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水痘-带状疱疹病毒糖蛋白I基因在昆虫细胞中的表达及纯化
目的将北京水痘-带状疱疹病毒(VZV)84-7株克隆糖蛋白I(gpI)基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中表达,并对其表达产物进行纯化.方法采用PCR方法从VZV DNA中扩增gpI全基因序列,并将其插入杆状病毒转移质粒pBacPAK9中,获得重组转移质粒pBacVZVgpI,对pBacVZVgpI中的插入基因进行测序.重组转移质粒与线性杆状病毒BacPAK6 DNA(Bsu36I digested)共转染Sf 9昆虫细胞,获得重组病毒BacPAK-gpI.通过亲和层析纯化重组蛋白,并检测其抗原性.结果 PCR扩增得到gpI基因,测序结果表明克隆的外源基因正确.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western-blot)方法证明gpI基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物在培养72 h达到高峰,重组蛋白的相对分子质量约为58 000和70 000,与理论值相符,蛋白质加工与天然蛋白类似.动物实验结果表明,重组蛋白具有较好的免疫原性,可刺激小鼠产生中和抗体.SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白,纯度达80%.纯化蛋白经western-blot和ELISA检测后显示,具有特异的抗体结合活性.结论应用昆虫细胞表达水痘-带状疱疹病毒gpI基因,可为水痘-带状疱疹病毒抗原定量分析、糖蛋白ELISA的研制和制备亚单位疫苗提供基础.
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中国六省份水痘-带状疱疹病毒糖蛋白M、L基因特征分析
目的 分析水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白(g)M、L的基因特征.方法 依据国家科技重大专项中发热伴出疹症候群病毒性病原监测项目,以2007—2015年北京(1例)、上海(5例)、吉林(2例)、青海(1例)、广东(2例)、四川(1例)监测到的12例VZV疑似患者为研究对象,收集其疱疹液或咽拭子标本共12份.通过琼脂糖凝胶电泳鉴定标本VZV阳性情况,采用PCR扩增VZV阳性标本以及国产水痘减毒活疫苗v-Oka-BK和进口水痘减毒活疫苗Varilrix-1的gM、gL基因序列片段,进行核苷酸序列测定和分析.采用BioEdit、MEGA 5.0软件,比对VZV阳性标本与疫苗株(v-Oka-BK、varilrix-1)以及GenBank的国外野毒株(41株)、亲本株(p-Oka)、疫苗株(v-Oka、varilrix、varivax)的核苷酸序列.结果12份标本均为VZV阳性.与疫苗株和亲本株相比,1份阳性标本gM基因在86686位点发生碱基突变,并导致氨基酸突变,5份阳性标本在87844位点发生碱基突变,有30株国外野毒株在87844位点上也存在相同变异;1份阳性标本gL基因在101245位点发生碱基突变,并导致氨基酸突变,6份阳性标本在101624、101625、101625位点上均发生了碱基缺失,国外野毒株在这3个位点均发生相同变异.与疫苗株相比,12份VZV阳性标本gM的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.2%~100%和98.2%~100%,gL的分别为99.3%~100%和98.6%~100%;与41株国外野毒株相比,gM的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.3%~100%和98.5%~100%,gL的分别为99.1%~100%和98.6%~100%.基因亲缘性关系树分析显示,基于gM有7份VZV阳性标本与疫苗株及亲本株在同一分支上;基于gL,有12份VZV阳性标本均与疫苗株及亲本株在同一分支.结论12份VZV阳性标本gM、gL基因序列高度保守,抗原性稳定,存在减毒位点可能.
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呼吸道合胞病毒分泌型融合蛋白的真核表达和纯化
目的 研究人呼吸道合胞病毒(human respiratory syneytial viruse,RSV)分泌型融合蛋白(secreted fusion protein,sF)基因在杆状病毒中的表达及纯化.方法 根据编码F蛋白的基因序列设计引物,以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区核酸序列替换为6×His核酸序列.获得COOH'端带有His标签的重组sF-His蛋白编码基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建可表达sF蛋白的重组杆状病毒,用脂质体Cellfectine reagent转染sf9细胞,实现sF在sf9细胞中的表达,Ni柱亲和层析纯化sF蛋白.结果 成功获得了sF-His编码基因,构建的重组杆状病毒可高效表达sF,Ni-柱纯化后sF的浓度为1.084 mg/ml,纯度达90%以上.结论 杆状病毒系统是制备8F的有效方法,纯化的sF蛋白为RSV新型疫苗及单克隆抗体和诊断试剂等研究奠定了基础.
