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体外分化过程中小鼠拟胚体的细胞学特征及基因表达模式
目的 探讨小鼠胚胎干细胞来源的拟胚体(EBs)形成以及分化发育90d过程中的形态学特征及基因表达模式.方法 将小鼠胚胎干细胞通过悬浮培养获得EBs,EBs在不添加其他诱导因子的体系中连续悬浮培养,采用形态学观察、免疫组织化学染色和RT-PCR检测EBs培养过程中的细胞发育分化特征和基因表达模式.结果 将胚胎干细胞转移到去除白血病抑制因子(LIF)的悬浮培养液中培养24h左右即可形成EBs;培养3d左右,部分EBs出现简单胚体结构;在EBs分化7d左右,逐步向空腔化胚体发育;培养9d左右,EBs可发育为原始的囊性胚体结构;培养11d左右,EBs形成典型的、结构完整的三胚层结构.HE染色结果显示,发育早期的EBs包含大量尚未完全分化的ES细胞,随着培养时间的延长,EBs向空腔化、囊性胚体发育,逐渐形成类似于早期组织的形态.悬浮培养7周左右,EBs的发育分化基本停止.免疫组织化学染色结果表明,中胚层心肌细胞特异性标志蛋白cTnT,外胚层特异性标志蛋白Nestin在15d的EB8中表达呈阳性.RT-PCR检测也显示形成的EBs表达外胚层特征性基因Vimentin、Nestin,中胚层特征性基因Flk-1、Gata-1和内胚层特征性基因Transthyretin、α-fetoptotein.结论 小鼠胚胎干细胞来源的EBs具有分化为3个胚层的能力,EBs形成的三维结构能够有效的启动细胞的分化;EBs来源的三胚层细胞的发育分化时序和特征,将为鉴定胚胎干细胞来源的分化细胞提供重要参照.
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BMP-4与VEGF促进拟胚体中原始造血干细胞发生的实验研究
本研究旨在探讨骨形态发生蛋白4(BMP-4)和血管内皮生长因子(VEGF)在诱导胚胎干细胞(ESC)形成拟胚体(EB)过程中促进原始造血干细胞形成的作用.将小鼠E14 ESC在半固体培养基中诱导为EB,根据培养体系中有无添加因子分组:未添加因子的自然分化组、含不同浓度(5、15、25、50 ng/ml)的BMP-4组,在BMP-4单因子实验的基础上联合10 ng/ml VEGF组及单因子VEGF组.分别于3、6、9、12、15天时收获EB,用流式细胞术检测Flk-1+细胞含量.结果表明:随着添加BMP-4因子浓度的逐渐升高,EB中Flk-1+细胞形成比例也逐渐增加,在第3天(D3)和第6天(D6)两个时点,25 ng/ml BMP-4作用组Flk-1+细胞达到峰值,分别为(6.51±1.02)%和(7.70±1.12)%,与无BMP-4对照组及5 ng/ml组比较有统计学意义的差异(p＜0.05).然而在BMP-4浓度升高至50ns/ml条件下Flk-1+细胞形成比例有减少趋势.在BMP-4单因子实验的基础上,以25 ng/ml BMP-4联合10 ng/ml VEGF共同作用于ESC→EB诱导过程,Flk-1+细胞百分比明显提高,在9天达到峰值,为(27.53±8.14)%,与自发分化组[(8.77±2.35)%]及VEGF单因子组[(11.21±2.23)%]相比均有显著性差异(p＜0.05).结论:BMP-4和VEGF联合使用可促进EB中胚层原始造血干细胞的形成,为进一步模拟造血微环境定向诱导ESC造血分化提供了实验依据.
