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超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究
目的探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究.方法VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.结果超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达,10h后可达高锋,持续3天左右,其后有些细胞荧光开始减退.结论VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性.
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经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建与临床应用
目的 构建经血管内皮生长因子165(VEGF165)转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,并对其在促进深度烧伤患者创面愈合过程中的作用进行评价.方法 将30例深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤患者随机分为2组,每组15例.移植转染有VEGF165成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物组为实验组,单纯脱细胞异种真皮替代物移植组为对照组.采用分子生物学方法 将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的人成纤维细胞,再将转染后的人成纤维细胞接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于深度烧伤患者切痂后创面,对创面愈合情况进行观察并与单纯脱细胞真皮移植组进行比较.结果 构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165可成功转染人成纤维细胞,经转染的人成纤维细胞可顺利接种于脱细胞真皮形成成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,替代物移植后实验组患者皮片成活率(90.25±5.39)%,对照组患者皮片成活率(83.98±3.63)%,两者有显著性差异(t=3.737,P＜0.01).实验组新生的毛细血管数量要明显多于对照组.结论 经VEGF165转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物具有显著的促进深度烧伤患者创面愈合的作用.
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重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性
目的 构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的 基因的表达,对目的 蛋白进行鉴定和生物学活性分析.方法 分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的 蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析.结果 构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH 3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的 基因得到稳定表达,目的 蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性.结论 应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白.
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超声辅助转基因治疗缺血性心脏病的骨髓间充质干细胞的实验研究
目的血管内皮生长因子(VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究.方法 VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.结果超声辅助转染后5 h可见细胞内有GFP表达,10 h后出现表达高锋,持续3 d左右,其后有些细胞荧光开始减退.结论 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性.
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骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力
背景:应用骨形态发生蛋白2(BMP2)和血管内皮生长因子165(VEGF165)双基因转染骨髓基质干细胞诱导成骨,为组织工程骨的研究提供实验基础.目的:探讨BMP2和VEGF165双基因转染大鼠骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力.方法:4周龄SD大鼠4只,取股骨、胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,取第3代骨髓基质干细胞分为5组,分别为未转染组、空载质粒组、BMP2单基因转染组、VEGF165单基因转染组、BMP2和VEGF165双基因共转染组,转染后48 h通过Western Blot检测BMP2和VEGF165蛋白表达变化,转染后7d检测各组细胞的碱性磷酸酶活性.结果与结论:①BMP2和VEGF165双基因共转染组和BMP2单基因转染组中有大量的BMP2分泌.BMP2和VEGF165双基因共转染组和VEGF165单基因转染组中有大量的VEGF165分泌.双基因共转染组中BMP2和VEGF165蛋白水平与单基因转染组比较,差异有显著性意义(P<0.05);②BMP2和VEGF165双基因共转染组中碱性磷酸酶活性高,其次是BMP2单基因转染组,而VEGF165单基因转染组明显不如前两组,但是略高于空质粒转染组和未转染组.统计分析表明双基因共转染组与单基因转染组比较,差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明,BMP2和VEGF165双基因转染促进骨髓基质干细胞异位成骨的能力更强.
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VEGF165对兔动脉粥样硬化斑块影响的实验研究
目的观察VEGF165对动脉粥样硬化斑块形成与发展的影响.方法利用高胆固醇饲料复制动脉粥样硬化兔模型.15只日本大耳白兔随机分为3组,A组,阴性对照组,仅给普通饲料喂养,B、C组给高胆固醇饲料喂养,喂养到第3周(21 d),A组及B组肌注白蛋白(2 μg/kg),C组肌注VEGF165(2 μg/kg),继续以前的方式饲养3周(42 d)处死动物,截取胸主动脉进行计量组织学及免疫组织化学分析.结果 (1)斑块面积(A组 0%,B组 1.81%±0.61%,C组 24.12%±3.58%),斑块周径(A组 0,B组 6.05%±1.62%, C组 25.71%±1.97%)及斑块大厚度(A组 0,B组0.06 mm±0.002 mm, C组 0.16 mm±0.007 mm),三组之间相比有显著性差异(P＜0.05);(2)新生血管密度[CD34阳性细胞数(cells/mm2)A组0, B组 12.35±2.02, C组 61.15±7.55]各组之间比较有显著性差异(P＜0.05);(3)电镜显示:新生血管与动脉粥样斑块相邻,新生血管腔内可见淋巴细胞;(4)VEGF组CD34阳性细胞数与斑块面积之间呈正相关(r=0.989,P＜0.001).结论 VEGF165能促进兔动脉粥样硬化斑块的形成与发展.
