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Flt3和c-kit在脐血CD34+干/祖细胞中功能性表达及意义
为了解作用于早期造血的细胞因子受体Flt3和c-kt在脐血CD34+造血干/祖细胞中的表达及功能,从蛋白和基因水平对其进行了研究.采用常规双色直接免疫荧光标记法,使用流式细胞术测定新鲜分离的和体外不同培养时间的脐血CD34+造血干/祖细胞中Flt3和c-kit蛋白水平的表达,用RT-PCR法测定Flt3和c-kit的mRNA水平表达,并在体外对受体功能进行了探讨.研究结果显示,新鲜脐血CD34+细胞中(68.8±15.4)%为Flt3+,(50.6±12.7)%为c-kit+,随着体外培养时间的延长,二者表达逐渐下降.结论:脐血CD34+造血干/祖细胞在体外液体培养条件下Flt3和c-kit阳性表达可维持2-3周,其配体FL和SCF在培养的第1周内对细胞扩增效果显著.
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动员外周血CD34阳性细胞流式细胞术测定中的策略探讨
探索用流式细胞术测定动员外周血中CD34+细胞的简便有效的方法,以便在干细胞动员中进行有效的动态监测,及时收取干细胞,把握佳移植效果.将经药物动员的移植供者的外周血用CD34和CD45荧光抗体标记,用红细胞裂解液将红细胞裂解后经流式细胞仪检测.运用恰当的分析窗口、有效的设门分析结合干细胞的生物学特性,确定CD34+细胞在窗口中的确切位置,统计CD34+细胞在有核细胞中的比例.结果表明,通过本方法可有效地测定0.05%-0.1%的CD34+细胞的相对含量,在药物动员的第5或6天,多数患者外周血中CD34+细胞达到峰值,某些患者外周血中CD34+细胞可超过1%.结论:通过标记中的有效阻断和多参数分析,本方法可对动员外周血中微量的CD34+细胞进行有效的动态监测,对适时采集干细胞进行移植提供了重要的参考.
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脐血造血干/祖细胞表面CD95/Fas抗原和Bcl-2的表达和功能研究
对人脐血干/祖细胞表面CD95/Fas抗原及Bcl-2的表达和功能特征进行了研究.新鲜分离的脐血CD34+细胞表达低水平CD95,体外培养中联合应用细胞因子如SCF和FL可上调CD95表达,负调控因子例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)可进一步增加其表达量.将CD34+细胞与抗-CD95单克隆抗体共同孵育,通过活细胞记数、流式细胞术、集落形成细胞(CFU-C)及长期培养启动细胞(LTC-IC)的分析,研究了CD95介导的功能特性.抗-CD95单抗与TNF-α或IFN-γ组合条件下,活细胞记数和CFU-C计数分别为31.9±11.2和43±2.0,LTC-IC生成受到抑制,细胞凋亡率为42.9±12.4.而抗-CD95单抗在无细胞因子存在条件下或抗-CD95单抗与早期效应细胞因子SCF和FL组合条件下诱导的凋亡率很低.细胞浆内增加的Bcl-2水平和脐血CD34+细胞表面CD95的关系表明Bcl-2可能对CD95介导的CD34+细胞的凋亡起保护作用.
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骨髓增生异常综合征患者骨髓CD34+细胞 Fas,FasL及Bcl-2的表达和凋亡
为了观察骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓CD34+细胞Fas,FasL和Bcl-2的表达和凋亡情况并探讨这些抗原的表达和细胞凋亡的关系.采用流式细胞术测定了26例MDS和10例急性髓系白血病(AML)患者及6例非血液病患者(对照)骨髓CD34+细胞的Fas,FasL和Bcl-2表达率和细胞凋亡率.结果显示,各型MDS患者CD34+细胞Fas和FasL表达率较对照组明显增加(P＜0.01),Bcl-2的表达率除难治性贫血/环形铁粒幼细胞性难治性贫血(RA/RAS)与对照组无显著差异(P＞0.05)外,难治性贫血伴有原始细胞增多(RAEB)和转变中的难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB-t)患者均明显高于对照组(P＜0.01);各型MDS间CD34+细胞Fas的表达率相近,而Bcl-2的表达率却存在非常显著性差异,即RA/RAS＜RAEB＜RAEB-t;RA/RAS和RAEB患者CD34+细胞的凋亡率显著高于对照组,而RAEB-t患者与对照组间无显著差异,AML患者则明显低于对照组;CD34+细胞Fas或FasL的表达率与凋亡率间无相关关系,而Bcl-2表达率和细胞凋亡率间存在负的相关关系.结论:MDS患者CD34+细胞的凋亡受多因素的调节;Bcl-2是抑制细胞凋亡的重要因素;MDS向AML进展过程中CD34+细胞存在从凋亡过度到凋亡减少的改变.
