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人脐带间充质干细胞对肝癌细胞Hep3B增殖影响的研究
目的:研究人脐带间充质干细胞在体外对Hep3B增殖的影响.方法:体外分离培养hUC-MSCs,构建Transwel 非接触式共培养体系,通过WST-1法测定Hep3B的增殖情况.结果:混合细胞共培养24h后,hUC-MSCs:Hep3B=1:5组Hep3B增殖与对照组无明显差异(P>0.05),hUCS-MSCs:Hep3B=1:l与5:l组与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05).48h、72h后,实验组与对照组相比均具有显著差异(P<0.01).结论:hUC-MSCs在体外可抑制Hep3B肝癌细胞的增殖.
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脐带间充质干细胞移植对老年痴呆小鼠 SAMP8学习记忆的影响
目的：探讨脐带间充质干细胞（HUMSCs）移植对老年痴呆小鼠 SAMP8学习记忆能力的影响。方法：培养人脐带间充质干细胞，通过尾静脉以高中低3个剂量（2．5×105／0．2 mL／20 g、5×105／0．2 mL／20 g、1×106／0．2 mL／20 g）分别向7月龄 SAMP8老年痴呆小鼠移植 HUMSCs，并设立移植生理盐水组和 R1小鼠正常对照组。HUMSCs 移植45 d 后，MORRIS水迷宫和跳台实验检测其学习记忆能力。结果：与 R1正常对照小鼠比较，SAMP8老年痴呆小鼠生理盐水组学习记忆能力明显降低；和移植生理盐水组比较，细胞移植低剂量组水迷宫逃避潜伏期显著缩短（P ＜0．05），穿越平台次数显著增加（P ＜0．05）；跳台潜伏期显著延长（P ＜0．05），错误次数显著减少（P ＜0．05），结论：低剂量的脐带间充质干细胞移植能增强老年痴呆小鼠 SAMP8的学习记忆能力。
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人脐带间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞
目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外诱导向神经细胞分化的潜能.方法 用生长因子bFGF和EGF联合全反式维甲酸(RA)、中药单体熊果酸、新生大鼠皮层神经元原代无血清培养的上清液3种方法,诱导hUC-MSCs向神经细胞分化,观察形态改变,用免疫细胞化学法检测神经细胞相关的标记物Nestin、Musashi-1和Tubulin、GFAP、O4.结果 hUC-MSCs经细胞因子、2mg*L的熊果酸诱导后,细胞由成纤维状逐渐变成双极、多极或锥形,胞体缩小;有些细胞伸出突起,随时间推移逐渐伸长,有些可形成次级突起,相互连结形成网状.另有一些胞体呈球形,突起较短.新生大鼠皮层神经元原代无血清培养的上清液诱导hUC-MSCs先形成Nestin和Musashi-1阳性的神经球,再经历上述形态变化,分化形成神经元样细胞.hUC-MSCs经诱导14 d后,有少量细胞表达Tubulin、GFAP、O4.结论 hUC-MSCs在体外特定条件下,可诱导分化为神经细胞,作为神经系统疾病细胞移植治疗的备选来源.
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小鼠睾丸支持细胞对人脐带间充质干细胞增殖能力的影响
目的 探讨睾丸支持细胞(SCs)对体外培养人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)增殖能力的影响.方法 体外分离培养并鉴定hUCMSCs和SCs:Transwell-insert系统共培养SCs和hUCMSCs(共培养组)；普通DMEM-F12培养基培养的hUCMSCs作为对照(对照组)；添加细胞因子(白细胞介素-3,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的DMEM-F-12培养基培养的hUCMSCs作为阳性对照(细胞因子组).用流式细胞术、免疫细胞化学等方法检测SCs对hUCMSCs增殖、细胞周期、表面标记分子表达的影响,透射电镜观察细胞超微结构.结果 与对照组相比,共培养组和细胞因子组hUCMSCs增殖明显加快,以共培养组尤为显著(P＜0.05)；共培养组和细胞因子组hUCMSCs表面分子CD29和CD105阳性率均增高；细胞周期分析显示,共培养组G0/G1期细胞数与对照组相比无明显改变,而细胞因子组略有减少.透射电镜观察对照组与共培养组细胞均呈现原始细胞的超微结构特点.结论 SCs共培养可促进hUCMSCs增殖,且共培养后仍保持其干细胞特性.
