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外周血造血干细胞采集、动员及重建
骨髓移植成为治疗血液疾病的有效手段,但是骨髓移植由于费用高,来源缺乏等诸多因素限制,逐渐由外周血造血干细胞移植替代,外周血造血干细胞(PBSC)通过集落刺激因子的动员,使PBSC变得更易采集,利用PBSC的造血和提高免疫力的功能,来治疗急、慢性白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤疾病.
关键词： 骨髓移植 人类粒细胞集落刺激因子 CD34+细胞 -
黄芪、三七促进骨髓干细胞体外转化并扩增血管内皮前体细胞(EPC)作用的研究
目的:探讨黄芪、三七对骨髓干细胞体外转化并扩增EPC的促进作用及其可能的机制.方法:常规采集下肢缺血患者骨髓血,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,不同条件下贴壁扩增细胞.镜下细胞的形态学观察,流式细胞仪检测CD34+细胞的百分比.结果:细胞呈梭形,束状排列,间杂有少量圆形细胞.与对照组相比,黄芪中、低剂量组,三七中、高剂量组CD34+细胞的百分比均显著增加.结论:黄芪、三七能促进EPC的转化和增殖.
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参麦注射液对慢性再生障碍性贫血患者血清肿瘤坏死因子及骨髓CD34+细胞凋亡的影响
目的:探讨参麦注射液治疗慢性再生障碍性贫血(chronic aplastic anemia,CAA)的疗效及其作用机制.方法:将65例CAA患者随机分为治疗组和对照组,治疗组采用参麦注射液配合西药常规治疗,对照组单用西药治疗,治疗后进行疗效评价,并分别于治疗前后检测患者血清肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,以及采用免疫磁珠分离系统(MACS)分离纯化骨髓CD34+细胞,用DNA末端原位标记(TUNEL)技术分析骨髓CD34+细胞原位凋亡状况.结果:治疗组总有效率为63.6%,对照组总有效率为40.6%,治疗组疗效明显优于对照组(P＜0.01);治疗前,CAA患者血清TNF-α浓度、骨髓CD34+细胞凋亡率均明显高于健康对照组(P＜0.01),治疗后,治疗组血清TNF-α浓度明显降低(P＜0.01),骨髓CD34+细胞凋亡率减低(P＜0.05),与对照组相比均有显著差异(P＜0.05).结论:参麦注射液治疗CAA疗效确切,其机制可能为降低CAA患者血清TNF-α浓度,减少骨髓CD34+细胞凋亡.
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早期作用造血因子对人脐血CD34+细胞的体个扩增作用
为了观察早期作用造血细胞因子SCF、FL、IL-3、IL-6、TPO单独及联合应用,对脐血CD34+细胞的体外扩增作用.我们用吸附单克隆抗体-磁珠分离系统富集人脐血CD34+细胞,在体外液体培养体系中加入不同的细胞因子扩增4周,每周取样计数有核细胞总数及集落形成细胞(CFC)数.结果表明:用磁性细胞分离仪富集脐血CD34+细胞纯度为80%～87%;一些细胞因子有明显的协同效应,其联合应用的扩增作用显著高于单因子作用;SCF+FL存在下,IL-3是有效扩增有核细胞总数及CFC的关键因子;细胞因子SCF+FL+IL-3和SCF+FL+IL-3+IL-6组合对有核细胞总数及CFC均有良好的扩增效应,培养2周时对CFC的扩增倍数分别为38.3±4.4 和29.6±2.7倍,可满足成人移植及基因治疗等的需要.