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视黄酸对人胚胎干细胞生物学特性的影响
目的 研究视黄酸对人胚胎干细胞(ESCs)的增殖、干性及其向拟胚体分化的能力的影响,探索应用人ESC为模型研究先天发育畸形机制的可行性.方法 用real-time PCR、MTS细胞增殖分析和免疫荧光染色,鉴定视黄酸处理前、后H9 ESC增殖和干性的变化;用real-time PCR比较H9 ESC向拟胚体分化后,视黄酸处理对三胚层标志基因及成骨和成脂相关基因表达的影响.结果 随着视黄酸处理时间和浓度的增加,H9 ESC的增殖速度在指数生长早期显著上调,干性标志基因OCT4,Nanog和Sox2及Oct4翻译调控因子Lin28的mRNA表达水平显著下降,且Oct4蛋白表达水平也明显降低.视黄酸处理后拟胚体出现空泡结构,外胚层标志基因NeuroD1、Noggin,中胚层标志基因Brachyury、Twist和内胚层标志基因AFP,GATA-4的表达显著上调(P＜0.05),并以AFP的变化为显著(P＜0.01).此外,成脂相关基因C/EB Pα表达水平也显著提高,但成骨相关基因OPN的表达水平在视黄酸处理5d后显著下调(P＜0.05).结论 高浓度的视黄酸可诱导H9 ESC丧失干性,并使其向拟胚体方向发生过度分化,同时破坏早期拟胚体形成过程中成骨成脂分化的平衡,这可能与其诱发先天性颅面发育畸形相关.
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小鼠胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞的定向分化
目的:血管重建手术在多数情况下以自体血管作为替代品,但来源有限.胚胎干细胞具有发育全能性,目前其定向诱导机制尚不明确.通过选择适当的诱导剂,探讨胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞分化的趋势.方法:实验于2006-08/2007-02在南昌大学第二附属医院血液病研究所完成.①动物及细胞系:清洁级孕12.5d昆明小白鼠1只,由南昌大学医学院动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ编号为SCRC-1018,由American Type Culture Collection提供.②实验方法:取孕12.5 d鼠胚胎,去除头部、内脏及四肢,将组织块剪碎,胰酶消化,分离培养胚胎成纤维细胞,传至3-5代时史换为含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM高糖培养基,24 h后收集培养液,加入2.0mmol/L L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸,0.1 mmol/L β-巯基乙醇,1000 U/mL白血病抑制因子,此即为条件培养基.常规复苏小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ,以1 × 106密度接种,传代时用差速贴壁法分离去除已分化的胚胎干细胞,加入条件培养基5 mL,经过悬滴一悬浮培养,构建拟胚体分化模型.设立3组,各组均置于明胶包被的T25培养瓶中,每瓶加入50个拟胚体,使其均匀分布于培养瓶底.诱导组7～10 d加入10-9 mol/L全反式维甲酸和3 μ g/L转化生长因子β1,10～21 d加入20μg/L血小板源性生长因子.血清对照组仅加入去生长因子胎牛血清,全反式维甲酸组仅加入全反式维甲酸.诱导21 d的拟胚体,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ联合消化为单个细胞,再加入20μg/L血小板源性生长因子继续诱导7 d.③实验评估:应用RT-PCR法检测诱导细胞血管平滑肌肌动蛋白、血管平滑肌肌球蛋白重链基因的表达.通过免疫细胞化学技术检测血管平滑肌肌动蛋白的表达来鉴定细胞性质.结果:①胚胎干细胞牛长及拟胚体诱导分化:胚胎干细胞在体外能自发形成拟胚体,经过不同生长因子的分阶段联合诱导,拟胚体贴壁后球体略摊开,周围出现大量的梭形细胞.②RT-PCR检测:拟胚体血管平滑肌肌动蛋白和血管平滑肌肌球蛋白重链基因均呈强阳性表达.③免疫细胞化学检测:荧光显微镜下,罗丹明染色细胞浆呈红色荧光,并可见肌丝结构;DAPI染色细胞核呈蓝色荧光.诱导组血管平滑肌肌动蛋白阳性率明显高于血清对照组、全反式维甲酸组(P＜0.05).结论:胚胎干细胞经维甲酸、转化生长因子β1以及血小板源性生长因子分阶段联合诱导后,可分化为血管平滑肌细胞且纯度较高.随着细胞纯度和活性等问题的进一步解决,胚胎干细胞将有可能成为血管组织工程的种子细胞.