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脐带间充质干细胞联合单倍体异基因造血干细胞移植治疗36例难治/复发髓细胞白血病临床疗效
本研究分析难治/复发髓系白血病行脐带间充质干细胞(UC-MSC)联合单倍体相合异基因造血干细胞(haplo-HSCT)移植的临床疗效.回顾性总结2007年1月-2013年6月完成的36例难治/复发髓系白血病患者进行UC-MSC联合haplo-HSCT移植后的资料,分析移植后细胞植入、移植物抗宿主病发生率及其严重程度和2年总生存情况.结果表明,36例患者白细胞和血小板植入时间分别为12 d及14 dⅢ-Ⅳ度aGVHD发生率为13.8％,cGVHD发生率为37.5％,广泛性cGVHD仅为6.25％,2年总生存为76.9％.结论:UC-MSC联合haplo-HSCT移植对难治/复发髓系白血病患者具有良好疗效,是用于有高危因素和无全相合供者患者治疗方法之一.
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单倍体相合造血干细胞移植联合脐带间充质干细胞输注治疗儿童恶性血液病的临床研究
目的:探讨脐带间充质干细胞(UC-MSC)在儿童单倍体相合造血干细胞移植(haploidentical-HSCT,hi-HSCT)中应用的安全性及疗效.方法:回顾性分析了本中心2003年11月至2014年11月接受hi-HSCT的47例儿童高危或复发的恶性血液病患者的临床资料,根据有无联合输注UC-MSC,将病例分为2组,一组为传统hi-HSCT组,从2003年11月至2011年9月共13例;另一组为UC-MSC+ hi-HSCT组,从2011年10月到2014年11月共34例.中位随访时间为20(0.5-67)个月.结果:UC-MSC输注无不良反应发生.2组患者在粒系及血小板植入率、植入时间方面并无统计学差异(P＞0.05).UC-MSC+ hi-HSCT组和hi-HSCT组,3年累积生存(OS)分别为70.6％和23.1％ (P =0.004)、无病生存率(DFS)分别为52.9％和0(P=0)、移植相关死亡率(TRM)分别为11.8％和46.2％ (P=0.017),差异均具有统计学意义;而RR分别为32.4％和53.8％ (P ＞0.05),不具有统计学意义.早期巨细胞病毒(CMV)血症发病率分别为91.2％和38.5％(P=0),急性移植物抗宿主病(aGVHD)发病率分别为44.1％和92.3％ (P =0.003),Ⅰ-ⅡaGVHD发病率分别为26.5％和61.5％ (P =0.041),差异均有统计学意义.而Ⅲ-ⅣaGVHD发病率分别为17.6％和30.8％、慢性移植物抗宿主病(cGVHD)发病率分别为26.5％和30.8％,出血性膀胱炎(H-iC)分别为35.3％和7.7％,肺部感染发生率分别为52.9％和46.2％,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:UC-MSC在儿童中应用是安全的,能提高hi-HSCT后3年OS、DFS,降低移植相关死亡率(TRM).在儿童hi-HSCT中,UC-MSC能减轻aGVHD发生率,但增加了早期CMV血症发病率,对造血植入、肺部感染及疾病复发无影响.
关键词： 单倍体造血干细胞移植 儿童恶性血液病 脐带间充质干细胞 -
脐带间充质干细胞治疗儿童异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病疗效观察
本研究观察人脐带间充质于细胞(MSC)治疗儿童急性移植物抗宿主病的疗效和安全性.用胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,进行传代培养、扩增,培养至第3-5代用于临床治疗；5例急性白血病患儿经化疗达完全缓解.2例行亲缘HLA3/6位点相合的骨髓造血于细胞移植,1例行同胞HLA全相合骨髓与外周血造血干细胞联合移植,1例行无血缘关系HLA4/6位点相合双份脐血造血干细胞移植,1例行无血缘关系HLA5/6位点相合单份脐血造血干细胞移植.患儿发生Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD),接受二线免疫抑制治疗无效后,行0.5×106/kg受者体重MSC治疗.结果表明,5例急性白血病患儿均获造血重建,并发生皮肤、肝脏和胃肠道Ⅲ-Ⅳ度aGVHD,经二线免疫抑制治疗无效,输注人脐带间充质干细胞治疗后,皮疹消退,肝功能恢复正常,胃肠道症状好转.患儿均未发生输注相关不良反应.目前患儿均无原发病的复发,均处于无病生存状态.结论:异基因造血干细胞移植是治疗儿童急性白血病的有效方法,脐带间充质干细胞治疗儿童急性移植物抗宿主病是安全有效的.