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组蛋白H3K27甲基化抑制剂EPZ005687对U937细胞和正常骨髓CD34+细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响
本研究目的在于探讨组蛋白H3 K27甲基化抑制剂新药EPZ005687对白血病细胞系U937细胞和正常骨髓CD34+细胞的凋亡、增殖抑制和细胞周期的影响.以不同浓度的EPZ005687作用于U937细胞,在不同时间点采用Annexin V/PI法检测细胞凋亡,WST-1法检测细胞增殖,7-AAD流式细胞术检测法检测细胞周期,免疫化学法检测H3K27组蛋白甲基化活性.结果表明:EPZ005687显著诱导U937细胞的凋亡,在0.5、1、5和10 μmol/L浓度下作用于U937细胞48 h后,其凋亡率分别为3.96％±0.79％ 、5.74％±0.73％、13.34％±1.77％和25.24％±2.55％,而EPZ005687对正常骨髓CD34+细胞的凋亡影响较小;在0.5、l、5和10 μmol/L浓度下CD34+细胞凋亡率分别为3.64％±0.62％、4.28％±0.99％ 、6.18％±1.19％和7.56％±1.34％;0.5、1、5和10 μmol/L浓度的EPZ005687分别作用于U937细胞12h至96 h,作用CD34+细胞1至5d,明显观察到EPZ005687显著抑制U937细胞的增殖且呈剂量依赖性,而对正常CD34+细胞的增殖抑制并不明显.细胞周期分析显示,1 μmol/L EPZ005687作用72 h可使U937细胞明显阻滞于C1期(64.18％±13.27％vs 49.43％±12.54％),S期细胞比例明显下降低(9.67％±2.61％vs 15.26％±5.58％),而正常CD34+细胞因多数细胞位于G1期,S期细胞较少而不受其影响.进一步的H3 K27组蛋白甲基化检测分析显示,EZP005687可明显地降低U937细胞的H3 K27组蛋白甲基化,而不降低正常CD34+细胞的H3 K27组蛋白甲基化.结论:组蛋白H3 K27甲基化抑制剂EPZ005687明显抑制U937细胞的增殖,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,但对正常造血细胞CD34+影响较小,可作为一种潜在的血液肿瘤治疗药物应用于临床.
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脐血CD34+细胞体外诱导扩增红系细胞的探索
本研究利用脐血CD34+细胞在体外大量扩增红系细胞为解决血源短缺、杜绝输血传染、克服稀有血型患者疑难配血等问题提供一种有益的途径.利用添加SCF、IL-3、EPO等细胞因子的无血清培养液扩增脐血来源的CD34+细胞,并通过间充质干细胞的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化.结果表明,经过23天培养以后,本方法可以使细胞的扩增倍数达到2.52×105,其中95%以上都是红系细胞,粒单系细胞和巨核细胞所占比例都在1%以内.无间充质干细胞的培养体系在细胞扩增数量及红系细胞所占比例方面都明显逊于有间充质干细胞支持的培养体系.结论:利用细胞因子和间充质干细胞可以在体外大量扩增红系细胞,其中间充质干细胞对红系细胞增殖和分化起重要的促进作用.
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凋亡在脐血造血干/祖细胞冷冻损伤中的作用及其机制研究
为探讨脐血造血干/祖细胞冷冻损伤中凋亡的作用及其机制,应用流式细胞术检测脐血CD34+细胞冻存前后细胞凋亡率、线粒体膜势能和Fas抗原,用免疫组织化学法检测Bcl-2蛋白表达,用Western blot和caspase-3蛋白活性分析检测caspase-3的表达,以甲基纤维素半固体培养进行造血祖细胞集落分析.研究结果显示,CD34+细胞在-196℃冻存2周或4周后凋亡率增加,电泳出现DNA梯形条带,CFUs分别下降了25.2%和30.1%.冷冻过程中细胞内线粒体膜势能下降,Bcl-2蛋白表达下调,而Fas抗原表达无明显改变.新鲜分离的CD34+细胞中caspase-3以分子量为32 kD的非活性酶原形式存在,冷冻过程中caspase-3被激活,可检测到分子量为20 kD的裂解片段,caspase-3蛋白活性分别增加了1.2倍和1.5倍.结论:凋亡在脐血造血干细胞冷冻损伤中起着重要作用,其机制可能是通过线粒体介导的caspase依赖性途径执行,caspase 3是其中一个重要的效应蛋白酶.
