中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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滑膜间充质干细胞与软骨细胞移植修复膝关节软骨缺损
背景:膝关节软骨损伤后修复较困难.有研究发现将关节软骨细胞和滑膜间充质干细胞混合培养接种于壳聚糖支架材料中,均可以形成软骨基质.目的:观察滑膜间充质干细胞与软骨细胞与壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料对膝关节软骨缺损的修复情况.方法:将大鼠膝关节滑膜间充质干细胞及软骨细胞按1:2比例共培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中,将此复合材料移植于膝关节软骨缺损模型大鼠膝关节缺损处进行修复.结果与结论:①组织学变化:苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及番红O染色显示,植入后4,8,12周,大鼠膝关节软骨细胞逐渐增多;②软骨样组织标记物Ⅱ型胶原表达:免疫组织化学染色显示,移植后4,8,12周,大鼠膝关节软骨组织细胞及细胞基质可见Ⅱ型胶原阳性表达.③结果证实,滑膜间充质干细胞与软骨细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中,在体内环境下能够形成软骨样组织,有利于损伤膝关节软骨缺损的修复.
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骨髓间充质干细胞移植治疗多器官功能障碍综合征
背景:多器官功能障碍综合征为当今临床治疗的一大难题,骨髓间充质干细胞移植为其提供了一个新的治疗研究方向.目的:观察骨髓间充质干细胞移植治疗多器官功能障碍综合征的疗效.方法:按1 mg/kg剂量股静脉注射内毒素建立大鼠多器官功能障碍综合征模型,将存活的大鼠随机分为治疗组和模型组,治疗组大鼠尾静脉注射500μL(5×106)第3代骨髓间充质干细胞,对照组尾静脉注射等体积的生理盐水;治疗5d后行血常规、血生化、凝血功能检测,取血后处死大鼠取肝脏、肾脏、心脏、脾脏进行苏木精-伊红染色病理学观察.结果与结论:①移植治疗1周后,与模型组相比,治疗组肝功能、凝血功能各项指标明显得到改善(P<0.05),白细胞计数更接近正常水平(P<0.05);②模型组心、肝、脾、肾脏均出现不同程度的炎症性病变和坏死,治疗组炎性浸润和坏死性病变明显减轻;③结果提示,骨髓间充质干细胞对多器官功能障碍综合征模型大鼠具有明显的治疗作用.
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碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨骼肌卫星细胞自体移植急性心肌梗死组织的血管新生
背景:前期研究发现,骨骼肌卫星胞移植能够诱导心肌梗死区新生血管形成,缩小梗死面积,改善其心功能,但整体效果并不太理想.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨骼肌卫星细胞在急性心肌梗死区的存活及对心肌梗死区血管新生的影响.方法:将18只新西兰大白兔随机分为3组,实验组、对照组结扎冠状动脉左前降支,构建急性心肌梗死动物模型;空白对照组只穿线,不结扎.造模成功即刻,实验组于局部梗死心肌内注射DAPI标记的碱性成纤维细胞生长因子基因修饰自体骨骼肌卫星细胞悬液50μL,对照组注射等量DAPI标记的自体骨骼肌卫星细胞.细胞移植4周后取标本,观察心肌梗死区骨骼肌卫星细胞存活及成纤维细胞生长因子基因表达情况,免疫组织化学染色检查心肌梗死区新生血管形成情况.结果与结论:①空白对照组未见DAPI标记的细胞,对照组及实验组缺血心肌区域均可见大量DAPI标记的骨骼肌卫星细胞,实验组还可见大量EGFP-碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白绿色荧光表达;②实验组、对照组新生微血管密度多于空白对照组(P<0.05),实验组新生微血管密度多于对照组(P<0.05);③结果表明,碱性成纤维细胞生长因子修饰骨骼肌卫星细胞可在急性心肌梗死区存活,促进心肌梗死区血管新生.