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单纯疱疹病毒糖蛋白D与IL-2基因共表达质粒的构建及其免疫学鉴定
目的 构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D(gD)全长基因和人白细胞介素2(IL-2)共表达的重组真核表达质粒IRES-gD-IL-2,并诱导其在抗原提呈细胞--树突状细胞(DCs)的表达.方法 应用PCR方法分别扩增出HSV-1 gD和IL-2基因,经PCR、双酶切及测序证实正确后分别插入真核表达载体IRES的上、下游.通过脂质体介导转染DCs,并进行免疫学鉴定.结果 重组表达质粒IRES-gD-IL-2经PCR和酶切均出现相应长度的片段.经Western Blot证实,HSV-1 gD抗体可特异识别DCs内表达的gD蛋白.结论 构建了gD与IL-2共表达的重组真核表达质粒IRES-gD-IL-2,免疫印迹鉴定证实该表达产物具有免疫学活性.
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汉坦病毒病毒吸附蛋白表位的研究
目的研究并确定汉坦病毒(HTNV)病毒吸附蛋白(VAP)相关表位的序列特征.方法淘筛噬菌体肽库,将阳性克隆携带的外源肽与HTNV囊膜糖蛋白G2做同源性分析.应用IFA及ELISA法鉴定阳性噬菌体的特性.合成短肽,结合激光扫描共聚焦显微(LSCM)技术观察该短肽与宿主细胞膜的结合情况.结果保守性序列模式PX(1-2)HX(0-2)H与HTNV G2上96 YPWHTAKCHY105序列相似,合成的阳性短肽可以与病毒敏感细胞膜相结合.结论保守基因序列PX(1-2)HX(0-2)H及与之对应的HTNV G2上96 YPWHTAKCHY105序列在病毒与宿主细胞结合中可能起作用,且是VAP的相关表位.
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重组抗原在HSV-Ⅰ感染ELISA检测中的应用
目的用单纯疱疹病毒(HSV)重组蛋白作为包被抗原建立一种特异性和灵敏性较高的ELISA方法.方法将重组糖蛋白D(gD)和HSV-Ⅰ分别作为包被抗原,检测57份临床标本,同时用国产和德国试剂盒进行检测;将德国试剂盒作为金标准,另外三者检测结果在特异性、灵敏性和符合率等方面与其进行比较.结果与德国试剂盒相比,在特异度、敏感度、符合率方面,重组抗原分别为57.1%、82.0%、78.9%.病毒抗原分别为57.1%、78.0%、75.4%;国产试剂盒分别为100.0%、48.0%、54.4%.重组蛋白重复性实验结果经统计学处理差异无统计学意义(P＞0.05).结论用酵母菌表达的HSV-Ⅰ重组gD蛋白作为包被抗原进行ELISA检测是一种敏感、特异的方法,具有较大的应用价值.
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稳定表达狂犬病病毒CTN-1V株糖蛋白细胞系的建立
目的 构建能稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的CHO细胞系.方法 用RT-PCR法扩增和分离CTN-1V株狂犬病毒糖蛋白基因,测序后克隆入pCDNA5.0FRT载体,构建重组质粒pCDNA5.0FRT-G,之后与POG44质粒共转染CHO细胞,采用潮霉素B抗性筛选,挑选阳性克隆,间接免疫荧光和Western Blot进行稳定表达细胞系的鉴定.结果 经酶切和测序鉴定,获得重组表达质粒pCDNA5.0FRT-G,共转染CHO细胞后,获得肉眼可见阳性细胞克隆,刮取阳性克隆进行传代扩大培养并定义为第2代,经过10代后免疫荧光和Western Blot结果依然阳性.结论 成功建立稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的CHO细胞系,为深入研究糖蛋白的功能奠定基础.