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CD131基因在急性髓系白血病细胞的表达研究
目的:检测急性髓系白血病细胞CD131基因表达水平及是否存在突变,分析CD131表达水平与急性髓系白血病临床特点的关系.方法:收集44例急性髓系白血病初治病人及25个正常人外周血单个核细胞,应用RT-PCR比较二者CD131基因的表达水平;随机选取15例病人及5例正常人,采用PCR方法扩增CD131全长编码序列,连接到pGEM-T载体,转化Top10感受态细胞,筛选阳性克隆,序列分析检测二者CD131编码序列的突变情况.根据CD131的表达情况,将病例分为CD131阴性组和CD131阳性组,比较两组病例外周血白细胞数、CD34+细胞比例、化疗缓解率.结果:病例组的CD131基因表达水平显著低于正常对照组;序列分析检测到5种CD131的突变体,病例组的CD131的突变率为75.33％,显著高于正常对照组的突变率18.0％.CD131阴性组的CD34+细胞比例(69.1％±20.8％)显著高于CD131阳性组(27.7％±15.7％),化疗后完全缓解率(71.1％)低于CD131阳性组(33.3％).两组外周血白细胞计数差别无统计学意义.结论:CD131基因在急性髓系白血病细胞中表达水平低且突变率高.不表达CD131的急性髓系白血病,其CD34+细胞比例高,化疗完全缓解率低.
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粒系集落刺激因子对外周血T淋巴细胞亚群的影响及与CD34+细胞动员效果的相关性
本研究观察粒系集落刺激因子(G-CSF)作为造血干细胞动员剂对外周血T淋巴细胞亚群的影响及与CD34+细胞动员效果的关系.对26例行自体造血干细胞移植患者在G-CSF动员前后收集外周血标本,用流式细胞术检测动员前后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+CD8+及CD3+CD4 CD8-细胞绝对数量的变化并与外周血CD34+细胞的动员效果进行相关性分析.结果表明:G-CSF动员后外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4+CD8+及CD3+CD4-CD8-细胞的绝对数量分别增加2.23,2.62,2.99及10.96倍,而CD3+CD4-CD8+细胞的变化无统计学意义(P=0.243).各亚群细胞的变化与CD34+细胞动员效果比较,仅CD3+CD4-CD8细胞的变化与CD34+细胞动员效果间具有良好的相关性,r=0.796,P=0.000.结论:G-CSF将造血干细胞由骨髓动员到外周血的同时,使外周血中T细胞亚群的绝对数量发生不同程度的变化.在各T淋巴细胞亚群中CD3+CD4-CD8细胞的增加与CD34+细胞的动员效果间具有统计学意义的相关性.
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Cobe Spectra与Fenwal CS 3000 Plus血细胞分离器外周血造血干/祖细胞的采集效能比较
为了评价Cobe Spectra(Version 6.1)和Fenwal CS 3000 Plus两种血细胞分离机在造血干/祖细胞采集中的采集效能,对36人64次外周血造血干/祖细胞的采集进行了回顾性分析.20人42次使用Cobe Spectra采集,16人22次使用Fenwal CS 3000Plus采集.对CD34+细胞采集量、采集效率以及红细胞与血小板的采集量进行比较.结果表明:Cobe Spectra和Fenwal CS 3000Plus在CD34+细胞采集量和采集效率上无显著差异.CD34+细胞采集量与供者白细胞、单核细胞、造血祖细胞、CD34+细胞的动员情况呈正相关,在多因素stepwise线性回归模型中,采集前外周血干/祖细胞浓度是唯一有意义的影响因素.FenwalCS 3000 Plus的采集效率与外周血单核细胞量呈负相关.Fenwal CS 3000 Plus对红细胞的收集量显著高于Cobe Spectra,并且采集后供者外周血血小板降低程度较CobeSpectra更严重.结论:Cobe Spectra(Version 6.1)和Fenwal CS 3000 Plus在CD34+细胞的采集能力上无显著差别.当外周血单核细胞数量高,或是血型不合移植的及血小板减少的供者,推荐使用Cobe Spectra血细胞分离机.