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外周血干细胞输注对肺腺癌免疫行为的影响
背景:目前临床上自体外周血干细胞分离鉴定方法相对较多,尚缺乏统一的标准.同时自体外周血干细胞在肺腺癌移植治疗过程中对免疫的影响也缺乏报道.目的:探讨自体外周血干细胞的分离、鉴定方法,观察自体外周血干细胞移植对肺腺癌大鼠免疫功能的影响.方法:采用密度梯度离心法从Wistar大鼠外周血分离单个核细胞并进行鉴定.将18只Wistar大鼠随机分为常规处理组和细胞移植组,每组9只,建立肺腺癌模型,常规处理组不给予任何方法治疗,细胞移植组经尾静脉注入0.2 mL含有2.5×106 L-1的自体外周血干细胞悬液,大鼠治疗后检测其免疫指标.2组大鼠分别于治疗4,10,14 d后麻醉处死(n=3),观察自体外周血干细胞移植治疗对肺腺癌免疫行为的影响.结果与结论:①从大鼠外周血新分离的单个核细胞呈现圆形或者椭圆形,且体积相对较小;自体外周血干细胞培养5d后细胞生长迅速,圆形细胞开始向两端伸展,并呈现梭形,从而能够形成较小的细胞集落;自体外周血干细胞体外诱导培养后先后经历了生长滞缓期、对数增殖期以及生长平台期;②流式细胞仪分选纯化的细胞,干细胞因子受体CD90、CD133及Flk-1均有表达,提示分离培养获得的细胞为自体外周血干细胞;③自体外周血干细胞培养4,10,14 d后检测其表面抗原表达结果显示,CD90,CD133呈现先升高后下降趋势;Flk-1呈现上升趋势;④在移植治疗后第4,10,14天,细胞移植组免疫指标肿瘤坏死因子诱导蛋白6显著高于常规处理组(P<0.05),而核因子κB显著低于常规处理组(P<0.05);⑤结果提示,自体外周血干细胞分离、鉴定方法比较简单,并且应用于治疗肺腺癌能够分泌大量营养因子,治疗过程中能够增强机体免疫.
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人羊膜间充质干细胞原位移植治疗大鼠脑梗死
背景:前期实验研究发现,移植人羊膜间充质干细胞能有效改善脑梗死大鼠的神经损伤症状.目的:观察移植人羊膜间充质干细胞在大鼠脑梗死区域的存活、定植和分化情况.方法:将60只SD大鼠随机分为3组,实验组、模型组采用线栓法制作大脑中动脉闭塞模型,假手术组只结扎血管,不插入线栓;造模后1 d,实验组于受损纹状体和皮质两点原位植入10μL第3代人羊膜间充质干细胞悬液(含细胞2×106/只),模型组与假手术组于相同部位注射等体积PBS.移植后1周连续监测体质量并进行神经缺损严重程度评分;移植后2周,TTC染色观察脑梗死面积,苏木精-伊红染色观察脑组织病理学变化,免疫荧光染色检测移植大鼠大脑神经细胞标志物神经元特异性核蛋白的表达.结果与结论:①体质量与神经缺损严重程度评分:与假手术组比较,模型组、实验组体质量呈下降趋势,实验组降低少于模型组,但差异无显著性意义;模型组、实验组神经功能缺损评分随时间呈逐渐降低趋势,但实验组评分明显低于模型组;②脑梗死面积:模型组大脑皮质出现局灶性缺血坏死且范围较大,与模型组比较,实验组缺血灶面积明显缩小;③脑组织病理:实验组梗死病灶范围、神经细胞及炎细胞浸润均少于模型组;④免疫荧光染色:移植后1周,实验组脑组织可见较多的移植人羊膜间充质干细胞,2周后可见移植的人羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化;⑤结果表明:人羊膜间充质干细胞移植可在大鼠脑梗死区域定植、存活,且在原位能分化为神经样细胞.