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VEGF165和VEGF165b与肿瘤关系的研究进展
目前已知肿瘤的生长和转移依赖于血管的形成,而血管形成主要是由促血管生成因子和抑制因子调控失衡,促血管生成因子增多所致.促血管生成因子中作用强且研究广泛的就是血管内皮生长因子(VEGF).VEGF根据VEGFmRNA剪接方式不同分为多个变构体,有VEGF121、VEGF145 、VEGF165 、VEGF183、VEGF189 和VEGF206,而VEGF165是体内多的亚型,其生物活性强且cDNA扩增丰度高,故在临床和实验中应用广.近年来又发现一种内源性剪接变构体,即VEGF165b,它因具有抑制VEGF165介导的血管生成作用[1]和潜在的临床应用价值而受到关注.作者就VEGF165和VEGF165b的结构、作用、作用机制以及与肿瘤的关系作一综述.
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重组VEGF165基因表达与活性检测
目的 为血管内皮生长因子(VEGF165)生物学分子机制的研究奠定基础.方法 用RT-PCR法从人胎肝总RNA中逆转录扩增VEGF165,将其插入表达载体pET-32a(+) Vector中, 将测序鉴定正确的重组表达载体转化至E. Coli XL-Blue中表达,并用纯化蛋白刺激人脐静脉内皮细胞,检测其促增殖活性.结果 经异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)诱导后,VEGF165(His)6得到有效表达, Western blot分析可以观察到相对分子质量为26 kD的诱导表达条带,该表达蛋白可与VEGF多克隆抗体发生特异性反应.用His-bind亲和层析纯化得到纯度较高的目的 蛋白,该蛋白可促进内皮细胞增殖.结论 基因工程技术可使大肠杆菌有效表达人VEGF165,并得到纯度较高、有增殖活性的VEGF165蛋白;此为进一步研究VEGF的生物学分子机制奠定了基础.
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慢病毒-血管内皮生长因子165载体的构建及其在脂肪组织来源的干细胞中过表达的研究
目的 构建慢病毒-血管内皮生长因子165(VEGF165)载体并转染脂肪组织来源干细胞(ADSCs)以得到用于基因治疗的种子细胞.方法 通过聚合酶链反应(PCR)方法将EHS10016895048 5313912克隆突变成VEGF165(NM_001025368)转录本后采用三质粒系统(pGC-FU、pHelp1.0和pHelp2.0)进行包装慢病毒.通过定时定量PCR测定滴度后使用慢病毒-VEGF165转染ADSCs.免疫荧光、Western blot鉴定VEGF165在ADSCs中的表达.结果 PCR(535 bp)、DNA测序、Western blot(49×103)检测证明成功构建的载体为VEGF165与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体.实时定量PCR确定病毒滴度达到2×108TU/ml.慢病毒-VEGF165载体转染ADSCs后经免疫荧光验证约95%ADSCs可表达VEGF165同时Western blot也证明基因稳定表达.结论 通过获得稳定表达VEGF165的ADSCs,为血管性疾病特别是糖尿病性勃起障碍的治疗奠定了基础.