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再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征患者骨髓CD34+细胞及其G-CSFR、GM-CSFR的表达和意义
本研究探讨再生障碍性贫血(AA)和骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓CD34+细胞表面粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)和粒-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)的表达.分离27例AA患者、45例MDS患者和20例正常对照者的骨髓单个核细胞(BMMNC),用流式细胞术观察BMMNC中CD34+细胞比率和CD34+细胞表面G-CSFR、GM-CSFR表达率与外周血中性粒细胞数的关系.结果发现,CD34+细胞比率在AA组显著低于对照组,MDS组显著高于对照组,AA组显著低于MDS组,骨髓增生异常综合征-难治性贫血伴原始细胞增多(MDS-RAEB)组显著高于骨髓增生异常综合征-难治性贫血(MDS-RA)组或对照组,MDSrRA组显著高于AA组(P均＜0.05);MDS-RA组与对照组无显著性差异(P＞0.05).各组BMMNC中CD34+细胞表面G-CSFR表达率在AA组、时照组、MDS组、MDS-RA组及MDS-RAEB组均无显著性差异(P均＞0.05).各组BMMNC中cD34+细胞表面的GM-CSFR的表达率在AA组与对照组无显著性差异(P＞0.05),MDS组显著高于对照组或AA组(P均＜0.05),MDS-RA组与MDS-RAEB组无显著性差异(P均＞0.05).SAA患者BMMNC中CD34+细胞的比率显著低于CAA患者(P＜0.05),AA患者CD34+细胞表面的G-CSFR和GM-CSFR表达率与诊断时外周血中性粒细胞计数均无相关性(r=0.058和,r=0.044);MDS患者BMMNC中的CD34+细胞的比率与诊断时外周血中性粒细胞数没有相关性(r=-0.335),其CD34+细胞表面的G-CSFR和GM-CSFR表达率与诊断时外周血中性粒细胞数亦无相关性(r=0.064和r=0.051).结论:AA及MDS患者骨髓CD34+细胞占BMMNC的比率及其表面G-CSFR、GM-CSFR的表达率的测定有助于二者的诊断和鉴别诊断.
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四色流式细胞术分析骨髓增生异常综合征原始细胞免疫表型
为了研究骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓原始细胞免疫表型特征,应用四色流式细胞术对常规设门及二次设门策略选取的29例MDS患者的骨髓细胞悬液中,CD34+细胞进行免疫表型分析.结果表明:①随着MDS的进展(RA/RAS→RAEB→RAEB-T),根据CD45/SSC图中选取的原始细胞群中,CD34+细胞比例逐渐增高,分别为8.0%、46.4%、76.8%,各亚型之间差别有显著意义(P＜0.05).②在CD45vsSSC散点图上,设门所取的原始细胞抗原表达随着RA/RAS→RAEB→RAEBT的进展,HLA-DR、CD13、CD33、CD117表达逐渐增高,CD15表达逐渐减低,差别均有显著意义(P＜0.05).③在CD45 vs CD34散点图上二次设门取CD34+原始细胞行抗原表达的分析,同样异常表达HLA-DR及髓系抗原CD13、CD33和CD117,比例高于常规分析法(P＜0.05),CD15比例减低,在RA/RAS中CD13、CD33、CD117和HLA-DR的表达较常规分析的原始细胞比例明显增高(P＜0.05),相关抗原的表达率在各亚型间差别无显著意义(P＞0.05).结论:常规设门法能反映MDS疾病的进展,而二次设门策略则更能反映MDS原始细胞的生物学特征,CD34的异常表达代表原始细胞的不成熟性和异质性,在临床高度怀疑但形态学和细胞遗传学不能诊断时,原始细胞免疫分型对MDS的诊断更具意义.