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异基因造血干细胞移植治疗染色体核型预后中等急性髓系白血病
背景:以往研究显示完全缓解期染色体核型预后中等的急性髓系白血病患者行亲缘全相合异基因外周血造血干细胞移植有较高的无病生存率和总体生存率,但影响移植预后的相关因素并未完全明确.目的:评价HLA相合异基因外周血造血干细胞移植治疗完全缓解期染色体核型预后中等急性髓系白血病的疗效,并对预后相关因素进行分析.方法:对2009年1月至2015年1月进行HLA全相合异基因外周血造血干细胞移植的50例完全缓解期染色体核型预后中等的急性髓系白血病患者进行回顾性分析,计算总体生存率,并对影响预后的各因素进行统计学分析.结果与结论:①4年总体生存率为64%,累积复发率及移植相关非复发死亡率分别为18%及20%.急性移植物抗宿主病的总体发生率为26%;②女性供者男性受者配对移植患者4年总体生存率低于非女性供者男性受者移植患者(P=0.041);移植前大于1个疗程才能达完全缓解的患者4年总体生存率低于移植前1个疗程能达完全缓解的患者(P=0.038);年龄≥40岁的患者4年总体生存率低于年龄<40岁的患者(P=0.056);亲缘供者移植和非亲缘移植患者的4年总体生存率差异无显著性意义(P=0.427).女性供者男性受者移植及年龄≥40岁患者移植相关非复发死亡率明显增高(P值分别为0.024和0.043);③多因素分析确认,与移植预后相关的因素有:女性供者男性受者配对移植(P=0.031,RR=1.38,95%CI 1.03-1.95)、移植前大于1个疗程才能达完全缓解(P=0.016,RR=1.46,95%CI 1.10-1.98)、年龄≥40岁(P=0.024,RR=1.63,95%CI 1.32-2.12);④结果表明,HLA全相合异基因外周血造血干细胞移植是染色体核型预后中等急性髓系白血病缓解后治疗的有效方法.女性供者男性受者配对移植、移植前大于1个疗程才能达完全缓解、年龄≥40岁是影响这类患者预后的主要危险因素.这类患者行异基因外周血造血干细胞移植时,供者受者的性别组合比是否为亲缘供者更为重要.
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硫酸软骨素酶联合脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性
背景:有研究发现硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖能够促使视网膜上Müller细胞的移行,但硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖是否能促进脂肪间充质干细胞在视网膜变性大鼠视网膜的移行尚不明确.目的:探讨硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖对脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性的影响.方法:分离并培养人脂肪间充质干细胞,建立视网膜变性大鼠模型,向视网膜变性大鼠视网膜下腔注射脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶,观察移植后大鼠脂肪间充质干细胞迁移率和视网膜细胞凋亡情况.结果与结论:人脂肪间充质干细胞能够成功培养,BrdU对人脂肪间充质干细胞的标记率达90.0%以上.建模后7 d,视网膜外核层塌陷,光感受器细胞大量外节迸解,外核层贴附在Bruch''s膜上,视网膜呈拱桥样,中央视网膜和外周视网膜均受到损伤;正常大鼠视网膜各层清晰,光感受器细胞排列规律,视网膜色素上皮层完整.脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组脂肪间充质干细胞迁移率高于脂肪间充质干细胞组,且2组视网膜细胞凋亡率比较差异无显著性意义.表明硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖可提高人脂肪间充质干细胞在视网膜上的迁移能力.
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过表达miR-378骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死
背景:近发现,miR-378能调节骨髓间充质干细胞的抗缺氧能力,减轻其在缺氧环境下的凋亡.目的:观察miR-378过表达骨髓间充质干细胞在大鼠心肌梗死模型中的治疗作用.方法:体外培养至第3代的大鼠骨髓间充质干细胞用反转录病毒感染建立miR-378过表达细胞系.选用成年SD大鼠,结扎前降支制作急性心肌梗死模型,随机分为3组:对照组(n=10)、BMSCnul组(n=16)、BMSCmiR-378组(n=16).对照组仅注射50μL生理盐水,后2组梗死局部注射50μL生理盐水中含1×107个空病毒转染和miR-378模拟物转染的骨髓间充质干细胞.移植24 h后,利用TUNEL染色测定移植骨髓间充质干细胞的凋亡率,Western blotting检测移植区域内血管内皮生长因子、转化生长因子β1蛋白表达.移植4周后,利用心脏超声评价心功能,取局部心肌组织行组织学及分子生物学分析.结果与结论:①移植24 h后,BMSCmiR-378组中凋亡细胞明显少于BMSCnul组(n=6,P<0.001),血管内皮生长因子、转化生长因子β1表达水平明显高于BMSCnul组(n=6,P<0.001);②移植4周后,BMSCmiR-378组中存活和分化为心肌细胞的骨髓间充质干细胞数量明显多于BMSCnul组(n=10,P<0.001).与其他2组相比,BMSCmiR-378组中新生血管数量明显增多(P<0.001);心肌梗死面积明显减小(P<0.001);左室射血分数明显增加(P<0.05);左室舒张末容积明显缩小(P<0.05).BMSCnul组中上述参数明显优于对照组(P<0.05);③结果表明,miR-378过表达可提高移植骨髓间充质干细胞的抗缺氧能力,继而促进心肌修复.