关键词： 脐带间充质干细胞 异基因造血干细胞移植 急性移植物抗宿主病 -
改良预处理方案单倍体相合造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗高危难治恶性血液病的临床分析
本研究旨在观察应用单倍体相合造血干细胞(hi-HSCT)联合脐带间充质干细胞(脐带MSC)移植治疗高危难治恶性血液病的疗效.对30例难治、复发或高危恶性血液病患者自愿接受单倍体相合造血干细胞联合脐带MSC移植的疗效进行分析,其中复发4例,高危26例.病种包括急性髓性白血病15例,急性淋巴细胞白血病9例,前T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病3例,脾边缘带淋巴瘤ⅣB1例,NK/T细胞淋巴瘤1例,Burkitt淋巴瘤ⅣB1例.结果表明,30例全部获得了顺利植入,发生急性移植物抗宿主病(aGVHD) 19例(63％),其中Ⅲ-Ⅳ6例(20％)；发生慢性移植物抗宿主病(cGVHD) 8/25 (32％),其中广泛型1例,局限型7例；复发3例,复发时间在移植后中位数300 d(128-455 d)；死亡8例,其中1例死于复发,2例死于Ⅳ aGVHD并同时复发,5例死于感染、脏器衰竭.结论:应用脐带MSC联合单倍体相合造血干细胞移植治疗高危难治恶性血液病可取得良好疗效.
关键词： 单倍型造血干细胞移植 脐带间充质干细胞 白血病 淋巴瘤 -
人脐带间充质干细胞条件培养基体外支持造血的功能
本研究旨在探讨单纯人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的条件培养基对脐血CD34+细胞体外造血支持作用.分离得到的hUC-MSC以2 × 106接种于75 cm2培养瓶中,48 h后收集培养上清作为条件培养液.用人脐血CD34阳性分选试剂盒分选CD34+细胞.将CD34+细胞接种在3个培养体系中:hUC-MSC条件培养液+不完全甲基纤维素培养基、完全甲基纤维素阳性培养基和含10％胎牛血清的DMEM/F12+不完全甲基纤维素作为阴性培养基.培养14 d观察集落的形态特征,统计细胞数≥50的造血集落单位数.流式细胞术检测组成集落形成单位的细胞免疫表型.结果表明:hUC-MSC条件培养基中能够形成集落形成单位,且以粒系和粒-巨噬集落形成单位为主(CFU-G 47.67±0.58 、CFU-GM 48.67±4.73 、CFU-M 3.00±2.00),未观察到红细胞系相关的集落形成单位.阳性培养基中各种集落形成单位均可见,阴性培养体系中无集落形成单位.流式细胞术检测条件培养基组CD45+细胞比例为(97.43±2.15)％,显著高于阳性对照中CD45+细胞比例(39.69±0.96)％ (P ＜0.05).结论:在体外hUC-MSC条件培养基能够促进CD34+细胞的发育分化,单纯hUC-MSC条件培养基具有造血支持功能,并促进CD34+细胞向髓系分化,但不能促进向红细胞分化.
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人脐带间充质干细胞对依托泊苷诱导的Nalm-6细胞凋亡的影响
目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对依托泊苷(VP16)诱导的B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6凋亡的影响.方法:首先分离出hUC-MSC,对其形态和免疫表型进行鉴定.然后利用VP16诱导Nalm-6细胞部分凋亡,将Nalm-6与hUC-MSC共培养,应用流式细胞术检测Nalm-6细胞周期及其凋亡变化,定量RT-PCR方法检测Nalm-6细胞中凋亡相关基因BCL-2、BAX和caspase-3的mRNA的表达变化,Western blot方法检测BCL-2、BAX和caspase-3蛋白的表达变化.结果:流式细胞术检测显示,hUC-MSC能够抑制Nalm-6细胞增殖,减少VP16导致的Nalm-6细胞凋亡比例;RT-PCR检测表明,在VP16存在时,hUC-MSC增加Nalm-6细胞中BCL-2 mRNA的表达,降低BAX和caspase-3 mRNA的表达,差异均具有统计学意义(P＜0.05);Western blot检测表明,hUC-MSC增加Nalm-6细胞中BCL-2蛋白的表达,降低BAX和caspase-3蛋白的表达,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论:hUC-MSC可能通过上调BCL-2、下调BAX和caspase-3表达减少VP16诱导的NMm-6细胞凋亡,从而对Nalm-6细胞产生保护作用.
