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利用同种异体脱细胞基质构建人工真皮的研究
目的在同种异体脱细胞基质中植入幼儿包皮成纤维细胞,构建人工真皮替代物,以研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用,为研制大面积创面覆盖物--复合皮奠定基础.方法(1)酶消化法培养幼儿成纤维细胞;(2)制备尸体皮脱细胞基质,接种成纤维细胞后于不同时间观察细胞的形态变化;(3)细胞计数;(4)H.E染色;(5)扫描电镜观测脱细胞基质的表面是否有成纤维细胞附着;(6)三联染色观察人工真皮中胶原纤维、弹力纤维及网状纤维的分布.结果(1)利用脱细胞基质构建的人工真皮形成后质地与颜色近似真皮组织,有一定的弹性,可出现较明显的细胞增殖,未见人工真皮收缩现象.(2)细胞计数法所得生长曲线表明植入尸体皮脱细胞基质中的细胞具有典型的细胞增殖现象.(3)H.E染色可见成纤维细胞主要分布于脱细胞基质表面.(4)扫描电镜下可见脱细胞基质表面有梭形的成纤维细胞出现,且成纤维细胞紧密贴附于脱细胞基质上.(5)三联染色显示人工真皮中存在胶原纤维及成纤维细胞新合成的弹力纤维.结论成纤维细胞在脱细胞基质中有着活跃的生物学特性,以脱细胞基质为支架构建的人工真皮具有同正常真皮相似的结构与功能.
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皮肤组织工程-细胞支架的构筑及其生物相容性评价
皮肤组织工程的发展提供了一种无损伤修复创伤和功能重建的皮肤治疗模式.作为组织工程的三要素之一,细胞支架发挥着重要的作用.为满足组织工程中对细胞支架在力学性能、物理结构及生物相容性等方面的要求,我们首先制备了聚乳酸(PDLLA)、聚乳酸-己内酯(PLACL)多孔支架,并以生物相容性较好的猪的无细胞真皮(acellular dermis matrix,ADM)为参比,分别把三种材料植入大鼠背部肌层,术后定期取大鼠皮下埋藏组织进行组织学检测.结果发现PDLLA与PLACL多孔支架的降解周期、力学性能、孔隙率及其孔径都可以根据皮肤组织工程中的要求进行调控.组织学检查,移植物内无明显炎性细胞,21天后,均完全血管化且分布较均匀.说明PDLLA与PLACL的生物相容性较ADM差,但并未出现明显的异物排斥反应,两者的生物相容性基本上可以满足组织工程中对支架的要求,这为聚乳酸类人工皮肤的进一步研究提供了有意义的实验依据.
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创伤后皮肤缺损覆盖物研究进展(文献综述)
本文主要就异种移植物、人工合成膜和组织工程皮肤替代物进行了综述,其中应用组织工程技术构建的第三代产品--复合皮肤替代物,具有表皮和真皮的双层结构,在结构上同天然皮肤极为近似,初步临床应用显示了极好的生物特性.
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活性皮肤替代物的研究与应用
1987年,美国国家科学基金会提出了组织工程的概念,目前组织工程已成为一个新兴的前沿学科,并取得了一些振奋人心的成果,皮肤组织工程在其中居领先地位,一些活性皮肤替代物已经应用于临床,成为组织工程化组织器官移植的成功范例.实际上在组织工程的概念提出之前,人们早已在研究具有细胞活性的皮肤替代物.20世纪60年代,随着细胞培养技术的突破,Kheinwold Green等首先培养出表皮细胞膜片.后经许多研究者的改良,研究出了适于移植的表皮细胞膜片,使体外培养活组织移植的梦想变成现实.在随后的几十年里,不断有新的活性皮肤替代物问世,直至近年来出现了商品化的、器官型的皮肤替代物Apligraft(商品名).天然的、人工合成的各种真皮基质很多,也有商品化的产品如Alloderm(商品名).然而由于缺乏活细胞成分,以及结构和成分上的不完整性,终不能成为理想的皮肤替代物.构建尽可能接近正常皮肤结构、功能和形态的活性皮肤替代物,仍是未来的研究方向.