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人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化
背景:人羊膜上皮细胞来源稳定,正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源.目的:建立人羊膜上皮细胞体外分离培养、成脂、成软骨、成骨诱导分化的方法.方法:通过胰蛋白酶消化法从人胎盘羊膜中分离羊膜上皮细胞,进行体外培养与鉴定,观察培养12 d内的细胞生长曲线.取P1代羊膜上皮细胞,分别进行成脂、成软骨、成骨诱导,以常规培养细胞为对照,诱导16 d后,分别进行油红O染色、Masson染色及碱性磷酸酶染色,同时采用荧光定量PCR检测诱导过程中成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达变化.结果与结论:①从人羊膜中分离出的羊膜上皮细胞,免疫荧光检测表达上皮细胞标记物CK19;②P1代细胞具有较强的分裂增殖能力,P2细胞与P1相比增殖能力略有下降,P3细胞增殖能力差;③羊膜上皮细胞经成脂、成软骨、成骨诱导后,油红O染色有红色脂滴,Masson染色有亮蓝色软骨基质,碱性磷酸酶染色有红褐色钙结节;随着诱导时间的延长,成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达量升高;④结果表明,采用酶消化法可从人羊膜中分离得到羊膜上皮细胞,羊膜上皮细胞可向脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞分化.
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EdU标记兔外周血单个核细胞的体外增殖
背景:外周血单个核细胞群中含有外周血干细胞,其体外增殖情况仍不清楚,体内移植也缺乏良好的标记物.目的:以EdU作为标记物,观察外周血单个核细胞在干细胞培养基中的增殖情况,以及探讨EdU标记外周血干细胞的可行性.方法:分离新西兰兔外周血单个核细胞,在加入EdU的干细胞培养液中培养1-5 d;于不同的时间点观察细胞形态和进行细胞计数;收获细胞,进行EdU染色,观察EdU阳性细胞并检测阳性率.结果与结论:①刚分离出的外周血单个核细胞为类圆形,轮廓清晰;经过1d培养时,大部分细胞仍悬浮在培养液中,球形或类圆形,有细胞团出现,也见少量细胞散在贴壁,呈现三角形或多边形;培养2d时,可见较多细胞碎片,大多数细胞仍为类圆形;培养3-5d时,细胞碎片增多,细胞团体积变小,细胞密度明显降低;②随着培养时间的延长,细胞计数逐渐降低;③在培养1 d时,有散在EdU红色标记细胞;在培养2 d时,EdU红色标记细胞明显增多,并在培养三四天时维持不明显的变化;在培养5 d时,EdU红色标记的细胞明显减少;培养2 d时,EdU阳性细胞率高,为(2.38±0.10)%;④结果表明,外周血单个核细胞群中增殖细胞率很低,EdU能标记外周血单个核细胞中有增殖能力的细胞.
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低氧下血管内皮细胞生长因子转染人骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞的分化
背景:已有研究发现血管内皮细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞,但在机体损伤的低氧环境下,血管内皮细胞生长因子基因是否可促进骨髓间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞?目的:观察低氧环境下,经血管内皮细胞生长因子诱导的人骨髓间充质干细胞是否能够向血管内皮样细胞分化.方法:在含体积分数5%O2环境中,将第3代人骨髓间充质干细胞分组培养,对照组以常规培养基培养,实验组以含血管内皮细胞生长因子载体的腺病毒诱导液培养.培养2周后,进行形态学观察及表面相关分子检测,ELISA检测细胞培养上清液中血管内皮细胞生长因子及内皮型一氧化氮合成酶因子水平,RT-PCR和Western blotting检测内皮素和前列环素蛋白表达.结果与结论:①对照组细胞数量较多,呈拥挤状,排列不齐,呈纤维样生长;实验组细胞多呈三角形或多边形,集落状生长,呈铺路石子样;②对照组CD31为阴性表达,CD105为阳性表达且阳性率为99.7%,表明细胞仍呈现骨髓间充质干细胞的表型.实验组CD31表达明显上升,阳性率为30.33%;CD105表达下降,阳性率为58.11%,呈现典型的内皮细胞表型;③与对照组比较,实验组内皮素、血管内皮细胞生长因子及内皮型一氧化氮合成酶表达增高(P<0.01),前列环素表达降低(P<0.01);④结果表明在低氧环境下,血管内皮细胞生长因子具有促使人骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的能力.