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流式-荧光原位杂交技术在骨髓增生异常综合征患者骨髓CD34+细胞相对端粒长度检测中的应用
本研究旨在初步探讨流式-荧光原位杂交(Flow-FISH)技术在骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓细胞亚群端粒长度测定中的可行性.7例初治低危MDS患者为实验组,7例年龄、性别匹配的营养性贫血患者为对照组.收集肝素抗凝骨髓,以Molt-4细胞株为内对照细胞,以CD34-Alexa Fluor(R)647标记细胞表面抗原,高温变性DNA后与FITC标记端粒探针进行荧光原位杂交,DNA复染后,采用四色流式细胞术检测骨髓有核细胞和CD34+细胞的相对端粒长度(RTL).结果显示:实验组和对照组骨髓有核细胞经变性、杂交后,可进行细胞亚群的端粒长度检测.检测结果显示MDS患者骨髓CD34+细胞RTL显著短于骨髓有核细胞(P =0.001)；与对照组相比,MDS患者骨髓有核细胞RTL及CD34+细胞RTL均显著缩短(P分别为0.020和0.002).结论:通过耐热荧光抗体对特定细胞进行标记,Flow-FISH技术可用于细胞亚群RTL检测,值得进一步探索.
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脐血和骨髓来源的CD34+细胞体外扩增巨核祖细胞差异的研究
本研究探讨脐血(CB)和骨髓(BM)来源的CD34+ 细胞体外扩增巨核祖细胞的差异.采用Ficoll-Hypaque分离法分离人CB及BM单个核细胞,免疫磁珠法制备CD34+细胞,在含血小板生成素(TPO)、TPO+白介素11(IL-11)或TPO+IL11+肝素的无血清液体培养体系中培养14天.流式细胞术检测扩增产物(CD34+、CD41a+及CD34+CD41a+细胞)免疫表型、巨核细胞凋亡率及DNA含量,并以集落形成单位测定法进行粒巨-噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、红系爆式集落形成单位(BFU-E)及巨核细胞集落形成单位(CFU-Mk)计数.结果表明:14天培养中,CB来源细胞在总细胞数、CD41a+ 及CD34+ CD41a+细胞扩增倍数上均高于BM(P均＜0.05).0天CB及BM来源CD34+ 细胞在CFU-GM、BFU-E及总的CFU-Mk的形成能力上无显著性差异(P均＞0.05),但CB来源CD34+ 细胞形成的CFU-Mk以大集落为主,其数量高于BM(P＜0.05);在培养7、10和14天,CB及BM来源细胞CFU-GM扩增倍数无显著性差异(P均＞0.05),但CB来源细胞的BFU-E及总的CFU-Mk扩增倍数均高于BM(P均＜0.05).14天培养中CB和BM来源巨核细胞的凋亡率无显著性差异(P均＞0.05).DNA含量检测发现,14天培养中CB来源巨核细胞始终以2N细胞为主(比例＞90%),而BM来源巨核细胞随着培养时间延长,4N、8N及以上倍体巨核细胞比例逐渐增加.结论:CB来源CD34+细胞体外扩增巨核祖细胞能力高于BM,它可能是巨核祖细胞体外扩增较好的来源.
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TLR2和TLR4激动剂对人脐血CD34+细胞迁移能力的影响
本研究旨在探讨Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)和TLR4激动剂对人脐血CD34+细胞迁移功能的影响及其机制.采用流式细胞术检测脐血CD34+细胞表面TLR2和TLR4的表达情况;用趋化实验和黏附实验观察PAM3CSK4(TLR2激动剂)和LPS(TLR4激动剂)对人脐血CD34+细胞的迁移活性和黏附活性的影响.结果表明:人脐血CD34+细胞表面表达TLR2(14.2±3.8)%和TLR4(19.6±4.1)%.与对照组相比,LPS可明显抑制SDF-1诱导的CD34+细胞的趋化作用(p<0.01),但LPS对CD34+细胞的黏附能力,以及PAM3CSK4对CD34+细胞的趋化和黏附能力均无明显影响.进一步研究显示,LPS对CD34+细胞表面CXCR4的表达无明显影响,但可明显抑制CD34+细胞的自发迁移作用(p<0.05).结论:TLR4的活化可显著降低SDF-1诱导CD34+细胞的趋化功能,这可能与其抑制CD34+细胞的自发迁移作用具有一定的关系.
