.13±2.39)×108,间充质细胞含量为(1.92±0.98)×108.移植后6个月,33例患者的徒手肌力好转率54.5%,日常生活活动能力好转率81.8%,血清肌酸激酶降低率78.8%,乳酸脱氢酶降低率81.8%,肌酐升高率72.7%.提示自体骨髓干细胞移植治疗肢带型肌营养不良症可在近期增加患者肌力,提高生活能力,改善血清肌酸肌酶、乳酸脱氢酶活性及肌酐含量等指标.
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含氟达拉滨预处理方案对异基因造血干细胞移植过程中造血重建、移植物抗宿主病及患者生存的影响
目的:观察接受不同预处理方案改良Bucy(白消安/阿糖胞苷/环磷酰胺)或白消安,氟达拉滨对异基因造血干细胞移植后造血重建,移植物抗宿主病及生存的影响.方法:选择2006-12/2008-06解放军北京军区总医院收治的行异基因造血干细胞移植恶性血液病患者27例,按移植预处理方案小同分为两组,10例给予以氟达拉滨+白消安为基础的预处理方案:移植前2～6 d氟达拉滨30 mg/(m2·d),移植前3～6 d白消安3.2 mg/(kg·d);17例给予以改良Bucy为基础的坝处理方案:移植前4～6 d白消安4 mg/(kg·d),移植前两三天环磷酰胺60 mg/(kg·d)和阿糖胞苷2.0g/(m2·d).比较两组患者移植后白细胞、血小板重建时间,移植物抗宿主病的发生及其程度,复发与移植相关死亡率.结果:白细胞、血小板重建时间在Bucy组与白消安,氟达拉滨组分别为[(8.45±2,31),(8.96±2.47)d,P=0.957;(13.31±4.80),(15.89±5.21)d,P=0.662].Bucy组与白消安,氟达拉滨组患者急性移植物抗宿主病发生率分别为[47%(8/17),40%(4/10),P=0.629].27例患者截至统计时间10例死亡,其中复发死亡4例,移植物抗宿主病死亡3例,感染死亡2例,其他移植合并症死亡1例.Bucy组与白消安,氟达拉滨组1年内总生存率分别为(58.30±19.80)%和(73.00±11.80)%,1年内无病生存率为(48.60±18.70)%和(72.20±12.80)%,白消安/氟达拉滨组总生存率及无病生存率均较Bucy组高,但两组1年内总生存率、无病生存率差异均无显著性意义(P=0.511,0.854).结论:氟达拉滨应用于移植预处理方案中,可降低异基因造血干细胞移植过程中髓外毒性,但对疗效并无明显影响.
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四联袋分离的脐血干细胞临床应用8例
背景:试管法分离脐血干细胞效率低,易发牛微生物污染,应用临床安伞性得不到保证,寻找一种能满足临床需要的脐血干细胞分离方法用于治疗骨股头坏死尤为迫切.目的:拟建屯一种高效、安全且具有临床应用价值的脐血干细胞分离方法.设计、时间及地点:自身前后对照实验,于2006-02/2007-08在河南省红十字血液中心血液成分应用研究所及郑州市第二人民医院外一科完成.对象:2006-02/2007-08在郑州市第二人民医院外一科住院和门诊收治的股骨头坏死患者8例,均为男性,平均年龄40.6岁,4例合并激素应用史.脐带血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的健康胎儿,平均采血量90 mL.分离所片j叫联袋包括1个主袋、1个空袋、2个生理盐水袋,为山东威高集团产品.方法:将采集6 h内的脐血用无菌接口机与四联袋的1个空袋相连,离心分出部分血浆后,剩余的红细胞内加入羟乙基淀粉充分混匀,静止5 min后加入氯化钠液等倍稀释,淋巴细胞分离液倒入四联袋的主袋内,按1:1比例将脐血缓缓加入盛有淋巴细胞分离液的主袋内,离心后白膜层流入另1个空袋内,此袋即为富单核细胞溶液.将保存24 h内的脐血单个核细胞用脐血浆悬浮后,经手背浅静脉输注给股骨头坏死患者,单个核细胞≥1×108/份,2份/次,间隔3 d后再次输注,共3次,此为1个疗程,共3个疗程,每个疗程间隔两三个月.主要观察指标:脐血单个核细胞回收率及细胞活性,患者临床症状改善情况.结果:分离的脐血单个核细胞收率高、效果好,且分离过程不易发生微生物污染.8例患者关节疼痛均有不同程度的缓解或消失,有效率 100%;髋关节外展与内旋功能、行走距离及步态变化均有明显改善.细胞移植后6个月,5例可见不同程度的股骨头坏死区骨质密度的改变,2例股骨头形态恢复正常,另外1例无变化;12髋关节腔积液减少或消失,9髋MRl图像低信号区所占股骨头体积的百分比减少,3髋无变化.在细胞移植过程中及移植后均无并发症及发热、过敏等不良反应.结论:应用四联袋结合无菌接口技术分离脐血干细胞高效、安全,且具有临床应用价值,经静脉多次、多份输注脐血干细胞为伞身整体治疗股骨头坏死提供了一种新的手段.