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白细胞介素12基因修饰骨髓间充质干细胞对卵巢癌细胞生长的影响
背景:骨髓间充质干细胞具有来源广泛、免疫原性低等优点,尤其易于导入和表达外源基因,作为抗肿瘤基因治疗的载体具有明显优越性.目的:探讨骨髓间充质干细胞负载白细胞介素12重组腺病毒对卵巢癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响.方法:腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞,RT-PCR和Western Blotting测定骨髓间充质干细胞中白细胞介素12 mRNA和蛋白的表达,ELISA法测定细胞上清液中白细胞介素12水平.将SKOV3卵巢癌细胞与白细胞介素12重组腺病毒转染的骨髓间充质干细胞上清液共培养,对照组为SKOV3细胞与未转染骨髓间充质干细胞上清液共培养,MTT法测定SKOV3细胞增殖活性,流式细胞仪检测SKOV3细胞周期和细胞凋亡率.结果与结论:①腺病毒介导白细胞介素12基因成功转染到骨髓间充质干细胞中,转染后细胞有白细胞介素12 mRNA和蛋白的表达,空病毒载体组和空白对照组骨髓间充质干细胞未检测到白细胞介素12表达;②培养48 h,白细胞介素12组骨髓间充质干细胞上清液中白细胞介素12水平为(68.78±12.35)μg/L,空病毒载体组和空白对照组骨髓间充质干细胞上清液中未检测到白细胞介素12;③白细胞介素12转染组骨髓间充质干细胞上清液对SKOV3细胞增殖有抑制作用,细胞增殖抑制率随时间的延长而增加(P<0.05).转染组SKOV3细胞G1期细胞比例高于对照组(P<0.05),G2期细胞比例低于对照组(P<0.05).转染组SKOV3细胞凋亡率高于对照组(P<0.05);④结果表明,转染白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞能够表达白细胞介素12,其培养上清液能够抑制卵巢癌细胞增殖并诱导其凋亡.
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含抗骨增生胶囊血清预处理骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化
背景:课题组前期研究发现抗骨增生胶囊可促进骨折愈合.目的:观察含抗骨增生胶囊血清对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响.方法:将40只SD大鼠随机分4组,低、中、高剂量组分别灌胃给予抗骨增生胶囊药粉11.6,34.8,104.4 g/kg,空白组灌胃给予等量生理盐水,1次/d,连续灌胃12 d后,腹主动脉采血,分离血清备用.应用全骨髓贴壁培养法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分4组培养,分别加入含上述4种血清的成骨培养基中诱导培养,培养24,48,72 h,检测细胞增殖;培养7,14 d,检测细胞碱性磷酸酶活性;培养7 d,进行碱性磷酸酶染色;培养14 d,进行茜素红染色.结果与结论:①与空白组比较,低剂量组细胞增殖无明显变化,中、高剂量组培养48,72 h的细胞增殖显著升高(P<0.05);②与空白组比较,低剂量组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化,中、高剂量组培养7,14 d的细胞碱性磷酸酶活性显著升高(P<0.05);③低、中、高剂量组均可见碱性磷酸酶及茜素红染色阳性,以高剂量组效果明显;④结果表明,含抗骨增生胶囊血清可促进骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化.
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基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比
背景:腺病毒载体和慢病毒载体均是较好的组织工程基因载体,两者在介导骨形态发生蛋白2转染兔骨髓间充质干细胞中的差异尚待探究.目的:比较腺病毒和慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染体外培养兔骨髓间充质干细胞的转导效率、持续时间及外源基因表达差异.方法:将第5代兔骨髓间充质干细胞分3组培养,A组以腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2(Ad-EGFP/BMP-2)转染细胞,B组以慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2(Lenti-EGFP/BMP-2)转染细胞,C组为未进行转染.转染24 h、48 h、72 h、1周、3周,检测EGFP基因表达;转染72 h后,免疫组织化学观察细胞骨形态发生蛋白2的表达;转染后72 h、1周、3周,Western blot检测骨形态发生蛋白2蛋白表达.结果与结论:①转染24 h后,A、B组可见EGFP表达,A组明显强于B组;转染48 h后,A、B组荧光进一步增强;转染72 h后,A组荧光强度近高峰,B组荧光持续增强.转染1周后,A组荧光强度开始下降,B组荧光强度仍然增强.转染3周后,A组荧光强度明显下降甚至消失,B组荧光强度有所下降,但仍然保持一定的表达.C组在各时间点均无EGFP表达;②A、B组胞浆均呈骨形态发生蛋白2阳性表达,C组呈阴性表达;③转染72 h后,A组骨形态发生蛋白2蛋白表达量强于B组;转染1周后,A组表达下降,B组表达增强并强于A组;转染3周后,A组表达微弱,B组持续表达且明显强于A组;④结果表明,相对腺病毒载体,慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势.