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高剂量化疗联合自体外周血造血干细胞移植时骨髓及外周血采集物中CD34+细胞黏附分子的表达
本研究的目的是应用免疫荧光直接三色标记和流式细胞术(FCM),观测高剂量化疗(HDC)联合自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)时不同阶段的骨髓及外周血CD34+细胞,表达CD54、CD49d和CD62L的情况,探讨不同来源的CD34+细胞表达黏附分子的差异及其临床意义.将动员前、干细胞采集后和移植结束而骨髓重建后的骨髓样本及每次外周血单个核细胞样本,以CD34-PE和CD45-PerCP标记的同时,分别加CD54-FITC、CD49d-FITC、CD62L-FITC直接三色荧光标记,应用FACS测定CD34+细胞及各黏附分子表达情况,并比较不同时段骨髓中各类黏附分子表达的差异,以及外周血造血干细胞采集物与动员前骨髓中各类黏附分子表达的差异.结果表明,动员前、采集后及移植重建后骨髓中CD34+细胞对CD54、CD49d和CD62L表达的变化无统计学差异;造血干细胞第1和第2次采集物之间CD34+细胞对CD54、CD49d和CD62L的表达变化也无统计学差异;而造血干细胞采集物中CD34+、CD49+细胞较之动员前骨髓中CD34+CD49d+细胞明显减少(P=0.001).结论:化疗联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的动员方法,可使骨髓中CD34+细胞的CD49d表达下调,并使之动员而进入外周血.移植重建后骨髓中CD34+细胞的CD49d表达趋于正常,其进一步的临床意义有待更多的病例积累予以阐明.
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地塞米松对G-CSF动员供体外周血干细胞及其移植受体造血功能恢复的影响
本研究旨在观察不同动员方法对健康供者外周血造血干细胞的动员效果、采集过程中的不良反应及移植后受者造血功能恢复的影响.2008年1月-2013年5月期间本院43例异基因造血干细胞移植供者分为单纯动员和联合动员两组.单纯动员组采用粒细胞集落刺激因子5-10 μg/(kg·d)皮下注射,动员4-6天开始采集；联合动员组在单纯动员基础上于采集前2-4h给予静脉滴注地塞米松10 mg.观察不同组采集的MNC、CD34+细胞数及其与采集前外周血MNC数的关系,观察采集过程中的不良反应和回输不同组供者造血干细胞后受者造血重建情况.结果表明:两组供者采集造血干细胞数均满足移植需要,单纯动员组采集的MNC及CD34+细胞数均高于联合动员组.两组采集物中MNC与采集前外周血MNC计数均呈正相关；联合动员组采集后血红蛋白及血小板下降幅度较单纯动员组明显.单纯动员组采集过程中不良反应轻微,可以耐受及逆转,联合动员组未出现不良反应.在两组患者预处理方案无统计学差异的情况下,联合动员组相应的受者造血重建时间较单纯动员组明显缩短.结论:在G-CSF动员供体外周血干细胞时加用地塞米松,可以减少外周血造血干细胞采集的不良反应,可采集到足够的造血干细胞数,采集前外周血中MNC计数仍可以作为评估采集物中MNC高低的一项参考指标,特别是联合地塞米松动员干细胞对于受者造血重建有积极意义.
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两步法扩增诱导脐血及动员外周血CD34+细胞来源树突状细胞的比较
为了比较先扩增、后诱导的两步法从脐血(CB)CD34+细胞和动员外周血(MPB)CD34+细胞诱导所得DC的产量及功能,将免疫磁珠分选获得的CB-CD34+细胞和MPB-CD34+细胞用FL、TPO、SCF、GM-CSF等细胞因子先扩增10天,然后加入GM-CSF、IL-4及TNF-α、CD40Ab、PGE2等细胞因子组合诱导获得DC.采用流式细胞仪检测DC表型,混合淋巴细胞培养检测DC刺激异基因T细胞增殖能力,ELISA法检测DC分泌IL-12能力,Transwell板检测DC在次级淋巴组织趋化因子(SLC)介导下的趋化功能.结果表明: ①扩增10天时CB组、MPB组细胞中CD14+CD1a-细胞含量无显著差异[(40.48±16.85)% vs (28.07±23.19)%, P＞0.05].但由于CB组细胞扩增倍数显著高于MPB组(388.88±84.63倍vs 79.67±10.32倍, P＜0.01),CB组CD14+CD1a-细胞扩增倍数显著高于MPB组(189.42±25.02倍vs 28.74±23.27倍, P＜0.01); ②TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下与TNF-α条件下相比,CB组和MPB组所得DC均表达更高的CD83[分别为(34.52±11.22)% vs (3.70±2.27)%、(36.69±13.36)% vs (7.34±3.364)%, P均＜0.01]; ③CB组与MPB组在TNF-α/CD40Ab/PGE2诱导条件下所得DC均高水平表达CD83、CD86、HLA-DR、CD11c、CD54、CD40,CB组所得CD83+细胞的扩增倍数显著高于MPB组(198.72±117.53倍vs 33.95±6.19倍,P＜0.01); ④CD40Ab/PGE2/TNF-α条件下CB与MPB来源的DC在刺激异基因T细胞增殖、IL-12的分泌[(16.2±4.31)pg/ml vs (13.5±4.1)pg/ml]以及SLC介导的迁移率[(28.09±7.76)% vs (18.5±3.47)%]上均无显著差别(P均＞0.05).结论: 在两步法培养体系下,CB-CD34+细胞与MPB-CD34+细胞来源的DC具有相同的功能,而前者产量显著高于后者.