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碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源集落形成细胞的作用
背景:有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和在胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,碱性成纤维细胞生长因子可强烈表达.目的:在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对集落形成细胞产生的调控作用.方法:购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3～5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5 h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×104/cm2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24 h之后使用.复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上.在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为2组:对照组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子组)、实验组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+碱性成纤维细胞生长因子组).各组于培养3,6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法检测Flk-1+细胞表达情况,并用IMAGE-PRO PLUS图像分析系统统计阳件细胞数及平均吸光度值.结果与结论:与对照组比较,在拟胚体培养阶段加入碱性成纤维细胞生长因子可显著增加集落形成细胞的数量(P＜0.01),Flk-1阳性细胞数及平均吸光度值也显著增加(P＜0.01).证明碱性成纤维细胞生长因子能够有效地促进胚胎体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖.
关键词： 拟胚体 集落形成细胞 碱性成纤维细胞生长因子 小鼠胚胎干细胞 造血干细胞 -
人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建
背景:研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化.目的:以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6 d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性.再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Co γ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组.结果与结论:拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞占(13.12±1.30)%.NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成.静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21 d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因.提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 胚胎干细胞 造血干细胞 拟胚体 造血重建 -
维生素C体外诱导多能干细胞向心肌细胞的分化
背景:诱导多能干细胞治疗缺血性心脏病被认为是极具前景的方法,但目前仍未找到一种理想的诱导方式.目的:观察维生素C作为诱导剂对多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响.方法:复苏小鼠诱导多能干细胞,传代培养后,采用直接悬浮培养法使小鼠诱导多能干细胞形成拟胚体,用含10-3,10-4,10-5,10-6 mol/L 4种不同浓度维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,以不添加任何诱导剂作为对照组,观察各组出现搏动拟胚体的数量,计算分化比率.结果与结论:维生素C诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的佳浓度为10-4 mol/L,有(57.00±3.20)%的拟胚体出现搏动,显著高于不添加任何诱导剂的对照组(5.13%±0.55)%(P<0.01).诱导而来的心肌细胞表达心肌特异性蛋白cTnT以及α-actin.提示佳的维生素C诱导分化条件能够促进小鼠诱导多能干细胞向心肌细胞分化,提高其分化效率.
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小鼠胚胎干细胞来源平滑肌细胞的鉴定及其功能分析
背景:胚胎干细胞来源的平滑肌细胞是血管组织工程潜在的细胞来源之一,但这些细胞是否具有成熟平滑肌细胞的表型和功能仍不清楚.目的:对小鼠胚胎干细胞分化的甲滑肌细胞进行表型鉴定及功能分析.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-05/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.材料:清洁级孕12.5 d昆明小鼠1只用于制备饲养层细胞,SD大鼠1只用干制备主动脉平滑肌细胞.小鼠胚胎干细胞系R1、小鼠微血管内皮细胞系由美国ATCC公司提供,转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1由本实验室制备.方法:①诱导分化及筛选:用转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1制备拟胚体,拟胚体悬浮培养5 d后贴壁培养1 d,第7天加入全反维甲酸诱导分化4 d,第11大用10 mg/L嘌呤霉素对诱导分化后的细胞筛选2 d.②表型鉴定:对筛选到的平滑肌细胞进行SM α-actin、SM22a、SM.MHC免疫荧光染色,以大鼠原代主动脉平滑肌细胞、未经筛选的第10天分化细胞作为对照,进行Western Blot分析.③收缩功能:10-5 mol/L卡巴可处理筛选到的平滑肌细胞30 min.④体外成血管功能:将等量的内皮细胞和筛选到的平滑肌细胞混合,在Matrigel上培养.主要观察指标:平滑肌细胞标志物的表达,平滑肌细胞的收缩,平滑肌细胞向内皮管腔样结构的募集.结果:分化的平滑肌细胞上要分布于贴壁生长的拟胚体的外周部位,胚胎干细胞来源的平滑肌细胞3种标志物SM α-actin、SM22a、SM-MHC免疫荧光染色均呈阳性表达,Western Blot结果显示其SM α-actin、SM22a表达水平与大鼠原代主动脉平滑肌细胞相似,高于未经筛选的第10天分化细胞.筛选剑的平滑肌细胞在10-5 mol/L卡巴可刺激下出现明显收缩,且能够募集到内皮管腔样结构周围.结论:小鼠胚胎干细胞来源的平滑肌细胞具有与成熟平滑肌细胞相似的表型和功能.