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间充质干细胞对脐血CD34+细胞扩增及其细胞特性变化的影响
本研究探讨脐带间充质干细胞(MSC)对CD34+ 细胞(HSPC)体外扩增的支持作用及对CD34+ 细胞表面标志、归巢黏附分子、集落形成能力等干细胞特征变化的影响.用免疫磁珠法从新鲜分离的脐血单个核细胞分离CD34+ 造血干祖细胞(HSPC);用MSC饲养层(feeder)制备经137 Cs 照射的间充质干细胞饲养细胞(MSC feeder cells).将CD34+ 细胞接种在不同的培养体系中,实验分为3组:HSPC+CK组为培养液中加入细胞因子组合(SCF、FL和TPO),HSPC+MSC组为CD34+ 细胞接种在MSC feeder 上,HSPC+MSC+CK组同时加入细胞因子组合及MSC饲养细胞.培养后4、7、10、14天计数有核细胞总数(MNC),计算细胞扩增情况;用流式细胞术检测不同处理组间CD34+ 细胞及亚群免疫表型、归巢黏附分子和集落形成能力.结果表明:在2周的培养时间里,3组MNC和CD34+ 细胞均明显增加,MNC扩增数依次HSPC+MSC+CK组＞HSPC+CK组＞HSPC+MSC组.体外扩增10天内HSPC+MSC+CK组MNC得到大量的扩增,同时CD34+细胞的扩增亦较高.培养4天3组细胞CD34+比例较0天有明显下降(P＜0.01);扩增后CD34+ 细胞比例:HSPC+MSC组＞HSPC+MSC+CK组＞HSPC+CK组(P＜0.01);各组CD34+细胞亚型细胞比例有所不同,HSPC+CK组4天时CD34+ CD38-细胞有一过性升高(62.71%),之后迅速降低,7天时为0.05%;HSPC+MSC组7天时CD34+ CD38-细胞比例为18.92%,与HSPC+CK组比较差异有统计学意义(P＜0.05).从集落形成分析结果看出:MSC、细胞因子混合组扩增后细胞集落形成能力在不同时间点均维持在较高水平.结论:脐血CD34+细胞在体外短期培养(＜7天)下,MSC和细胞因子联合应用能同时使CD34+细胞得到明显的扩增并维持造血干祖细胞的生物学特征.
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人参二醇促骨髓CD34+细胞增殖和分化的研究
本研究探讨人参二醇(PDS)对正常人骨髓CD34+细胞的促进增殖和诱导分化作用.用吸附单克隆抗体的免疫磁珠技术从正常人骨髓分离出CD34+细胞,采用琼脂半固体多向祖细胞集落(CFU-Mix)培养方法观察PDS对CD34+细胞的增殖作用;用液体培养使CD34+细胞增殖,并向红系、粒系定向生长,用流式细胞仪分析PDS诱导后细胞表面标记变化.结果显示:免疫磁珠分离CD34+细胞的获得率占骨髓有核细胞(MNC)的(1.0±0.15)%;活细胞比例占(95.6±1.2)%,CD34+细胞富集度达(86.8±2.8)%.中浓度PDS(25 mg/L)能够有效地促进CD34+细胞增殖,生成CFU-Mix集落,提高率为(56.3±3.5)%,与对照相比较有显著差异(p＜0.01).液体培养生成粒系、红系细胞的数量明显增高,与对照相比差异有显著性,提高率分别为(35.6±3.2)%和(22.3±2.1)%,与对照相比差异有显著性(p＜0.01),且呈剂量依赖性.经PDS诱导14天后,细胞表面分化标记明显增高,CD33+细胞在PDS 50 mg/L时高,CD71+细胞在25 mg/L时高,G-A+细胞在10 mg/L时高,而CD15+细胞数量无明显变化.结论:PDS不但促进CD34+细胞增殖,且能诱导其定向分化,提示PDS具有类似造血生长因子和协同生长因子的效应.