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Caspase-3在脐血CD34+细胞中的表达及意义
为探讨脐血CD34+细胞在不同细胞因子支持下体外扩增过程中caspase-3表达及意义,采用RT-PCR,Western blot和流式细胞术对脐血CD34+细胞在体外扩增过程中的细胞增殖、细胞凋亡及caspase-3的表达进行了测定.检测结果显示,caspase-3 mRNA在新鲜分离的脐血CD34+细胞中低水平表达,在细胞因子支持下体外培养3天,扩增的CD34+细胞中caspase-3 mRNA和蛋白质水平表达上调,但在这两种细胞中仅能检测到分子量为32kD的非活性酶原形式的caspase-3,随着体外培养时间的延长,在无早期效应细胞因子sCF或FL存在的条件下,caspase-3被激活,可检测到分子量为20 kD的裂解片段,细胞凋亡率增加.结论:虽然造血干/祖细胞的凋亡是个复杂的过程,但在脐血CD34+干/祖细胞体外扩增过程中,caspase-3参与了细胞凋亡事件并发挥着重要的作用,早期效应细胞因子SCF和FL可减少造血干/祖细胞的凋亡,对造血干/祖细胞有保护作用.
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转染外源性FasL的CD34+细胞诱导同种抗原特异性T细胞凋亡的实验研究
为探讨通过Fas/FasL途径选择性去除移植物中成熟T细胞的可能性,本研究借助反转录病毒途径,以FasL基因转染骨髓CD34+细胞,与经过富集的T细胞进行单向混合培养(刺激细胞/效应细胞比例为5:1),加入或不加入IFN-γ,IL-2,应用原位末端标记法(TUNEL)和流式细胞术(FCM)检测培养5天后的细胞凋亡率,并比较两种细胞因子对移植物中CD34+细胞的影响.以转染外源FasL的CD34+细胞为刺激细胞,T细胞凋亡率为(12.1±1.5)%[对照组为(3.2±1.1)%,P＜0.01];经IFN-γ或IL-2作用后,转染细胞诱导T细胞的凋亡率分别上升至(20.1±2.3)%,(17.6±1.3)%(P＜0.01);且IL-2对CD34+细胞Fas抗原的表达无明显影响.上述结果表明,转染外源FasL的骨髓CD34+细胞可诱导同种抗原特异性T细胞凋亡,IFN-γ和IL-2增强上述致细胞凋亡作用,且IL-2更有利于临床应用;提示该方案可选择性清除移植物中同种抗原特异性T细胞,可望为临床上防治移植物抗宿主病(GVHD)提供新的途径.
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山东脐血库保存4000人份脐血资料的统计分析
对山东脐血库保存的4000人份脐血的部分结果进行了统计分析,每份脐血的平均有核细胞数超过1.2×109,每份脐血CD34+细胞总量平均为3.9×106,有768人份脐血有核细胞数超过1.5×l09,一般可满足体重40kg以上的患者使用.对基因频率的分析表明,常见基因与中国其他地区的统计结果相近,有40%的患者可以在山东脐血库找到1个位点不合的脐血.