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制备小鼠去细胞拟胚体对Lewis肺癌细胞的促分化作用
背景：胚胎干细胞或胚胎组织与癌细胞共培养，能够诱导癌细胞分化为正常上皮细胞或恶性程度降低，而去细胞拟胚体保留了胚胎组织的结构和重要细胞因子。
目的：成功制备一种来源于小鼠胚胎干细胞的去细胞拟胚体，探讨去细胞拟胚体在小鼠 Lewis 肺癌细胞体外三维培养中的作用。
方法：先将小鼠胚胎干细胞(D3)动态培养7 d后形成拟胚体，然后用十二烷基硫酸钠进行去细胞处理。小鼠Lewis肺癌细胞与去细胞拟胚体三维共培养7 d，对照组肺癌细胞在Matrigel上三维培养7 d。Ki67免疫组化染色检测细胞增殖情况，Western blot检测Paxilin，E-cadherin蛋白表达水平，RT-PCR检测Slug和E-cadherin mRNA表达水平。
结果与结论：①实验成功制备一种大小均匀的小鼠拟胚体，经十二烷基硫酸钠去细胞处理后，拟胚体的细胞成分完全去除；②小鼠Lewis肺癌细胞在Matrigel上三维培养7 d后形成球形的肿瘤多细胞球体， Ki67免疫组化染色阳性细胞比例高；小鼠Lewis肺癌细胞在去细胞拟胚体支架上三维培养7 d，可见肺癌细胞长入拟胚体，但Ki67阳性细胞比例明显降低；③相对于Matrigel组，去细胞拟胚体组的Paxil in吸光度小于Matrigel组(P<0.05)，而E-cadherin吸光度大于Matrigel组(P<0.05)；④去细胞拟胚体组的Slug mRNA表达明显低于Matrigel组(P<0.05)，而E-cadherin mRNA表达高于Matrigel组(P<0.05)；⑤结果表明，去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞在体外三维培养有促进分化作用。 -
利用小鼠胚胎干细胞贴壁制备拟胚体的新方法研究
目的 为改进拟胚体制备过程中分化不同步等问题,探讨建立小鼠胚胎干细胞贴壁制备拟胚体的新方法.方法 沈阳军区总医院心内科于2004年10月至2006年1月对小鼠进行研究,当小鼠胚胎干细胞R1生长至70%～80%亚融合时,将其消化成单细胞,以1×106的细胞数接种到直径100 mm组织培养皿中,用含低浓度白血病抑制因子(LIF)1 μg/L的胚胎干细胞培养液连续贴壁培养3 d后,收集贴壁细胞团继续悬浮培养.对悬浮培养的拟胚体及其冰冻切片行形态学观察,对悬浮及贴壁分化的拟胚体行甲胎蛋白(AFP)、血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)及神经丝蛋白68 KD(NF-68)免疫荧光染色.结果 形态学观察用本法得到的拟胚体大小均一,分化同步,能展示从简单拟胚体到成熟囊性拟胚体的典型发育过程.免疫荧光染色显示,AFP、PECAM-1及NF-68三种标志物表达均为阳性.结论 与传统方法相比,该法操作简便、拟胚体形成率高、分化阶段同步,具有分化为3个胚层来源细胞的能力,可作为胚胎早期发育和胚胎干细胞分化等研究的理想工具.