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脐带间充质干细胞对MRL/lpr小鼠免疫炎性易栓状态的调节作用
目的:通过检测MRL/lpr狼疮小鼠的外周血CD4+ CD25+T细胞表达、血浆炎症因子TNF-α和IL-6的表达以及易栓指标TF和FIB的水平,探讨脐带间充质干细胞(UC-MSC)免疫调节作用对MRL/lpr小鼠免疫炎性紊乱及易栓状态的修复影响.方法:将25只MRL/lpr小鼠分为对照(C)组、UC-MSC 1次治疗(UT1)组和UC-MSC 3次治疗(UT3)组,给予UT1和UT3组小鼠经尾静脉注射UC-MSC悬液.在SPF环境中饲养,16周后每2周取血分离血浆,采用流式细胞术法检测外周血CD4+ CD25+T细胞表达水平;ELISA法检测血浆炎症因子TNF-α、IL-6和易栓指标TF、FIB水平.结果:治疗组第16-18周外周血CD4+ CD25+T细胞的表达水平上调,至20周后下降并趋于稳定,至第30周时低于对照组;治疗组小鼠16周后血浆TNF-α和IL-6水平下降,至30周时明显低于对照组(P＜0.05);治疗组小鼠16周后血浆TF和FIB水平下降,TF水平自18周起明显低于C组(P ＜0.05～0.01).结论:UC-MSC可通过其免疫调节作用,修复MRL/lpr小鼠免疫炎性微环境紊乱;UC-MSC有利于MRL/lpr小鼠的免疫炎性易栓状态的修复.
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脐带血血浆分离培养脐带间充质干细胞及体外扩增人脐血CD34+细胞的研究
目的:探讨以脐带血血浆替代胎牛血清体外分离培养脐带间充质干细胞(UCMSC)的可行性,并观察其作为滋养层细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用.方法:收集符合广州脐血库供者合格筛选标准的脐带血,在脐带血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养.采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得UCMSC,将其分为3组.培养第1和第2组以DMEM/F12为基础培养液,分别添加胎牛血清(FBS)和混合脐带血血浆(UCP),第3组为商品化无血清培养液(StemPro(R) MSC SFM CTSTM).经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行MSC成骨、成脂分化鉴定.取冻存复苏后的3组细胞,标记为UCMSCFBS、UCMSCUCP及UCMSCSFM,分别建立滋养层.应用免疫磁珠分选系统(MACS)分选人脐带血CD34+细胞,在添加造血因子组合(StemSpan(R)CC100)的CD34+无血清培养液(StemPro-34 SFM)中培养,并根据滋养层的不同,分为4组:A组CD34+细胞(CD34+ cells)为空白对照组;B组为FBS滋养层组(UCMSCFBS+ CD34+ cells),C组为UCP滋养层组(UCMSCUCP+ CD34+ cells),D组为SF滋养层组(UCMSCSFM+ CD34+cells).于培养第0天和第7天计数各组的有核细胞数(NC)、流式细胞仪检测CD34+比例,并进行造血祖细胞集落培养,评估扩增效率.结果:在3种培养体系下的UCMSC均呈现典型的梭形漩涡状生长,MSC表面标记的表达谱系基本无差异,均具有向成脂、成骨分化的能力,但在UCP培养条件下细胞的扩增能力显著高于其他2组(P＜0.05).经过7d与脐带血CD34+细胞的共培养,虽然4组的CD34+细胞比例均下降,但NC及CD34+细胞数均得到显著扩增,其中UCMSCUCP滋养层组和UCMSCSFM滋养层组均大于UCMSCFBS滋养层组和空白对照组(P＜0.05).与第0天的集落形成能力比较,UCMSCUCP滋养层组与UCMSCSFM滋养层组的集落扩增倍数无差异,但前者的扩增倍数高于UCMSCFBS及空白对照组.结论:UCP可作为一种较为理想的无动物源性的血清补充物,用于UCMSC的分离培养并维持其生长、增殖、分化,是临床级MSC大量扩增培养体系较为安全的选择.