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人脐带间充质干细胞条件培养基体外支持造血的功能
本研究旨在探讨单纯人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的条件培养基对脐血CD34+细胞体外造血支持作用.分离得到的hUC-MSC以2 × 106接种于75 cm2培养瓶中,48 h后收集培养上清作为条件培养液.用人脐血CD34阳性分选试剂盒分选CD34+细胞.将CD34+细胞接种在3个培养体系中:hUC-MSC条件培养液+不完全甲基纤维素培养基、完全甲基纤维素阳性培养基和含10％胎牛血清的DMEM/F12+不完全甲基纤维素作为阴性培养基.培养14 d观察集落的形态特征,统计细胞数≥50的造血集落单位数.流式细胞术检测组成集落形成单位的细胞免疫表型.结果表明:hUC-MSC条件培养基中能够形成集落形成单位,且以粒系和粒-巨噬集落形成单位为主(CFU-G 47.67±0.58 、CFU-GM 48.67±4.73 、CFU-M 3.00±2.00),未观察到红细胞系相关的集落形成单位.阳性培养基中各种集落形成单位均可见,阴性培养体系中无集落形成单位.流式细胞术检测条件培养基组CD45+细胞比例为(97.43±2.15)％,显著高于阳性对照中CD45+细胞比例(39.69±0.96)％ (P ＜0.05).结论:在体外hUC-MSC条件培养基能够促进CD34+细胞的发育分化,单纯hUC-MSC条件培养基具有造血支持功能,并促进CD34+细胞向髓系分化,但不能促进向红细胞分化.
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红细胞裂解液对CD34+细胞相对计数的影响
为了研究红细胞裂解液对CD34+细胞相对计数结果的影响,对37份外周血干细胞采集物进行CD34-PE及CD45-FITC双色免疫荧光染色后用FACS裂解液(FACSTM lysing solution,FACS)、IOTest(R)3裂解液(IOTest(R)3lysing solution,IOTest)及自配裂解液溶解红细胞,采用洗涤程序和运用ISHAGE设门策略,检测CD34+细胞相对数,同时记录细胞的前向散射(forward scatter,FSC)、侧向散射(side scatter,SSC)信号及CD45+细胞百分比.结果表明,FACS处理的样本CD34+细胞百分比低于IOTest(0.50±0.42vs0.92±0.59,p=0.004);而IOTest与自配红细胞裂解液处理结果的差异无统计学意义(0.92±0.59vs0.95±0.64,p=0.902).经IOTest裂解后细胞的FSC、SSC信号均显著高于FACS(p＜0.01).IOTest裂解后的样本CD45+细胞百分比低于FACS.WBC数的多少与CD34+细胞百分比不存在相关关系(rs=0.192,p=0.357).结论:某些红细胞裂解液对CD34等抗原阳性细胞的相对计数确有不良影响,用流式细胞术检测或计数时应慎重选择红细胞裂解液.
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脐带血血浆分离培养脐带间充质干细胞及体外扩增人脐血CD34+细胞的研究
目的:探讨以脐带血血浆替代胎牛血清体外分离培养脐带间充质干细胞(UCMSC)的可行性,并观察其作为滋养层细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用.方法:收集符合广州脐血库供者合格筛选标准的脐带血,在脐带血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养.采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得UCMSC,将其分为3组.培养第1和第2组以DMEM/F12为基础培养液,分别添加胎牛血清(FBS)和混合脐带血血浆(UCP),第3组为商品化无血清培养液(StemPro(R) MSC SFM CTSTM).经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行MSC成骨、成脂分化鉴定.取冻存复苏后的3组细胞,标记为UCMSCFBS、UCMSCUCP及UCMSCSFM,分别建立滋养层.应用免疫磁珠分选系统(MACS)分选人脐带血CD34+细胞,在添加造血因子组合(StemSpan(R)CC100)的CD34+无血清培养液(StemPro-34 SFM)中培养,并根据滋养层的不同,分为4组:A组CD34+细胞(CD34+ cells)为空白对照组;B组为FBS滋养层组(UCMSCFBS+ CD34+ cells),C组为UCP滋养层组(UCMSCUCP+ CD34+ cells),D组为SF滋养层组(UCMSCSFM+ CD34+cells).于培养第0天和第7天计数各组的有核细胞数(NC)、流式细胞仪检测CD34+比例,并进行造血祖细胞集落培养,评估扩增效率.结果:在3种培养体系下的UCMSC均呈现典型的梭形漩涡状生长,MSC表面标记的表达谱系基本无差异,均具有向成脂、成骨分化的能力,但在UCP培养条件下细胞的扩增能力显著高于其他2组(P＜0.05).经过7d与脐带血CD34+细胞的共培养,虽然4组的CD34+细胞比例均下降,但NC及CD34+细胞数均得到显著扩增,其中UCMSCUCP滋养层组和UCMSCSFM滋养层组均大于UCMSCFBS滋养层组和空白对照组(P＜0.05).与第0天的集落形成能力比较,UCMSCUCP滋养层组与UCMSCSFM滋养层组的集落扩增倍数无差异,但前者的扩增倍数高于UCMSCFBS及空白对照组.结论:UCP可作为一种较为理想的无动物源性的血清补充物,用于UCMSC的分离培养并维持其生长、增殖、分化,是临床级MSC大量扩增培养体系较为安全的选择.