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组织工程化皮肤研究新进展
组织工程化皮肤是指运用工程及生命科学的原理和方法构建出的用于修复、维持和改善损伤皮肤组织功能的替代物；其核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。理论上，组织工程化皮肤应具有如下功能：①作为损伤皮肤的替代物；②作为基质植入宿主体内并生长；③或作为含药理成分的化学刺激物，促进创面愈合［1］。但现阶段，还不能作为永久性的皮肤替代物。本文对以胶原为细胞外基质材料所形成的组织工程化皮肤的研究进展作一简要综述。 一、胶原作为细胞外基质材料及特点 胶原蛋白是真皮结缔组织的主要成分，占皮肤干重的70 %，具有天然的抗拉性、抗张力性、低抗原性、良好的生物相容性及完全的生物可降解性，还在细胞（尤其是成纤维细胞）表面黏附、趋化、生长、分化及介导免疫反应等方面起重要作用，是良好的皮肤组织工程的支架材料［2,3］。胶原类材料包括动物胶原和同种胶原。前者主要来自牛真皮、牛的跟腱、牛眼水晶体、大鼠尾腱、豚鼠真皮等；后者由尸体真皮提供胶原材料。现已知胶原作为细胞外支架材料特点如下：①黏附性好，利于细胞的生长和基质的沉积，血管再生及上皮细胞附着；②胶原取材于动物或人尸体皮，作为异物，仍存在排斥反应，导致严重的后果；③胶原类材料降解情况受局部因素影响很大，降解速度可控制性不如人工聚合物。胶原主要是被组织中的酶类降解，胶原酶为机体的主要溶解酶类，创面愈合过程中，胶原酶活性往往增加；④胶原材料具有适宜的孔径，保持了天然的渗透性，适合营养物质、生物因子等的扩散和血管长入；⑤具有创面止血和缓解疼痛的作用；⑥存在微生物如HIV病毒等的污染危险性。
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角质细胞与成纤维细胞混合移植修复裸鼠全层皮肤缺损的初步报告
目的利用组织工程原理探讨修复全层皮肤缺损的理想方法.方法以裸鼠为动物模型,在皮肤全层缺损区域分别移植纤维蛋白胶(n=10),纤维蛋白胶角质细胞悬液(n=10),纤维蛋白胶成纤维细胞悬液(n=10)以及纤维蛋白胶角质细胞成纤维细胞悬液(n=10),术后每天对伤口进行大体观察,第5,7,10,14,21,35d,分别取材活检行组织学及免疫组织化学检查.结果移植有角质细胞组(2和4组)的创面愈合快,术后10d组织学提示创面完全上皮化,抗人特异性HLA-1型抗原、抗involucrin染色和抗Ⅶ型胶原染色阳性证明新生上皮由移植的人角质细胞形成,抗involucrin染色阳性又证明角质细胞分化成熟有角质层形成,抗Laminin染色、抗Ⅶ型胶原染色阳性提示早期基底膜形成.组织学检查提示第4组新生上皮有许多类似皮钉样结构.结论培养的角质细胞,成纤维细胞结合纤维蛋白胶移植到创面上后,可以形成复层分化良好、接近正常结构和功能的新生皮肤组织.
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海绵状胶原膜作为真皮支架构建复合皮的研究
探讨以海绵状胶原膜作为真皮支架体外构建复合皮的可能性.由新鲜猪皮提取胶原后与硫酸软骨素混合,经真空干燥制成具有立体网状结构的膜片;取正常人包皮环切后的废弃皮肤组织,常规方法分离表皮细胞制成单细胞悬液,滴加于海绵状胶原膜上进行体外培养,观察表皮细胞的生长、增殖情况.结果显示,人表皮细胞种植于海绵状胶原膜上可生长、增殖,融合成片.提示此种海绵状胶原膜对人表皮细胞无明显毒性作用,可作为组织工程构建复合皮的真皮支架.
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血管内皮细胞生长因子基因转染皮肤成纤维细胞的实验研究
为改善人工复合皮在临床上的应用效果,构建人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因重组载体pcDNA3,并转染成纤维细胞.检测转基因细胞培养上清液VEGF浓度;用转基因细胞培养上清液刺激人脐静脉血管内皮细胞,观察内皮细胞增殖速度;通过Miles实验检测VEGF的生物学活性.结果显示,转基因成纤维细胞能够表达一定浓度的VEGF,且具有加速体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)生长和增强血管通透性的生物学活性.提示转hVEGF165基因成纤维细胞可修饰人工皮的真皮面.
关键词： 血管内皮细胞生长因子 转染 成纤维细胞 皮肤组织工程 -
永久性皮肤替代物研究进展和现状
我国对永久性皮肤替代物的研究开始得比西方发达国家晚,但近年来的发展势头较好.这项研究工作的开展和普及,将彻底改变烧伤创面修复对自体皮源的高度依赖,提高严重创伤和大面积烧伤救治成功率,并改善创面修复质量,具有广阔的临床使用价值和应用前景.本文介绍了国内外对永久性皮肤替代物研究的进展和现状.