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阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血清对CD34+细胞生长的影响
为探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者血清对造血干/祖细胞增殖的影响,应用单个细胞培养及液体、半固体群体细胞培养方法,将病人血清与正常人血清分别加入培养体系中,观察不同血清对正常人及病人正常及异常表型的CD34+细胞的直接影响.发现在单个细胞培养条件下,加入PNH血清与加入正常人血清时,正常人及PNH两种表型的CD34+细胞在细胞分裂、集落形成、较大集落形成的比例、单个细胞扩增能力及细胞总数诸方面均无明显差别(P＞0.05).在半固体集落培养时,加入病人或正常人血清,对正常人及病人正常表型CD34+细胞的集落形成能力的影响无显著差异(P＞0.05),而病人CD34+CD59-造血干/祖细胞的集落形成率在加入病人血清组高于加入正常人血清组(P＜0.05).结果说明,在单个细胞及群体细胞液体培养条件下,加入病人血清与加入正常人血清,对正常人以及病人正常或异常表型造血干/祖细胞生长的影响无显著差别,而在半固体培养条件下,则显示病人血清更有利于患者的异常表型CD34+细胞的集落生成.
关键词： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症 CD34+细胞 造血干/祖细胞 血清 -
造血干/祖细胞体外定向诱导分化为粒细胞的研究
为探讨利用人造血干/祖细胞体外定向诱导分化的人粒细胞应用于临床大剂量放、化疗后预防感染的可行性,利用源自人胎盘脐带血的CD34+细胞及SCF,IL-3,IL-6和G-CSF的细胞因子组合的培养条件,体外进行向粒细胞的诱导分化.结果表明,在该体系条件下可诱导分化出约1000倍数量的细胞,流式细胞仪检测诱导效率可达60%以上,且诱导分化的细胞染色体未出现异常,裸鼠致瘤实验表明该细胞不具致瘤性,细胞体外生长14-21天为高峰,33天后细胞不再增殖,且诱导分化出的细胞具有吞噬细菌的功能.结论:利用细胞工程的方法体外"生产"出的粒细胞具有应用安全性,且具备生理状态下产生的此种细胞应具备的基本功能,为其临床应用提供了基础.
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化疗联合G-CSF动员的骨髓及外周血CD34+细胞表达粘附分子的变化
探讨化疗联合G-CSF动员前、后患者骨髓及外周血CD34+细胞表达CD44,CD49d,CD62L及趋化因子CXCR4的动态变化,用免疫荧光直接三色标记和流式细胞术测定G-CSF动员前、后骨髓及外周血CD34+细胞的CD44,CD49d,CD62L及趋化因子CXCR4的表达,观察输注各表达亚群细胞数与移植后造血重建的关系.结果发现,动员后骨髓中CD34+CD44+和CD34+CD49d+细胞的百分比较动员前明显降低,而外周血中二者的比例则显著升高;动员前、后骨髓中CD34+CD62L+和CD34+CXCR4+细胞的变化并不明显,而外周血中前者明显增加,后者则显著减少.输入CD44+,CD49d+,CD62L+及CXCR4+的CD34+细胞的量与移植后血中中性粒细胞和血小板恢复的时间未表明有显著的相关.结论:G-CSF动员可下调骨髓CD34+细胞的CD44,CD49d,CD62L及CXCR4的表达,从而进入外周血循环,输注这些细胞的临床意义有待累积更多病例的分析.
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应用SCF+IL-2等细胞因子从脐血CD34+细胞扩增T细胞
肿瘤和艾滋病(AIDS)的基因治疗或免疫治疗的研究需要大量的T细胞克隆.尽管T细胞来源于CD34+细胞,但由于需要胸腺组织的参与,使其在体外扩增大量细胞克隆非常困难.本研究用脐血单个核细胞作为辅助细胞,在SCF+IL-2等细胞因子的作用下,人脐血CD34+在此培养条件下,不断产生CD4+或CD8+T细胞至少持续3周.在培养扩增过程中,发现CD4+和CD8+T细胞的比例有一个不断变化的动态过程,培养体系中可以检测到CD4和CD8双阳性细胞的存在;RT-PCR可检测到负责TCR重排的RAG-2基因的表达,说明所获得的T细胞来源于CD34+细胞.本研究为从CD34+细胞获得大量的T细胞克隆提供了一个简便的体外培育体系.