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体外诱导胚胎干细胞向Ⅱ型肺泡细胞分化的实验研究
目的 建立一种简便高效的定向诱导小鼠胚胎干细胞向Ⅱ型肺泡细胞分化的方法.方法 ①通过细胞培养,获得充足小鼠胚胎干细胞,接种于小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上,通过滋养层细胞以及白血病抑制因子来保持其多向分化能力.②STLV型生物反应器中培养的拟胚体在细胞大小、形态和数量方面均明显优于传统的悬浮培养法.③将STLV型生物反应器中制备并扩增得到的拟胚体,用ESC分化培养基连续贴壁诱导14d后,进行细胞染色,聚合酶链式反应检测.结果 通过3个部分的实验,终得到表达Ⅱ型肺泡细胞特异性标志物的细胞.前两部分中,得到了大量状态良好的未分化ESC,经扩增获得了高质量和大数量的EBS.在第三部分,免疫荧光及RT-PCR证明出现了Ⅱ型肺泡细胞特异性标志物-SPC的表达.结论 通过以胚胎成纤维为种子细胞,利用组织工程的技术可形成Ⅱ型肺泡细胞.
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胚胎干细胞自我更新与诱导分化
本文在简述胚胎干细胞生物学性状的基础上,重点综述胚胎干细胞自我更新和诱导分化研究的相关进展,其中包括由外源性细胞因子(LIF因子)和内源性转录因子(Oct-4,Nanog)共同参与的自我更新调控机制;通过条件培养基和基因转染的方法定向诱导干细胞分化以及微环境对干细胞诱导分化的影响及调控,后提出干细胞研究面临的挑战.可为今后干细胞的基础科研及应用开发提供必要的理论依据和技术指导.
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BMP7对小鼠诱导多能干细胞骨向分化作用的研究
目的:探讨骨形态蛋白(bone morphogenetic protein,aMP)超家族成员之一BMP7在小鼠诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)骨向分化过程中的作用.方法:本试验分成三组,分别是自发分化组,骨诱导组和添加BMP7的骨诱导组.每天观察各组细胞形态学特征及生长状况的差异,在诱导第14天通过茜素红染色检测基质矿化情况,判断BMP7在体外骨诱导条件下对小鼠iPS细胞骨向分化过程所发挥的作用.结果:完成了小鼠iPS细胞的培养鉴定,并诱导形成理想状态的拟胚体(Embryoid body,EB)用于分化接种.结果发现,添加BMP7的骨诱导组细胞的矿化结节阳性率明显增加.结论:BMP7在诱导小鼠iPS细胞骨向分化过程中起促进作用,而对非骨向分化的细胞无成骨促进作用.
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小鼠去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞体内生长的影响
目的:阐明小鼠去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞在体内生长的影响.方法:先制备来源于小鼠胚胎干细胞的拟胚体,然后用SDS去细胞处理.实验分成3组:小鼠Lewis肺癌细胞与去细胞拟胚体培养组,癌细胞与Matrigel培养组和单纯癌细胞组(每组n=12).培养3天后注射入裸鼠体内,观察肿瘤生长情况.28天取出瘤体,Ki67和CD31免疫组化染色(n=12)检测细胞增殖和肿瘤微血管密度(MVD),Western blot检测组织Paxillin,E-cadherin和β-actin水平(n=6).结果:去细胞拟胚体组肿瘤生长明显较单纯细胞组和Matrigel组慢.去细胞拟胚体组Ki67指数((17.1±2.6)％)明显小于单纯细胞组((34.5±4.7)％)和Matrigel组((48.4±8.6)％)(P.＜o.05);去细胞拟胚体组的MVD(18.7±3.6个/mm2)明显小于单纯细胞组(32.1±6.4个/mm2)和Matrigel组(42.6± 7.1个/mm2)(P＜0.05).Western blot结果提示去细胞拟胚体组的Paxillin表达小于单纯细胞组和Marigel组(P＜o.05),而E-cadherin表达大于单纯细胞组和Matrigel组(P＜0.05).结论:小鼠去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞在体内有明显的促分化作用.