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直接转染HOXB4基因和转染HOXB4基因的脐带间充质干细胞体外扩增人脐血CD34+细胞的研究
本研究探讨直接转染HOXB4基因和转染HOXB4基因的人脐带间充质干细胞体外扩增人脐血CD34+细胞中有核细胞数、CD34+细胞比例与扩增倍数、细胞周期及集落形成能力的异同.将人脐带间充质干细胞(HUC-MSC)分为2组,1组利用慢病毒载体将HOXB4基因转染至HUCMSC并建立滋养层(HOXB4-HUCMSC),另1组建立未转染的滋养层(HUCMSC).应用免疫磁珠分选系统(MACS)分选出人脐血CD34+细胞,在含细胞因子的培养液中培养48 h后分5组,其中对照组2组:A组CD34+细胞(CD34+ cells)为空白对照组,B组空病毒转染CD34+细胞(GFP-CD34+ cells)为阴性对照组;实验组共3组:直接转染HOXB4基因组(HOXB4-CD34+ cells)为C组;HUCMSC滋养层组(HUCMSC+ CD34+ cells)为D组;HOXB4-HUCMSC滋养层组(HOXB4-HUCMSC+ CD34+cells)为E组.于培养第6、10、14 d计数有核细胞数(NC),第10 d比较不同处理条件对CD34+细胞比例、细胞周期与集落形成能力的影响.结果表明,利用慢病毒载体可将HOXB4基因转染至HUCMSC并检测到表达,成功建立了HUCMSC与HOXB4-HUCMSC滋养层.经过14 d体外培养,5组有核细胞均得到显著扩增,比较表明,其效果依次为HOXB4-HUCMSC滋养层组＞直接转染HOXB4基因组＞HUCMSC滋养层组＞2对照组(P＜0.05).在体外扩增第10 d,5组有核细胞CD34+比例均大幅下降,经计算实验组CD34+细胞扩增倍数较第0d显著增高,经比较显示,CD34+细胞比例与扩增倍数高低依次为直接转HOXB4基因组＞HOXB4-HUCMSC滋养层组＞HUCM-SC滋养层组＞两对照组(P＜0.05);流式细胞仪分析细胞周期表明,实验组的S+G2/M期比例较对照组高,其中HOXB4-HUCMSC滋养层组比例高,为41.57％,高于直接转染HOXB4基因的37.87％与HUCMSC的滋养层组的28.65％ (P ＜0.05).HOXB4-HUCMSC滋养层组与直接转HOXB4基因组的集落形成能力无差别,但均高于HUCMSC滋养层组与对照组.结论:HOXB4-HUCMSC滋养层可显著扩增CD34+细胞并可保持其于细胞活性,与直接转染HOXB4基因的CD34+细胞可能产生的潜在致病性基因插入和致突变性风险相比较,HOXB4-HUCMSC滋养层对CD34+细胞的体外扩增相对更安全,有潜在的应用价值.
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脐带间充质干细胞在单倍体相合造血干细胞移植中对肺部感染的影响
本研究探讨脐带间充质干细胞在单倍体相合造血干细胞移植中对肺部感染的影响,以期明确脐带间充质干细胞在调节免疫同时有无升高感染的发生率.2008年4月至2012年12月对83例单倍体造血干细胞移植恶性血液病患者的术后情况进行了监测,其中单纯单倍体相合造血干细胞移植42例,单倍体相合造血干细胞移植联合脐带间充质干细胞输注41例,监测时间16-72个月.结果表明,单纯单倍体造血干细胞移植组共有21例合并肺部感染,包括真菌、病毒、细菌、结核、卡氏肺孢子虫等,其发生率(50±7.72)％,共有31例合并巨细胞病毒血症,其发生率(73.81±6.78)％.单倍体相合造血干细胞移植联合脐带间充质干细胞输注组共有15例合并肺部感染,其发生率(36.59±7.52)％,共有32例合并巨细胞病毒血症,发生率(78.05±6.46)％.两组之间的感染发生率无明显统计学差异(P＞0.05).结论:脐带间充质干细胞输注在单倍体相合造血干细胞移植过程中并未增加感染机率.