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自体骨髓间充质干细胞体外扩增后移植治疗糖尿病足
背景:国外动物实验表明体外扩增自体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足效果较好.目的:观察自体骨髓间充质干细胞体外扩增后患肢移植的效果和安全性.设计:随机对照临床观察.对象:解放军第三军医大学西南医院2006-10/2008-10住院确诊的糖尿病足患者40例,男22例,女18例,年龄(64.3±12.7)岁,按wagner分级2级8例,3级18例,4级14例.按查表法随机分为细胞移植组22例,常规治疗组18例,实验经医院伦理委员会讨论批准.方法:常规治疗组给予常规降糖、降压、调脂、抗感染、抗凝、营养神经、扩张血管等药物治疗.局部常规换药,有坏疽者行截趾治疗;细胞移植组在常规治疗的基础上,按密度梯度离心和贴壁法分离制备骨髓间充质干细胞悬液,经流式细胞仪鉴定、染色体检测、细胞悬液皮试后,予肌肉注射法行扩增后自体骨髓间充质干细胞移植.主要观察指标:细胞移植后1个月两组患者治疗效果的比较,鉴定可能不良事件和副反应.结果:移植后1个月,细胞移植组患者肢体疼痛、冷感、间歇性跛行均有所改善,踝肱指数明显升高,双下肢血管显像血流灌注有所增加,与常规治疗组比较差异均有显著性意义(P＜0.01).移植后3个月随访患者均无异常症状体征出现,血、尿、便常规检测正常,心电图和肝肾功能无特殊改变,出凝血时间正常.结论:体外扩增自体骨髓间充质干细胞移植患肢治疗糖尿病足简便、有效、安全.
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异基因外周血造血干细胞移植治疗白血病141例
海口市人民医院2003-11/2008-11收治的14例白血病患者,均采用改良Bu-CTX2预处理方案的异基因外周血造血干细胞移植进行.具体预处理方案为阿糖胞苷2.0～3.0 g/(m2·d),×2 d,24 h持续静滴;马利兰4 mg/(kg·d)×3 d;环磷酰胺50 mg/(kg·d),×2 d;甲基环已亚硝脲250 mg/(m2·d),×1 d;抗胸腺细胞球蛋白25 mg/kg·d),×4 d.移植前3 d,供者行重组人粒细胞集落刺激因子皮下注射,于用药第4,5天采集外周血干细胞,并分别于当天由锁骨下静脉输入患者体内,回输单个核细胞数为(7.82～9.11)×108/kg,CD34+细胞数为(2.9～7_7)×106/kg.结果14例患者完全植入,均获得造血重建,移植后11～25 d白细胞＞1.0×109 L-1.,移植后11～51 d血小板＞20×109 L-1.3例出现Ⅰ度急性移植物抗宿主病,2例出现Ⅱ度急性移植物抗宿丰病,1例出现Ⅳ度急性移植物抗宿主病:3例出现出血性膀胱炎;所有患者目前均正常生活或工作.提示采用改良Bu-CTX2预处理方案的异基因外周血造血干细胞移植治疗白血病足安全有效的方法.
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自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死:6个月随访
目的:观察骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的临床疗效和安全性.方法:本院2003-06/2008-06收治的脑梗死患者120例,均符合1995年全国第四届脑血管病会议制定的诊断标准,随机分为4组:对照组、单纯干细胞动员组、单纯干细胞移植组、联合组,30例/组.对照组采用常规药物治疗与康复训练;单纯干细胞动员组在对照组治疗的基础上,给予重组人粒细胞集落刺激因子150 μg腹部皮下注射;单纯干细胞移植组在对照组治疗的基础上,经静脉移植自体骨髓间充质干细胞(16.2～51.3)×108;联合组综合上述3组方法进行治疗.结果:①与对照组比较,治疗后4周、12周、6个月单纯干细胞动员组、单纯干细胞移植组、联合组Fugl-Meyer运动功能评分、功能独立性评定量表评分均显著好转(P＜0.05或P＜0.01):且联合组治疗效果佳,疗效明显优于单纯干细胞动员组、单纯干细胞移植组(P＜0.05).②治疗后14 d内,单纯干细胞动员组未发现任何不良反应;单纯干细胞移植组发热4例,体温均在38℃以下,且24h后体温恢复正常,轻微头痛3例,未行治疗24 h后缓解;联合组发热5例,体温均在38℃以下,且24 h后体温恢复正常,轻微头痛3例,未行治疗24 h后缓解.结论:骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死近期疗效明显,不良反应较少.