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大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性
背景:如何能简便高效地获得均质性的骨髓间充质干细胞群是软骨组织工程研究的重点.目的:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性.方法:抽取30只SD大鼠股骨以及胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪测定细胞表面标记物的表达,细胞计数法观察细胞生长增殖能力,MTT法检测细胞存活率.结果与结论:①刚分离培养的细胞呈圆形、椭圆形,部分细胞呈三角形,接种12-15 d后,细胞开始融合,传代后细胞增殖速度加快,传代2h后细胞均匀分布在瓶底;②随着传代次数的增加,细胞增殖能力出现下降趋势,第1-5代细胞存活率均超过95%,显著高于第6代和第7代(P<0.05);③骨髓间充质干细胞表面CD34呈阴性表达,CD44呈阳性表达;④结果表明,采用全骨髓贴壁法可有效分离大鼠骨髓间充质干细胞,获得的细胞生长稳定,增殖能力强,可选用前5代细胞作为软骨组织工程的种子细胞.
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骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力
背景:应用骨形态发生蛋白2(BMP2)和血管内皮生长因子165(VEGF165)双基因转染骨髓基质干细胞诱导成骨,为组织工程骨的研究提供实验基础.目的:探讨BMP2和VEGF165双基因转染大鼠骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力.方法:4周龄SD大鼠4只,取股骨、胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,取第3代骨髓基质干细胞分为5组,分别为未转染组、空载质粒组、BMP2单基因转染组、VEGF165单基因转染组、BMP2和VEGF165双基因共转染组,转染后48 h通过Western Blot检测BMP2和VEGF165蛋白表达变化,转染后7d检测各组细胞的碱性磷酸酶活性.结果与结论:①BMP2和VEGF165双基因共转染组和BMP2单基因转染组中有大量的BMP2分泌.BMP2和VEGF165双基因共转染组和VEGF165单基因转染组中有大量的VEGF165分泌.双基因共转染组中BMP2和VEGF165蛋白水平与单基因转染组比较,差异有显著性意义(P<0.05);②BMP2和VEGF165双基因共转染组中碱性磷酸酶活性高,其次是BMP2单基因转染组,而VEGF165单基因转染组明显不如前两组,但是略高于空质粒转染组和未转染组.统计分析表明双基因共转染组与单基因转染组比较,差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明,BMP2和VEGF165双基因转染促进骨髓基质干细胞异位成骨的能力更强.
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干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性
背景:以CD133为标志物,利用其蛋白特异性特征可对不同的肿瘤干细胞进行分选和研究.目的:探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外增殖特性.方法:对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选,分别获得CD133+与CD133-MHCC97-H细胞,检测CD133表达及细胞迁移侵袭能力;培养14 d,检测细胞克隆形成率;培养7 d,检测细胞增殖及Notch基因蛋白表达.将CD133+与CD133-MHCC97-H细胞分别接种于裸鼠背部皮下,4周后,检测成瘤情况.结果与结论:①CD133表达与细胞克隆形成率:CD133+MHCC97-H细胞CD133表达率、克隆形成率均显著大于CD133-MHCC97-H细胞(P<0.05);②细胞增殖:CD133+MHCC97-H细胞培养3-7 d的吸光度值大于CD133-MHCC97-H细胞(P<0.05);③细胞迁移侵袭:CD133+MHCC97-H细胞迁移与侵袭实验的透膜细胞数均显著多于CD133-MHCC97-H细胞(P<0.05);④Notch基因蛋白:CD133+MHCC97-H细胞Notch基因蛋白表达多于CD133-MHCC97-H细胞(P<0.05);⑤成瘤实验:CD133-MHCC97-H细胞组成瘤体积大于CD133-MHCC97-H细胞组(P<0.05);⑥结果表明:CD133阳性肝癌细胞亚群具有较强的体外增殖特性,具有一定的肿瘤干细胞特性,并有较强的侵袭、转移及致瘤能力.