关键词： 单倍体造血干细胞移植 脐带间充质干细胞 肺部感染 -
UC-MSC移植对CIA大鼠免疫细胞亚群免疫功能的调节作用
本研究旨在观察脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSC)移植对CIA(collagen typeⅡ-induced Arthritis,CIA)大鼠外周血CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)、辅助性Th17细胞及中性粒细胞的影响,初步探讨UC-MSC移植对CIA大鼠免疫细胞亚群的调节作用.大鼠分为3组:CIA组(模型组),UC-MSC治疗组及空白对照组.经尾静脉给CIA大鼠注射UC-MSC以流式细胞术(FCM)检测大鼠外周血CD4+CD25+细胞比例及中性粒细胞表面NCD11b表达,以酶联免疫吸附试验(ELISA)观察大鼠血清白介素-17(IL-17)水平.结果表明:模型组大鼠外周血NCD11b平均荧光强度(MFI)及IL-17水平均明显高于同期空白对照组,CD4+ CD25+细胞比例则显著降低(P＜0.05),UC-MSC治疗组大鼠NCD11b及IL-17水平显著低于模型组(P＜0.05),而CD4+ CD25+ Treg比例升高(P＜0.05);至第5周UC-MSC治疗组上述指标均接近于空白对照组(P＞0.05).结论:UC-MSC可上调CIA大鼠外周血Treg比例,抑制Th17细胞分泌IL-17及中性粒细胞的活性,减轻机体免疫性炎症反应,减少促炎因子的释放,诱导机体免疫重建.
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无血清培养脐带间充质干细胞的研究
本研究观察无血清培养液培养的人脐带间充质干细胞(UC-MSC),并比较与含10％胎牛血清培养液培养的人脐带间充质干细胞的异同.采集正常足月剖宫产胎儿脐带,用MesenCult-XF无血清培养液或含10％胎牛血清培养液培养.观察不同培养液培养的间充质干细胞细胞的形态、免疫表型、细胞周期、增殖分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用.结果表明,采用无血清MesenCult(R)-XF培养液培养的MSC平均传代倍增6.57±0.7倍,含血清培养液培养的MSC平均传代倍增4,59±0.45倍(P＜0.05)；两种培养液培养的MSC均表达CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表达CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表达程度无明显统计学差异；无血清培养液培养的MSC(65±5.2)％均为G0/G1期细胞,含血清培养液培养的MSC(62±3.1)％为G0/G1期细胞(P＞0.05)；两种培养液培养的人脐带MSC均可向成脂细胞、成骨细胞分化；无血清培养液培养的脐带MSC按1 000、5 000、10 000、20 000个细胞/孔接种密度与反应细胞和刺激细胞共培养的每分钟闪烁值(CPM)分别为(6.43±0.47)×104、(4.30 ±0.38)×104、(1.97±0.13) ×104和(0.24±0.03)×104,含血清培养液培养的MSC与不同密度的混合淋巴细胞共培养的CPM值分别为(7.85 ±0.07) ×104、(5.64 ±0.12)×104、(3.09±0.18)×104和(1.73±0.05)×104.结论:无血清培养液培养的细胞均为MSC,有传代增殖潜能,传代可达临床治疗MSC细胞量,并可避免异种蛋白致敏.
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人脐带、胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性比较研究
由于组织来源和增殖能力的优势,与骨髓间充质干细胞( MSC)相比,脐带和胎盘来源的MSC更具有临床应用前景,但脐带和胎盘来源MSC的生物学特性是否有差异值得进一步研究.本研究比较人脐带、胎盘绒毛膜来源MSC的生物学特性.将胎盘、脐带冲洗干净后,通过酶消化法分离脐带、胎盘来源的MSC.通过短串联重复序列分析(STR)检测细胞是否均来源于胎儿组织,用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术分析细胞表型,使用不同的诱导分化培养液检测其多向分化的能力.将MSC与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞共培养,用酶联免疫吸附试验检测上清γ-干扰素的水平.结果表明,STR分析证实所得到的细胞均来源于胎儿组织,这两种细胞生长呈典型的成纤维细胞形态；细胞表达常见的MSC表面标记CD90、CD73、CD105、CD44,不表达CD45,CD11b和CD34；在不同的条件培养液培养下,细胞均可向成骨、成脂方向分化,但在成脂分化方面,绒毛膜来源MSC能形成更大的脂滴.结论:所得到的细胞均为MSC,均能抑制植物血凝素刺激的人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素,且绒毛膜来源的MSC具有更强的抑制能力.这使得绒毛膜来源的MSC在治疗自身免疫系统疾病方面可能具有更大的优势.