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脑室注射VEGF165对实验性脑出血大鼠血脑屏障的影响
目的研究VEGF165对实验性脑出血大鼠血脑屏障的保护作用.方法应用立体定向技术,用大鼠自体尾动脉不抗凝动脉血液60μl缓慢注入大鼠尾状核来制成脑出血模型,并同时向侧脑室内注射VEGF165,观察VEGF165对脑出血后血脑屏障的影响.结果VEGF165可以明显降低脑组织含水量,改善血脑屏障通透性.结论VEGF165对脑出血大鼠血脑屏障有显著的保护和治疗作用.
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转染VEGF165基因的自体成肌细胞治疗心肌梗死的实验研究
目的:将体外培养、纯化并转染VEGF165基因的新西兰兔自体骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死区,观测转染VEGF165基因的成肌细胞移植对改善梗死区心肌血运重建和心功能的影响.方法:采用pcDNA3.1-VEGF165和pcDNA3.1质粒转染经体外培养及纯化的新西兰兔自体骨骼肌成肌细胞.结扎兔冠状动脉致局部心肌梗死后2周,分别于心肌梗死区移植转染VEGF165基因成肌细胞(实验组,n=8)和空载体成肌细胞(对照组,n=8),4周后观察心肌梗死边缘区毛细血管密度、植入细胞的形态鉴定和心功能改善情况.结果:成功将pcDNA3.1-VEGF165和pcDNA3.1质粒转染体外培养的兔自体骨骼肌成肌细胞,成肌细胞移植后能在梗死区种植成活、分化.实验组细胞移植区域的毛细血管密度较对照组高(P＜0.05).经Buxco系统有创心功能测定显示:实验组较对照组的左心室等容收缩期室内压大上升速率[+dp/dtmax,(1607.23±102.67) mmHg/s vs (1217.77±89.91) mmHg/s]和左心室等容舒张期室内压大下降速率[-dp/dtmax,(1535.09±81.34) mmHg/s vs (1174.58±91.50) mmHg/s]均有所改善.结论:转染VEGF165的成肌细胞能改善心肌梗死区域的血液供应,增加心肌收缩力,改善心功能.
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骨髓间充质干细胞移植对脑动脉栓塞大鼠VEGF165、Notch1表达的影响
为探究骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑损伤大鼠的改善作用机制,本实验通过建立脑损伤大鼠模型,观察BMSCs移植对脑动脉栓塞大鼠血管内皮生长因子(VEGF)165、Notch1表达的影响.将45只SD大鼠随机分为假手术对照组、动脉栓塞(MCAO)组、BMSCs移植组.检测脑组织栓塞区微血管数量,及各组大鼠VEGF165、Notch1蛋白和mRNA的表达.结果发现MACO组、BMSCs移植组大鼠的脑组织中微血管数量明显多于假手术对照组;MACO组和BMSCs移植组的VEGF165与Notch1的蛋白表达、VEGF165与Notch1的mRNA表达均高于假手术对照组;BMSCs移植组较MACO组更高.根据结果推测BMSCs移植可能通过激活Notch信号通路促进VEGF165的表达,而促进脑动脉栓塞区的血管新生.
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VEGF165b和VEGF165在胃癌组织中的表达及与预后的关系
目的 研究VEGF165b和VEGF165在胃癌及癌旁正常组织中的表达及胃癌组织中VEGF165bmRNA/VEGF165 mRNA与预后的关系.方法 分别应用实时RT-PCR和免疫组织化学法检测胃癌及癌旁正常组织中VEGF165b和VEGF165的基因及蛋白表达,并对患者进行2年的随访,比较VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA比值及这两种蛋白表达水平在胃癌及癌旁组织中的变化;同时分析VEGF165b与VEGF165蛋白表达的相关性以及胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA与预后的关系.结果 在胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA低于癌旁正常组织中的水平;在癌旁正常组织中VEGF165b基因及蛋白表达强于VEGF165,在胃癌组织中VEGF165b基因及蛋白的表达则低于VEGF165,而且两者表达呈负相关关系;此外,在两年内死亡的患者中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA明显低于生存患者中的比值水平.结论 与正常组织相比,胃癌组织中存在VEGF165b向VEGF165基因及蛋白水平上的优势转换,这种变化有望成为治疗胃癌的新靶点.