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直接转染HOXB4基因和转染HOXB4基因的脐带间充质干细胞体外扩增人脐血CD34+细胞的研究
本研究探讨直接转染HOXB4基因和转染HOXB4基因的人脐带间充质干细胞体外扩增人脐血CD34+细胞中有核细胞数、CD34+细胞比例与扩增倍数、细胞周期及集落形成能力的异同.将人脐带间充质干细胞(HUC-MSC)分为2组,1组利用慢病毒载体将HOXB4基因转染至HUCMSC并建立滋养层(HOXB4-HUCMSC),另1组建立未转染的滋养层(HUCMSC).应用免疫磁珠分选系统(MACS)分选出人脐血CD34+细胞,在含细胞因子的培养液中培养48 h后分5组,其中对照组2组:A组CD34+细胞(CD34+ cells)为空白对照组,B组空病毒转染CD34+细胞(GFP-CD34+ cells)为阴性对照组;实验组共3组:直接转染HOXB4基因组(HOXB4-CD34+ cells)为C组;HUCMSC滋养层组(HUCMSC+ CD34+ cells)为D组;HOXB4-HUCMSC滋养层组(HOXB4-HUCMSC+ CD34+cells)为E组.于培养第6、10、14 d计数有核细胞数(NC),第10 d比较不同处理条件对CD34+细胞比例、细胞周期与集落形成能力的影响.结果表明,利用慢病毒载体可将HOXB4基因转染至HUCMSC并检测到表达,成功建立了HUCMSC与HOXB4-HUCMSC滋养层.经过14 d体外培养,5组有核细胞均得到显著扩增,比较表明,其效果依次为HOXB4-HUCMSC滋养层组＞直接转染HOXB4基因组＞HUCMSC滋养层组＞2对照组(P＜0.05).在体外扩增第10 d,5组有核细胞CD34+比例均大幅下降,经计算实验组CD34+细胞扩增倍数较第0d显著增高,经比较显示,CD34+细胞比例与扩增倍数高低依次为直接转HOXB4基因组＞HOXB4-HUCMSC滋养层组＞HUCM-SC滋养层组＞两对照组(P＜0.05);流式细胞仪分析细胞周期表明,实验组的S+G2/M期比例较对照组高,其中HOXB4-HUCMSC滋养层组比例高,为41.57％,高于直接转染HOXB4基因的37.87％与HUCMSC的滋养层组的28.65％ (P ＜0.05).HOXB4-HUCMSC滋养层组与直接转HOXB4基因组的集落形成能力无差别,但均高于HUCMSC滋养层组与对照组.结论:HOXB4-HUCMSC滋养层可显著扩增CD34+细胞并可保持其于细胞活性,与直接转染HOXB4基因的CD34+细胞可能产生的潜在致病性基因插入和致突变性风险相比较,HOXB4-HUCMSC滋养层对CD34+细胞的体外扩增相对更安全,有潜在的应用价值.
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脐带血来源的间充质干细胞对CD34+细胞增殖的支持作用及其机制
目的:探讨脐带血来源的间充质干细胞体外支持造血干细胞扩增的能力及所涉及的可能机制.方法:将来源于脐血的造血干细胞与间充质干细胞共培养14 d,然后计数造血干细胞数与集落形成单位.ELISA方法检测间充质干细胞培养上清中含有的细胞因子.结果:与间充质干细胞共培养的造血干细胞增殖率明显高于单独培养的造血干细胞(P＜0.05).此外,在培养体系中添加外源性细胞因子可明显提高造血干细胞增殖率(P＜0.05).间充质干细胞能分泌多种细胞因子,包括GM-CSF、IL-7、IL-8、IL-11、SCF和SDF-lα.结论:脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可用于体外扩增造血干细胞,间充质干细胞分泌的细胞因子可能介导MSC对HSC增殖的支持作用.