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脂肪干细胞经低浓度骨形成蛋白2或骨形成蛋白7短期诱导后软骨及骨基因的表达
目的:探讨脂肪干细胞经低浓度骨形成蛋白2、骨形成蛋白7短期诱导后向软骨细胞和骨细胞方向的分化情况.方法:无菌切取成年新两兰大白兔皮下脂肪,胶原酶消化法体外分离培养脂肪干细胞,分为3组:骨形成蛋白2组加入含0.1 g/L维牛素C、10mmol/L β-甘油磷酸钠、10 μg/L骨形成蛋白2的诱导培养基培育15 min,然后按18×104个细胞/孔接种,再培育4～14d;骨形成蛋白7组培养方法基本相同,仅将骨形成蛋白2更换为骨形成蛋白7;对照组同法加入单纯培养基进行培育.结果:与对照组比较,骨形成蛋白2组、骨形成蛋白7组可上调脂肪干细胞数达1.78～1.79倍,上调蛋白含量达1.15～1.95倍,上调碱件磷酸酶活性达32～40倍.与对照组比较,诱导15 min培育4 d时,骨形成蛋白2组runx-2基冈表达提高1.9倍,骨桥素基因表达提商2.2倍,双聚糖基凶表达提高1.3～1.7倍;骨形成蛋白7组仅双聚糖基因表达提高1.3～1.7倍,不影响runx-2、骨桥素基因的表达.与对照组比较,诱导15 min培育14 d时,骨形成蛋白2组runx-2、骨桥素、双聚糖及aggrecan基因表达无变化:骨形成蛋白7组runx-2基因表达下调1.8倍,骨桥素基因表达下调5.0倍,双聚糖基因表达下调1.7倍,aggrecan基因表达有所提高.结论:经短期诱导后,再培养4 d骨形成蛋白2刺激runx-2和成骨基因的表达,14 d时骨形成蛋白7下调这些基因的表达,却上调蛋白多糖聚合体基因的表达.
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Oct-4在激素非依赖性前列腺癌干细胞中的表达及意义
背景:干细胞特异性基因Oct-4在维持干细胞功能和调节干细胞的分化过程中起着关键性作用,了解前列腺癌干细胞中Oct-4的表达,对前列腺癌的预后、复发和耐药的评估具有重要意义.目的:观察Oct-4在激素非依赖性前列腺癌干细胞中的表达.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-02/10在南吕大学第一附属医院中心实验室完成.材料:取12例前列腺癌患者手术后组织标本,其中6例在手术前没有经过化疗和激素治疗,另外6例患者经过激素治疗出现抵抗而手术.方法:制备前列腺癌组织单细胞悬液,流式细胞仪分选未经治疗前列腺癌和治疗后出现耐药的前列腺癌干细胞,RT-PCR和Western blot榆测激素非依赖件前列腺癌Oct-4基因和蛋白的表达.主要观察指标:激素依赖和非依赖性前列腺癌CD133+/CD44+以及CD133-/CD44-细胞的比例;Oct-4基因和蛋白在激素非依赖性前列腺癌CD133+/CD44+、CD133+/CD44-、CD133-/CD44+、CD133-/CD44-细胞的表达.结果:流式细胞仪检测显示未经过治疗的前列腺癌CD133+/CD44+细胞占(0.83±0.21)%,而CD133-/CD44-细胞多达(95.62±1.35)%;治疗出现激素抵抗的前列腺癌CD133+/CD44+细胞为(54.62±0.86)%,而CD133-/CD44-细胞为(9.56±0.47)%;与其他亚群细胞相比,激素非依赖性前列腺癌CD133-/CD44-细胞Oct-4基因和蛋白显著降低(P＜0.01);CD133+/CD44+细胞Oct-4基冈和蛋白表达显著升高(P＜0.01):而CD133+/CD44-和CD133-/CD44+细胞之间Oct-4基因和蛋白表达无显著差异(P＞0.05).结论:Oct-4在激素非依赖件前列腺癌干细胞中高表达,可能与前列腺癌的预后和耐药有关.