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VEGF165在哺乳动物细胞中的稳定表达
目的探讨pcDNA3.1-VEGF165质粒对哺乳动物细胞的表达和转染.方法将pcDNA3.1-VEGF165质粒用电转的方法导入CHO细胞中,G418筛选细胞克隆.通过RT-PCR、ELISA、Westen-blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF165在转基因CHO细胞中的表达.通过内皮细胞增殖实验和血管通透性实验检测所表达的VEGF165的生物学活性.结果获得有G418抗性的CHO细胞克隆.RT-PCR扩增出一条大小约600bp的特异性泳带,测序结果与VEGF165 mRNA一致.ELISA显示细胞培养上清的VEGF浓度约为10～20ng/ml.WESTEN-BLOT检测到大小为23KD的特异性蛋白质条带.内皮细胞增殖实验显示细胞培养上清具有促内皮细胞增殖作用.血管通透性实验显示细胞培养上清明显增加毛细血管通透性.结论 pcDNA3.1-VEGF165质粒真核表达系统能在哺乳动物细胞中表达具有良好生物学活性的VEGF165蛋白.
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VEGF165基因转染真皮多能干细胞的实验研究
目的 为获得高表达生物活性血管内皮细胞生长因子VEGF165的皮肤种子细胞,拟将转基因治疗与真皮多能干细胞相结合,为难愈性创面的促愈治疗奠定基础.方法 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF165,经脂质体法介导转染真皮多能干细胞;半定量RT-PCR检测VEGF165 mRNA的表达,Western blot和酶联免疫ELISA法检测VEGF蛋白的表达;并检测了表达产物的生物活性及转染VEGF(dermal multipotential stem cells,DMSCs)增殖活性的变化.结果 转染后VEGF165 mRNA和VEGF蛋白的表达均显著增强(P＜0.01),约为对照组的1.6倍,且转染VEGF后DMSCs的培养上清显著提高hECV304细胞增殖活性(P＜0.01).MTT结果显示转染VEGF后DMSCs增殖活性显著增高,约为转染空载体组DMSCs的2倍(P＜0.01).结论 成功获得了高水平表达并分泌具有生物活性的VEGF的基因治疗种子细胞DMSCs,为下一步动物在体进行基因治疗打下了基础.
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靶向VEGF165 RNA干涉对HeLa细胞凋亡的影响
RNA干涉(RNA interference,RNAi)是指序列特异性的转录后基因沉默,它已经发展成为高效、特异阻断目的基因表达的有效工具[1].据此,我们针对人VEGF165基因mRNA序列,设计了2个干涉靶位点,体外转录合成siRNA,通过脂质体转染入HeLa细胞,分别体内、体外观察对HeLa细胞凋亡的影响.
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慢病毒载体介导VEGF165基因修饰大鼠毛囊干细胞的实验研究
目的 为获得持续高表达VEGF165的大鼠毛囊干细胞(rat hair follicle stem cells,rHFSCs),观察慢病毒载体介导VEGF165基因对rHFSCs的转染及其表达情况.方法 切取1周龄SD大鼠触须部皮肤,Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合消化,显微镜下分离毛囊隆突部,组织块培养rHFSCs;经Ⅳ型胶原差速贴壁纯化后,分别取不同代次rHFSCs绘制细胞生长曲线;联合应用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)检测相关基因鉴定细胞.钙转法包装pLV-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-VEGF165-增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescent protein,EGFP)(实验组)和pLV-IRES-EGFP空载体(对照组)慢病毒,用两组慢病毒转染rHFSCs.倒置荧光显微镜下观察实验组绿色荧光表达情况,RT-PCR和Western blot法分别检测VEGF165 mRNA和蛋白表达情况. 结果 分离、培养、纯化的rHFSCs呈典型“铺路石”状,贴壁较牢,克隆形成能力强;纯化后细胞培养1～2 d处于生长潜伏期,5～6 d处于对数生长期;细胞免疫荧光染色可见毛囊干细胞标志物角蛋白15 (cytokeratin 15,CK15)、整合素α6和整合素β1表达呈阳性;RT-qPCR检测可见干细胞标志物CK15、CK19、整合素α1和整合素β1表达量高,而表皮干细胞标志物CD34和角质形成细胞标志物CK10表达量均较低.倒置荧光显微镜观察示,实验组慢病毒介导VEGF165基因转染14d后转染效率可达85.76％±1.91％; RT-PCR和Western blot检测示,实验组VEGF165 mRNA和蛋白表达均呈阳性,对照组均呈阴性. 结论 经显微镜联合组织块分离培养、Ⅳ型胶原差速贴壁筛选后,可得到高纯度rHFSCs,细胞增殖能力强.慢病毒介导的VEGF165基因修饰方法可成功转染并得到高表达VEGF165 mRNA和蛋白的rHFSCs,可为组织工程构建人工毛囊、血管及皮肤等提供良好的种子细胞.