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TLR2和TLR4活化的骨髓间充质干细胞对人脐血CD34+细胞迁移能力的影响
目的:本研究旨在探讨Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)和TLR4活化对人骨髓源性间充质干细胞(BM-MSC)诱导人脐血CD34+造血干/祖细胞迁移功能的影响及其机制.方法:流式细胞术检测健康供体BM-MSC表面TLR2和TLR4的表达情况;TLR2激动剂(PAM3 CSK4)和TLR4激动剂(LPS)活化人BM-MSC,收集培养上清,趋化实验测定BM-MSC培养上清对人脐血CD34+细胞的趋化作用;了解TLR2或(和)TLR4的活化对BM-MSC诱导CD34+细胞迁移活性的影响.ELISA法定量检测培养上清中趋化因子SDF-1的分泌水平.结果:人BM-MSC表面表达TLR2水平分别为(31.5±4.6)％和TLR4(85.6±6.7)％.与未加培养上清的空白组相比,对照组、LPS和/或PAM3 CSK4活化的MSC的培养上清对CD34+均有明显趋化作用(P＜0.01).进一步研究显示,与未加激动剂的对照组(MSC上清组)相比,LPS组、PAM3CSK4组、LPS和PAM3CSK4联合刺激组的MSC培养上清诱导CD34+细胞的迁移均有显著促进作用(P＜0.05),但LPS组、PAM3CSK4组、LPS和PAM3CSK4联合刺激组的培养上清中,SDF-1浓度与对照组相比未见明显变化(P＞0.05).结论:TLR2和/或TLR4的活化可显著增强骨髓BM-MSC诱导人脐血CD34+细胞的迁移作用,但与趋化因子SDF-1无明显关系.
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人脐血贴壁细胞生物学特点的观察
为了探讨人脐血贴壁细胞分离培养的可行性,分离人脐血CD34+细胞进行Dexter培养,观察贴壁细胞的生物学特点.结果表明:Dexter培养9-14天(平均11.2天)时贴壁细胞集落开始形成,15-22天(平均19.6天)时集落数量多,培养28天贴壁细胞铺满培养皿底.细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、"小圆"类细胞为主.细胞化学染色显示:非特异性酯酶染色(NSE)、糖原染色(PAS)100%为阳性,过氧化物酶染色(POX)为阴性,碱性磷酸酶(ALP)28%为阳性.免疫组织化学染色显示:CD106阳性达96%,CD29阳性为93%,CD44阳性为98%,CD45为阴性,CD50%阳性为62%.纤维粘连蛋白(Fn):92%阳性;层粘连蛋白(Ln):74%阳性;胶原Ⅳ:83%阳性.结论:人脐血CD34+细胞群中存在造血基质细胞的前体细胞,人脐血贴壁细胞具有造血基质细胞的某些生物学特点.
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流式细胞术计数CD34阳性细胞的标准化与质量控制
用流式细胞术计数脐带血,外周血及其采集物中的CD34+细胞数已被普遍采用.然而,不同实验之间的CD34+细胞计数差异非常大.本文就影响结果的主要因素,目前国际上采用的标准化方案和不同方案之间的比较进行综述.我们实验室应用ProCOUNT试剂盒检测了45例脐带血,12份正常骨髓和4例外周血采集物中的CD34+细胞的数量,结果表明ProCOUNT为标准化程度较高的方法,有利于减少不同实验之间CD34+细胞计数的差异.
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免疫磁性分选系统大量分选CD34+细胞的实验研究
CD34+细胞的分离纯化在自体外周血干细胞、异基因骨髓移植/外周血干细胞移植及干细胞研究中具有重要的应用价值.为了摸索大量分选CD34+细胞的方法,本研究应用Isolex300i磁性分选系统富集CD34+细胞,采用流式细胞术监测分选前后细胞表面标志,经CD34+细胞体外增殖实验及克隆形成实验验证分选获得的CD34+细胞生物学活性.结果显示,所完成的5例次自体外周血富集CD34+细胞时,先收获单个核细胞约(3.5-6.0)×1010,CD34+细胞占单个核细胞百分率为(0.55-1.2)%;收获的CD34+阳性细胞总数为(2-3)×108,纯度为(75-85)%,回收率为(40-65)%.体外实验表明,在SCF+IL-3+FL+TPO+EPO存在下,经过3-4天培养,可扩增2-3倍;经CFU-GM、BFU-E集落形成实验显示具有形成集落的能力,证实分选后细胞具有造血祖细胞生物活性.结论:应用Isolex300iCD34+细胞分选仪可以高效大量富集CD34+细胞,适于临床应用.