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脐带间充质干细胞降低HL-60对阿糖胞苷的敏感性
本研究探讨脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对HL-60白血病细胞药物治疗敏感性的影响,为研究hUC-MSC对白血病细胞的调节作用提供资料.体外建立HL-60细胞与hUC-MSC的transwell及直接接触共培养体系；使用流式细胞仪检测阿糖胞苷对HL-60细胞凋亡的影响,并检测与hUC-MSC共培养对HL-60细胞细胞周期的影响；应用RT-PCR和Western blot检测Caspase3 mRNA和蛋白表达变化；通过transwell共培养体系观察hUC-MSC对HL-60细胞凋亡影响的作用机制.结果表明,与hUC-MSC共培养可以显著减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡(P＜0.05)；hUC-MSC可以将HL-60细胞阻滞于Go/G1期,阻止其进入S期(P＜0.05)；与hUC-MSC共培养可以降低HL-60细胞中Caspase3 mRNA和蛋白水平的表达(P＜0.05)；transwell体系中hUC-MSC同样可以减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞的凋亡(P＜0.05).结论:hUC-MSC通过分泌可溶性细胞因子减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡,其机制可能与通过调节HL-60细胞周期及下调Caspase 3表达有关.
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miR-486基因修饰的脐带间充质干细胞外泌体对心肌细胞生物学特性影响
目的:观察miR-486基因修饰脐带间充质干细胞外泌体的生物学特性,评价其对大鼠H9c-2心肌细胞生物学特性的影响.方法:分离并扩增人脐带间充质干细胞(UC-MSC),并鉴定其免疫表型和成骨及成脂分化能力;用电子显微镜观测外泌体的形态结构;应用Transwell细胞迁移实验观察外泌体对细胞迁移特性的影响.用重组腺病毒载体介导间充质干细胞高表达miR-486,应用qRT-PCR确定高表达miR-486的UC-MSC.收集培养上清,通过超速离心获得外泌体,应用qRT-PCR检测UC-MSC外泌体miR-486表达量.用Dye670标记评价外泌体对心肌细胞增殖的影响;在H2O2诱导的心肌细胞凋亡模型中通过AnnexinV/PI双标记流式细胞术检测外泌体对心肌细胞凋亡的影响.结果:UC-MSC分泌外泌体直径均在40-100 nm之间,且具有双膜结构.重组腺病毒能够有效介导miR-486在间充质于细胞表达,miR-486基因修饰UC-MSC分泌的外泌体中miR-486的表达显著增高.高表达miR-486的外泌体对心肌细胞有促增殖、促迁移作用及抑制心肌细胞凋亡的作用.结论:脐带间充质干细胞来源的且高表达miR-486的外泌体对心肌细胞有促增殖及抑制细胞凋亡作用.
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脐带间充质干细胞体外衰老过程中生物学特性及基因表达谱的变化
本研究探讨人脐带间充质干细胞(UC-MSC)在体外培养的衰老过程中细胞生物学特征及衰老相关基因的变化特点.体外分离培养UC-MSC,取第3代(对照组)和第15代(衰老组)细胞进行形态学观察、增殖检测、流式表型测定和人类全基因组表达谱芯片分析,并选取重要基因进行定量逆转录多聚酶链反应验证.结果显示,与对照组相比,衰老组细胞形态变大,增殖速度减慢,但CD44和CD105等细胞表型阳性率无变化；衰老细胞组的核糖体小亚基组成相关基因显著上调,上调的信号通路主要涉及类固醇合成、半乳糖代谢、自身免疫病和退行性疾病；下调明显的是细胞骨架,DNA、mRNA结构的结合以及蛋白质功能等相关基因,与细胞黏附功能和细胞增殖周期等相关.结论:第15代的UC-MSC出现细胞代谢与增殖功能下降,从而导致细胞衰老.