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人VEGF165基因的克隆、表达和活性鉴定
目的克隆人VEGF165基因,构建其真核表达质粒,转染293细胞,并鉴定表达VEGF的生物学活性.方法采用PCR法从人心脏cDNA文库钓取人VEGF165基因,插入pUC19载体测序后与真核表达质粒pAdTrackCMV连接,阳离子脂质体Lipofectamin介导VEGF基因转染293细胞,Northern blot和Western blot法分别检测VEGFmRNA和蛋白的表达,Miles试验进行活性鉴定.结果(1)琼脂糖凝胶电泳分析得到两个片段,分别为582bp的VEGF165cDNA和2.68kb的pUC19线性质粒,结果与理论值相符,VEGF165测序结果与GENE BANK中VEGF165序列完全一致.(2)转染293细胞后表达绿色荧光蛋白,转染后第3天(1 024pg/ml)和5天(986pg/ml)VEGF表达高,明显高于转染前(102pg/ml).(3)Miles试验结果显示,用转染AdTrackCMV-VEGF165细胞培养上清皮下注射后10分钟左右皮丘变为蓝色,成倍连续稀释后,出现蓝斑的时间延长,蓝斑范围也相应缩小.而注射未转染293细胞培养上清和生理盐水组则未见蓝斑出现.结论成功克隆人VEGF165基因,并表达出具有生物学活性的VEGF蛋白.
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Semaphorin3B在肿瘤中的研究进展
SEMA3B是近年发现的一种抑癌基因.早期研究中人类SEMA3B蛋白多的是其在神经系统中表达,在神经系统的发育及轴突引导作用中特征性变化而被发现.近期研究认为SEMA3B涉及多种生物学途径,与NRP1和NRP2受体结合使VEGF作用下调,从而抑制肿瘤的血管形成;还可通过介导p53或上调IGFBP-6而抑制抗细胞凋亡通路.目前,SEMA3B基因在肿瘤发生发展中的作用机制研究尚不明确,需要进一步深入研究.
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VEGF165 RNA干涉诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究
目的:利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞VEGF165基因表达,探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用.方法:设计针对VEGF165基因的小干扰RNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA(small interfering RNA),采用lipofectamine2000转染人宫颈癌HeLa细胞.通过Hoechst33258染色、流式细胞术、RT-PCR检测人宫颈癌HeLa细胞体外凋亡情况.在体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将VEGF siRNA直接注入瘤体,观察siRNA对肿瘤生长的影响,蛋白印迹试验检测VEGF siRNA在体内条件下对VEGF、bcl-2蛋白表达的影响.结果:所设计的两个siRNA均能有效诱导细胞凋亡产生凋亡小体,并使细胞周期阻滞于G0/G1期;VEGF165和bcl-2在mRNA及蛋白水平的表达也受到有效抑制,明显减少.结论:针对人VEGF165基因体外转录合成的siRNA在体内外均可诱导HeLa细胞发生凋亡.