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小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响及其机制
背景:前期研究发现小檗碱对多种肿瘤和肿瘤干细胞具有抑制作用,但是对肺癌干细胞的影响报道较少.目的:探讨小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制.方法:采用免疫磁珠法分离CD133+肺癌干细胞,MTT法和流式细胞仪分别检测不同质量浓度小檗碱(0,2.5,5,10,20,40 mg/L)对CD133+肺癌干细胞增殖和凋亡的影响,免疫印迹检测小檗碱(0,20 mg/L)对肺癌干细胞中Ki67、Bax、Bcl-2、PTCH1、SHH、Gli-1和SMO蛋白表达的影响.结果与结论:①采用免疫磁珠法分选得到高比率的CD133+肺癌干细胞;②小檗碱抑制肺癌干细胞生长,并呈浓度依赖性;③小檗碱促进肺癌干细胞凋亡,并呈浓度依赖性;④Ki67、Bcl-2、PTCH1、SHH、Gli-1和SMO蛋白在20 mg/L小檗碱组中的表达水平明显低于未加药组,Bax蛋白的表达水平则明显高于未加药组;⑤结果表明,小檗碱可能通过调控Hedgehog信号通路抑制肺癌干细胞增殖,促进其凋亡.
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基于"单细胞移植-成瘤性验证"模式鉴定肝癌干细胞
背景:目前尚无较有效的肝癌干细胞的鉴定方法.目的:探索更为简单有效并适用于鉴定肝癌肿瘤细胞株中干细胞的方法.方法:首先利用单细胞分离技术获得单个细胞,逐个种入96孔板中,经筛选获得单细胞克隆(即成瘤性克隆)来源的细胞亚株,细胞亚株移植到裸鼠前肢腋下观察其成瘤作用.结果与结论:利用单细胞分离技术获得单细胞/孔的孔数为371个,成功率为96.4%;按照单细胞克隆的生长情况,筛选获得的来源于成瘤性克隆的细胞亚株移植到裸鼠前肢腋下,成瘤率为100%.结果证实"单细胞移植-成瘤性验证"具有鉴定肝癌干细胞的有效性,为后续的研究奠定技术和方法基础.
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结直肠癌组织中CD44+/SOX2+肿瘤干细胞的分布及形态特征
背景:CD44是常用的结直肠癌肿瘤干细胞标志物,近年来发现转录因子SOX2是潜在的结直肠癌肿瘤干细胞标志物.目的:观察CD44+/SOX2+细胞在结直肠癌组织中的数量、分布及形态特征,探讨CD44+/SOX2+是否可作为结直肠癌肿瘤干细胞标志物.方法:运用免疫组织化学双重染色方法观察10例正常肠黏膜、20例结直肠腺瘤及88例癌组织标本中CD44+/SOX2+细胞的数量、分布规律;苏木精-伊红染色观察结直肠癌组织中CD44+/SOX2+细胞的形态特征.结果与结论:①正常肠黏膜中未见到CD44+/SOX2+细胞,结直肠腺瘤组织中可见极少量CD44+/SOX2+细胞,结直肠癌中可见少量CD44+/SOX2+细胞;②CD44+/SOX2+细胞在高、中分化腺癌中呈小灶性或点状散在分布于隐窝基底部或共壁腺管侧,在低分化腺癌中呈小灶性或点状散在分布于其他癌细胞中;③在苏木精-伊红染色切片中CD44+/SOX2+细胞体积小,呈圆形、椭圆形结构,胞浆少,核大,核仁明显,核分裂象少见;④CD44+/SOX2+的表达与结直肠癌患者年龄、性别、部位及浸润深度均无相关性,与分化程度呈负相关,与TNM分期、远处转移均呈正相关;⑤结果提示,CD44+/SOX2+细胞的分布、形态特征等符合肿瘤干细胞特性,CD44+/SOX2+可能是结直肠癌肿瘤干细胞标志物.