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人工表皮构建及其结构的研究
目的:以角朊细胞作为种子细胞,构建人工表皮,检测培养的人工表皮的结构,为进一步进行动物移植试验奠定基础.方法:(1)采用分散酶(dispase)分离表皮细胞,以无血清培养法培养表皮细胞.(2)人工表皮构建成功后,分别进行HE染色及透射电镜观察.(3)角蛋白免疫组织化学染色.结果:经过2～3周的培养,表皮细胞连接成片,呈现典型的"铺路石"状;继续培养5～7d后,将细胞膜消化下来,HE染色显示由2～4层细胞组成,电镜可以观察到桥粒及张力微丝束的结构;免疫组织化学染色显示培养细胞和细胞膜角蛋白染色阳性.结论:该人工构建表皮与人正常表皮结构类似,可作为移植物进行深入研究.
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毛囊生物学及其在皮肤组织工程中的应用
本文讨论了毛囊的胚胎发生和周期性生长特性,重点阐述了毛乳头细胞在毛囊生长过程中的重要作用,毛囊干细胞的特性及定位,以及毛囊生长发育的几种不同机制.通过回顾国外在毛囊生物学研究方面所取得的不同成就及其研究技术手段,探索构建人工复合皮上毛囊的方法和途径.
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表皮细胞培养佳条件的探索
*目的:确定表皮细胞培养的佳条件,为进一步将其作为皮肤组织工程种子细胞奠定基础.方法:以DMEM作为基础培养液,改变培养条件后 ,计数2周内克隆形成数,检测细胞增殖能力,确定佳条件.结果:表皮细胞以分离酶分离可得到大多数基底细胞,在培养液pH值为7.0～7.2,钙离子浓度为0.4 mmol/L,血清浓度为18%, 温度为36℃, CO2浓度为6%时,表皮细胞克隆形成数高. 结论:在佳培养条件下,表皮细胞生长状态良好,为人工表皮的构建奠定了基础.
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丝素蛋白生物支架在皮肤组织工程中的研究进展
丝素蛋白具有良好的生物相容性和独特的力学性能,已广泛应用于生物医学领域.丝素蛋白经加工处理可制备成丝素蛋白膜、丝素蛋白水凝胶、丝素蛋白多孔三维支架、丝素蛋白纳米纤维等多种形态.当皮肤受到严重损伤时,临床通常采用皮肤移植的方法对损伤进行修复,皮肤组织工程为皮肤移植提供了新方向.丝素蛋白生物支架能为创面皮肤的细胞增殖和迁移提供有序的三维空间结构,促进皮肤组织再生,有助于创面愈合.丝素蛋白生物支架有望有成为理想的皮肤三维仿生支架.
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含转表皮细胞生长因子基因人表皮细胞复合皮的构建与移植
目的 探讨转染表皮细胞生长因子(EGF)基因的人表皮细胞移植后EGF的表达及对细胞增殖的影响.方法 将Balb/c小鼠的表皮细胞和转染EGF基因的人表皮细胞按1:1、1:3、1:5的比例混合,种植于脱细胞真皮替代物表面,于体外培养后形成复合皮,将复合皮移植于Balb/c小鼠全层皮肤缺损创面,抗EGF抗体免疫组织化学染色观察移植后EGF的表达,抗增殖性细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色观察表皮细胞的增殖情况.结果 小鼠表皮细胞与转EGF基因的人表皮细胞按1:5混合构建的复合皮移植后1～2周,抗EGF染色阳性,1周时,新生表皮基底层中PCNA阳性细胞比含单纯小鼠表皮细胞的复合皮移植后显著增多(P＜0.01).结论 转染EGF基因的人表皮细胞在移植后早期可表达外源基因产物,并促进表皮细胞增殖.
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毛囊干细胞在组织再生及皮肤组织工程中的研究进展
毛囊干细胞属于毛囊表皮干细胞系，与表皮干细胞同属上皮来源的成体干细胞。由于其具有来源广泛、取材容易、不涉及伦理及道德问题等优势而逐渐成为干细胞治疗领域的新宠。现就其在组织再生及皮肤组织工程中的研究进展综述如下。一、毛囊干细胞的特性毛囊干细胞主要存在于毛囊隆突区及毛囊的下1/3[1]。
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皮肤替代物的研究现状与进展
近年来随着皮肤替代物的研究工作的深入开展和普及,将彻底改变烧伤创面修复对自体皮源的高度依赖,提高严重创伤和大面积烧伤救治成功率,并改善创面修复质量.皮肤替代物具有广阔的临床使用价值和应用前景.本文介绍了永久性皮肤替代物研究的现状和进展.