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血管内皮生长因子促进小鼠胚胎干细胞生成CD34+细胞的研究
目的:研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)体外促进小鼠胚胎干细胞系ES-D3生成CD34+细胞的能力.方法:将ES-D3形成拟胚体,将拟胚体细胞转入含不同浓度的VEGF和VEGF+干细胞因子(stem cellfactor,SCF)的培养基中.实验分6组,分别为VEGF 5μg/L组、VEGF 10 μg/L组、VEGF 20μg/L组、VEGF 5μg/L+SCF组、VEGF 10μg/L+SCF组、VEGF20μg/L+SCF组,同时设不加因子的自发分化对照组.RT-PCR检测CD34 mRNA的表达,流式细胞仪检测CD34+细胞的比例,甲基纤维素半固体培养法检测生成造血集落的能力.结果:经过1周的诱导培养,实验组生成的细胞可以表达CD34 mRNA,CD34+细胞的比例也升高,并可形成造血祖细胞的集落.从CD34 mRNA的表达水平、诱导生成CD34+细胞的比例和生成的集落数量看,VEGFμg/L+SCF组和VEGF 10μg/L+SCF组的诱导效率高.结论:VEGF能够促进ESC生成CD34+细胞,尤以与SCF合用时,其诱导效率更高.
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应用旋转生物反应器批量制备拟胚体的研究
以小鼠胚胎干细胞(ES-D3)为模型,应用新型细胞培养系统--STLV型旋转生物反应器(rotary cell culture system,RCCS)建立一种批量制备拟胚体(embryoid bodies,EBs)的新方法,研究不同细胞接种密度及培养时间对RCCS内EBs产生效率的影响.为了进一步研究该制备方法是否对EBs的分化潜能产生影响,对照传统方法制备的EBs,利用形态学及RT-PCR方法测定经旋转生物反应器制备的EBs在自发性或诱导条件下(1%DMSO)向心肌细胞的分化能力.结果表明:ES-D3在RCCS内能够高效形成EBs,与传统的直接悬浮法比较,其EBs的形成效率可达到后者的2倍.1×104个/ml为佳细胞接种密度,培养时间也是在RCCS制备EBs过程中的重要因素之一,培养第4～5天为佳收获EBs的时间.与悬滴法制备的EBs比较,该方法制备的EBs分化为心肌细胞的潜能未改变.由此,应用旋转生物反应器可以高效制备EBs,该方法制备的EBs可以用于发育生物学等基础及应用领域的相关研究.
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不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞生殖细胞分化相关基因表达的影响
目的:探讨不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)分化形成拟胚体(embryoid bodies,EBs)后生殖细胞分化相关基因表达的影响及机制. 方法:mESCs分化形成EBs 3 d后接种于不同基质蛋白包被的培养皿中,包括人工基底膜(matrigel,M组)、纤维连接蛋白(fibronectin,F组)、层粘蛋白(1aminin,L组)、胶原(collagen,C组)和非生物活性底物琼脂糖(agarose,A组),同时设不加任何基质蛋白的空白对照组(B组).RT-PCR检测EBs在不同基质蛋白上d1～d4期间生殖细胞分化相关基因的表达,以及mESCs内源性基质蛋白FN(fibronectin)、LN(laminin)以及整合素受体β1基因的表达. 结果:L组和F组EBs易贴壁分化,RT-PCR结果也证实原始生殖细胞(PGCs)分化基因Blimp-1、Stella、Mvh和减数分裂启动基因Stra8在L组和F组表达总体趋势为逐渐增强;M组和C组的表达趋势不明显;A组基因表达水平整体偏低;空白对照B组基因表达水平整体偏高但均呈下降趋势.L组和空白对照组细胞表达内源性基质蛋白FN、LN以及整合素受体β1. 结论:层粘蛋白/β1信号途径可能对mESCs向PGCs分化具有指导作用,外源性层粘蛋白可能通过其受体β1亚单位传递诱导信号,调节mESCs来源的EBs向PGCs分化,FN可能通过其他整合素受体亚单位发挥作用.无任何外源性基质蛋白时,自身分泌的内源性基质蛋白也促进细胞分化.