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Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响
背景:Runx2在成骨分化的信号途径中起核心作用,在诱导干细胞成骨分化及促进骨愈合方面具有重要的研究意义.目的:观察Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化的影响.方法:①扩增Runx2基因,利用腺病毒载体构建Runx2重组腺病毒(pAd-Runx2),检测病毒滴度后用重组腺病毒感染脐血间充质干细胞,并于荧光显微镜下观察荧光表达变化;②感染后1,3,7,14 d采用实时荧光定量PCR及Western blot检测脐血间充质干细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP的mRNA和蛋白表达.结果与结论:①成功制备pAd-Runx2重组腺病毒,病毒滴度为1.7×1010 pfu/L;②Runx2重组腺病毒感染脐血间充质干细胞后细胞形态呈成骨样细胞改变,对照组细胞无明显变化;③感染组细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP mRNA和蛋白的表达量随感染时间的增加均有不同程度的上调;④结果表明,高表达Runx2基因腺病毒感染脐血间充质干细胞,能够上调BMP-2、OCN、ALP基因的表达,从而促进脐血间充质干细胞的成骨分化.
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树鼩脐带间充质干细胞分离、培养及成骨成脂分化的鉴定
背景:脐带间充质干细胞是组织工程研究中的理想种子细胞.目的:分离、培养及鉴定树鼩脐带间充质干细胞,建立标准化的树鼩脐带间充质干细胞株.方法:采用剖腹产分离树鼩脐带,用组织块贴壁法培养脐带间充质干细胞,用流式标记法检测脐带间充质干细胞表面标志,用成骨、成脂诱导培养基诱导脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化.结果与结论:①细胞鉴定:培养的脐带间充质干细胞CD90和CD105的阳性表达率分别为99.9%和99.8%,造血干细胞标志物CD34的表达率为0.0%,内皮细胞标志物CD31的表达率为0.7%,符合脐带间充质干细胞表面标志特征.②细胞形态:诱导后的脐带间充质干细胞茜素红染色观察到钙结节,油红O染色观察到脂滴.③结果证实,实验成功分离培养了具备成骨成脂分化能力的树鼩脐带间充质干细胞.
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腺病毒转染MafA诱导人脐带间充质干细胞表达胰腺细胞特异性基因
背景:人脐带间充质干细胞经化学药物或共培养等方法诱导后胰岛素分泌量低,转染胰腺发育特异性基因诱导干细胞向成熟β细胞分化是近年来的研究热点.目的:探讨MafA基因转染后人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能.方法:腺病毒携带外源性β细胞发育的关键转录因子MafA(Ad-MafA-EGFP),转染入第3代人脐带间充质干细胞,诱导后7 d观察细胞的形态学变化,应用PCR检测细胞中胰腺细胞特异性基因(glucagon、Pdx1、Nkx2.2)的表达.结果与结论:①经Ad-MafA-EGFP转染后,倒置相差显微镜下观察人脐带间充质干细胞形态未见明显变化;②荧光显微镜下观察Ad-MafA-EGFP已进入细胞内;③经Ad-MafA-EGFP诱导后,人脐带间充质干细胞中人源性胰腺前体细胞glucagon、Pdx1、Nkx2.2基因表达增高,为人脐带间充质干细胞进一步分化成熟胰腺β细胞提供实验依据.
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IGF2基因印记丢失对胚胎干细胞向胰岛样细胞诱导分化的影响
背景:IGF2是一种重要的胚胎有丝分裂生长促进因子,在维持细胞正常生长过程中起关键作用,其基因表达以基因组印迹方式受表观遗传调控.当IGF2发生印迹丢失时,与个体的非正常发育以及肿瘤发生存在一些联系.目的:探讨IGF2基因发生印记丢失对小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为胰岛样细胞的影响.方法:体外诱导2种小鼠胚胎干细胞(SF1-G和SF1-1)向胰岛样细胞分化;Real-Time PCR和细胞免疫荧光检测Insulin基因的表达;聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)检测印迹基因IGF2在诱导分化前后细胞中的亲本表达;体外胰岛素释放实验检测诱导终末细胞的胰岛素释放水平.结果与结论:①IGF2基因印记正常(SF1-G)和印记丢失(SF1-1)的2种小鼠胚胎干细胞在诱导分化前后印迹状态没有发生改变;②在诱导的终末细胞中,尽管2种细胞的胰岛素释放水平差异无显著性意义,但是Insulin基因在SF1-1组中的表达水平要高于其在SF1-G组的表达水平;③IGF2基因印记丢失可能与诱导分化来源的终末细胞中Insulin基因的表达上调相关.