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毛囊隆突区β神经生长因子水平对乳鼠烫伤创面愈合的影响
背景:毛囊干细胞在受到外界环境刺激作用下,例如创伤,化学伤等,其珲化性质及细胞状态会有所变化.但是从目前文献来看,涉及其在皮肤烫伤中变化的研究的比较少.目的:初步观察大鼠烫伤模型中,毛囊隆突区β神经生长因了的表达变化以及对烫伤组织愈合的影响.方法:随机选取30只乳鼠,采用90℃水温持续3 s时间的方式制作大鼠触须部表皮组织浅Ⅱ度烫伤模型,造模后第12,24,36,48,60小时对毛囊隆突区进行分离,并进行匀浆,以同窝新生6只乳鼠正常唇部组织作为对照.采用Brandford法进行总蛋白检测及ELISA定量检测β神经生长因子.免疫组织化学进行神经生长因子的定性半定量检测.结果与结论:在烫伤后各时间点检测的β神经生长因子与总蛋白比值中,β神经生长因子的表达在烫伤后36 h开始后增高,60 h达到峰值.组织切片中同样发现这一规律.通过图像软件分析表明,提取β神经生长因子蛋白检测与组织水平β神经生长因子表达一致.提示烫伤后12～60 h时间段内,烫伤后60 h隆突区表达的β神经生长因子达到峰值,对烫伤愈合的修复作用也达到峰值.隆突区是毛囊干细胞的巢,此部位β神经生长因子表达增强可能对毛囊干细胞的分化和组织修复具有一定的积极意义.
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皮肤扩张器的改造及其在构建自体复合皮中的应用
背景:置入正常皮肤软组织下的皮肤软组织扩张器,通过定期向扩张囊内注入生理盐水使其不断扩张,可获得"额外"皮肤软组织.目的:对传统皮肤扩张器进行改造并应用于构建自体复合皮.方法:将传统单注射壶皮肤扩张器改造成双注射壶,原有的注射壶通向扩张囊内,添置的注射壶通向囊外,扩张囊容量10 mL.将改造后的扩张器埋植于10只新西兰大耳白兔背部皮下,扩张器埋置2周后,经注射壶注入原代培养的自体表皮细胞悬液,即种植于扩张囊和纤维包囊的腔隙内.结果与结论:新西兰大耳白兔完全存活,扩张器未出现破损渗漏,伤口均愈合,无排异反应.注入表皮细胞种植1周后,纤维包囊表面可见较多的上皮细胞岛,但未形成完整的细胞层;2周后的纤维包囊表面可见完整的类似于假复层鳞状上皮的细胞层,两者结合紧密.提示经改造的新型皮肤扩张器用于体内构建自体复合皮是可行的,发挥着关键性的作用.
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表皮干细胞与毛囊干细胞生物学特性的比较
背景:获取更合适的组织工程皮肤种子细胞可使皮肤功能得到更好的修复.目的:分离、培养表皮干细胞和毛囊干细胞,并比较两种细胞的生物学特性.方法:体外分离培养2月龄新西兰兔表皮干细胞和毛囊干细胞,取生长良好的第2,3,6代细胞观察其生物学特性.结果与结论:毛囊干细胞较表皮干细胞贴壁快,具有更高的增殖活性.免疫组化及荧光定量PCR检测显示毛囊干细胞β1整合素、角蛋白19蛋白及mRNA表达均明显高于表皮干细胞.提示作为皮肤组织工程的种子细胞,毛囊干细胞较表皮干细胞更具优势.
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神经生长因子对瘢痕成纤维细胞生物学特征的影响
背景:神经生长因子由多种细胞分泌合成,如炎性细胞、修复细胞等,其生物学作用呈多样性,与创伤修复过程密切相关,但其作用机制尚不明了.目的:观察神经生长因子对瘢痕成纤维细胞生物学特征的影响.方法:8份临床手术切除标本,其中5份为面颈部增生性瘢痕或瘢痕疙瘩标本,未接受过任何治疗;3份为包皮环切术切的包皮标本(正常组织).采用组织块法培养瘢痕及正常皮肤成纤维细胞,消化法传代.取3～6代对数生长期瘢痕组织及正常组织成纤维细胞,接种于96孔培养板中,设置实验组(瘢痕成纤维细胞组)和对照组(正常皮肤成纤维细胞组):每组设两个平行孔,分别加入3.33,0.33 mg/L神经生长因子各50 μL.采用倒置显微镜观察成纤维细胞形态.培养24.48,72 h后,MTT测定各孔的吸光度.流式细胞术分析成纤维细胞DNA含量及细胞凋亡情况.结果与结论:成纤维细胞为贴壁生长型细胞,瘢痕和正常皮肤组织块在接种后4～6 d可见细胞从组织块中游出,逐渐向周围扩展开.与正常皮肤成纤维细胞相比,病理性瘢痕成纤维细胞体积较大,形态和排列不规则.MTT结果显示,神经生长因子可促进正常及瘢痕成纤维细胞的增长,后者更为明显.流式细胞术测定结果显示,加入神经生长因子后,瘢痕成纤维细胞增殖期S-G_2-M细胞百分数高于对照组,且凋亡水平降低.提示神经生长因子对正常及瘢痕皮肤成纤维细胞的生长趋势与增殖活性有明显的促进作用,对瘢痕皮肤的作用更明显.