关键词： 基质蛋白 小鼠胚胎干细胞 拟胚体 原始生殖细胞 生殖细胞分化相关基因 -
低氧对小鼠胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞的影响
目的 探讨在胚胎干细胞诱导分化过程的不同阶段进行低氧处理对分化心肌细胞的影响.方法 建立胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的实验方法,在分化过程的不同阶段采取低氧(氧浓度为4％)处理,并设立常氧组(约为20％)作为对照,用免疫荧光鉴定分化后的心肌细胞,以流式细胞术检测低氧对分化心肌细胞的增殖、分化、凋亡的影响.结果 分化细胞经免疫荧光检测显示,部分细胞呈α辅肌动蛋白阳性(红色)、心肌肌钙蛋白I阳性(绿色)；分化细胞经流式检测显示,与常氧组相比,悬滴低氧组α-actinin阳性细胞和cTnI阳性细胞的比率分别提高了12.55％ (P ＜0.01)和6.11％(P＜0.05),悬浮低氧组凋亡比率与常氧组相比明显提高(P＜0.01),悬滴低氧组处于S期的细胞比率与常氧组相比明显降低(p＜0.01).结论 在胚胎干细胞向心肌细胞的定向诱导分化过程中,采用悬滴阶段低氧处理,使心肌特异性蛋白阳性细胞比率提高,细胞凋亡率稳定,细胞增殖能力因细胞分化成熟而有所降低,为低氧处理的佳方案.
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小鼠胚胎干细胞无饲养层培养及其生物学特性
目的 建立小鼠胚胎干(ES)细胞株S8在无饲养层的条件下短期内连续传代体系,获得大量纯的ES细胞.方法 ES-S8细胞无饲养层连续传代后,检测其未分化指标以及多分化潜能.结果 ES-S8细胞在无饲养层条件下培养5代,AKP染色、SSEA-1免疫荧光、OCT-4均显阳性,以及经拟胚体(EB)途径自发分化后,能形成多种类型的细胞.结论 ES-S8细胞能够在无饲养层条件下堵养,至少传5代仍能保持未分化特异性指标和多分化潜能.
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生物反应器内EBs来源细胞的肝细胞分化与成熟
目的 观察微重力生物反应器内拟胚体(EBs)来源细胞的肝细胞分化与成熟.方法 将未分化鼠胚胎干细胞(ES细胞)以1×106/mL移入微重力反应器内,在DMSO、地塞米松、FGF4、HGF等刺激作用下,进行15 d的旋转培养.采用ELISA法动态检测培养液中鼠白蛋白的产生量.培养结束时转移EBs于载玻片和培养板,分别检测EBs来源细胞的糖原储存和对靛青绿(ICG)、荧光素标记低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的摄取能力.结果 在生物反应器旋转培养的第5、10 d,未从培养液中检出特异的鼠白蛋白,而在第15 d的培养液中检出一定量的鼠白蛋白.与原代培养的成熟肝细胞一样,转种的EBs来源细胞periodic acid-Schiff(PAS)糖原染色阳性,ICG摄取试验阳性,DiI-Ac-LDL摄取试验阳性.未分化的ES细胞均呈阴性.结论 微重力生物反应器不仅能加快EBs的形成与肝细胞分化,而且能促进分化肝细胞的成熟.