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慢病毒介导人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达
背景:神经营养素3是目前发现的在脊髓损伤修复中作用强的神经营养因子,它能有效促进再生轴突穿越胶质瘢痕组织,从而修复脊髓损伤.目的:构建含有人神经营养素3基因的重组慢病毒载体(LV-hNT3),观察转染后人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-06/2008-03在长海医院中心实验室完成.材料:取新生3 d的SD乳鼠双侧坐骨神经,用于许旺细胞的培养及鉴定;慢病毒三质粒系统pGC-E1-EGFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0为上海吉凯基因化学技术有限公司产品.方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,接着该质粒转化感受态的大肠杆菌E.coli DH5α,通过PCR及基因测序鉴定阳性克隆,再经Lipofectamine 2000将pGC-E1-hNT3-EGFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,按照病毒感染复数=1,4,8,10,12加入预先混好重组病毒完全培养液2 mL,通过增强型绿色荧光蛋白的表达测定收集的病毒滴度.将慢病毒转染许旺细胞,以未经转染的许旺细胞和经空载的慢病毒转染的许旺细胞为对照组.主要观察指标:慢病毒转染许旺细胞后,检测转染效率,通过实时荧光聚合酶链反应和蛋白免疫印迹检测人神经营养素3在许旺细胞中的表达.结果:实验中重组质粒的外源基因序列与GeneBank中的人神经营养素3阅读框架序列完全一致;浓缩后病毒滴度为5×107TU/L,LV-hNT3感染许旺细胞后,许旺细胞发出明亮的绿色荧光,当感染复数=10时转染效率高达85%,实时荧光PCR检测表明人神经营养素3 mRNA在入神经营养素3-许旺细胞中高效表达,而对照组中未表达,蛋白免疫印迹证实人神经营养素3在许旺细胞中表达.结论:实验构建的含有人神经营养素3基因的慢病毒载体能感染许旺细胞并且高效表达人神经营养素3.
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慢病毒载体介导血管生长素1基因修饰骨髓间充质干细胞对颈动脉粥样硬化的影响
背景:骨髓间充质干细胞易于被外源基因转染,且具有向损伤组织趋化聚集的特性,便于将目的基因导入其中并发挥治疗性作用,可以通过分化为血管内皮细胞修复损伤的血管内膜.目的:探讨慢病毒载体介导的血管牛长素1基因修饰骨髓间充质干细胞移植后,对大鼠颈动脉粥样硬化的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-02/2008-05在福建省高血压研究所及福建医大附属第一医院中心实验室完成.材料:4周龄雄性SD大鼠32只,8只用于制备骨髓间充质干细胞,剩余24只随机分为3组;模型对照组、空载体组、血管生长素1转染组,8只/组.方法:以重组慢病毒为载体构建血管生长素1基因工程干细胞,以绿色荧光蛋白为报告基因,调整细胞密度为(1.0～2.0),1010 L-1.3组大鼠均采用球囊损伤法+高脂饮食构建颈动脉粥样硬化模型,造模后即刻,空载体组将未感染的0.1 mL骨髓间充质干细胞悬液注入颈总动脉外膜,分3点注射;血管生长素1转染组同法注入等量重组慢病毒感染的骨髓间充质干细胞悬液,饲养2个月后处死大鼠,取颈动脉组织.主要观察指标:Western blot法检测转基因干细胞中血管生长素1的表达,荧光免疫组织化学及苏木精-伊红染色检测动脉内膜/中膜面积比.结果:24只大鼠均进入结果分析.血管生长素1转染组表达血管生长素1蛋白,另2组无血管生长素1蛋白表达.移植后2个月,荧光显微镜下空载体组、血管生长素1转染组动脉壁内均可见绿色荧光蛋白阳性细胞;各组均可见动脉内膜增生,斑块形成;与模型对照组比较,空载体组内膜面积,中膜面积值无明显变化(P＞0.05),血管生长素1转染组内膜面积,中联面积值明显减小(P＜0.05).结论:经血管生长素1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植可明显减轻动脉粥样硬化程度.
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干细胞治疗多系统萎缩
多系统萎缩是一组原因不明的中枢神经系统多部位萎缩变性疾病.病程逐渐进展,出现运动不能,震颤、平衡障碍、体位性低血压、痴呆等症状,使患者3～5年内丧失生活能力,这种神经功能的丧失不能被逆转,迄今尚无有效的治疗方法.干细胞治疗为多系统萎缩提供了新的治疗手段,在多系统萎缩动物模型和临床上都取得了一定的治疗效果.