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风疹病毒JR23株糖蛋白E1在毕赤酵母表达系统中的表达和抗原性分析
目的在毕赤酵母表达系统中表达风疹病毒(rubella virus, RV) JR23株包膜糖蛋白E1,为研究E1蛋白的结构功能、开发基因工程疫苗和重组蛋白诊断试剂盒奠定基础. 方法 E1基因的表达质粒pGAPZαA-E1经AvrⅡ线性化后用LiCl法转化酵母菌,在YPD(含100 μg/ml ZeocinTM)平板上两次筛选,挑出单菌落,于液体YPD中培养,并在不同时间收集培养物,用SDS-PAGE和Western blot进行分析. 结果 SDS-PAGE显示E1重组蛋白在毕赤酵母中高效稳定表达,在48 h时表达量达到高,之后趋于稳定,上清和细胞中均有蛋白表达.Western blot结果表明,上清中的E1重组蛋白能够分别与抗RV的阳性血清和单克隆抗体反应,而细胞中的E1重组蛋白只能与抗RV的阳性血清反应,不能与单克隆抗体反应.这说明所表达的蛋白一部分在信号肽的引导下分泌出胞,并经过折叠形成了正确的构像,能够与单克隆抗体结合;而另一部分由于蛋白本身的跨膜区连在了细胞膜上没有分泌出去,没有形成能够被单抗识别的构像,不能与单抗结合. 结论 E1包膜糖蛋白在酵母菌中成功表达,且免疫反应性良好.
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乌司他丁对重度烧伤患者中药溶痂后肝肾功能的保护作用
目的 探讨乌司他丁对重度烧伤后肝肾功能的保护作用.方法 118例重度烧伤患者随机分成对照组58例和治疗组60例.治疗组在烧伤后中药溶痂加用乌司他丁20万U+5％葡萄糖液250ml,静脉滴注,2次/d,连用7d.对照组仅做常规治疗,分别检测第1、3、5、7天患者肝肾功能指标,进行统计学处理.结果 重度烧伤后中药溶痂对患者肝肾功能有损害作用,治疗组肝肾功能指标明显好于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 乌司他丁对重度烧伤患者中药溶痂后肝肾功能有较好的保护作用,减少并发症,提高治愈率.
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多药耐药基因多态性和单倍体对环孢素A血药浓度的影响
目的探讨中国健康志愿者中多药耐药基因(MDR1) 12外显子C1236T、21外显子G2677T/A和26外显子C3435T多态性及3个位点单倍体连锁不均衡性对环孢素A(CsA)药代动力学特性的影响.方法高效液相色谱法(HPLC)测定20名健康男性单次口服CsA 500 mg后,24 h中不同时间点的血药浓度.采用聚合酶链反应(PCR)结合基因测序法测定3个位点的基因多态性和单倍体类型.结果 20名男性健康志愿者中,C1236T位点1名为CC型,8名为CT型,11名为TT型;G2677A/T位点4名为GG型,7名为GT型,4名为AT型,5名为TT型;C3435T位点5名为CC型,11名为CT型,4名为TT型;MDR1的C1236T和G2677A/T的基因多态性与峰浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC0-inf)差异均无统计学意义(均P>0.05),C3435T的基因多态性与Cmax无相关性(P>0.05),而与AUC0-inf相关(P<0.05).CC型、CT型和TT型的Cmax分别为2 124.7±179.4 ng/ml、1 934.2±372.8 ng/ml和1 765.2±415.6 ng/ml;AUC0-inf分别为13 922.4±2 881.5 ng/h-1·ml、11 511.8±2 192.1 ng/h-1·ml和8 514.9±1 063.4 ng/h-1·ml; 至少含有1个C等位基因的基因型(CC型和CT型),二者的AUC0-inf比TT型增高49%.单倍体分析表明,26与12和21外显子间存在单核苷酸多态性的连锁不均衡性,不同单倍体类型对CsA药动力学特性无影响(P>0.05).结论 MDR1 C3435T的多态性可能是口服CsA后,生物利用度变异大的影响因素.
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原发性开角型青光眼家系的MYOC基因突变研究
目的 对来自重庆地区的1个原发性开角型青光眼(POAG)家系进行MYOC基因突变筛查,研究POAG与MYOC基因突变的相关性,探讨MYOC基因突变在中国人POAG发病中的作用.方法 1个4代共39例的青光眼家系,8例为已确诊患者,健康对照者100名.用单链构象多态性分析(SSCP)、PCR.限制性片段长度多态性(RFLP)和基因测序的方法筛选MYOC基因的突变(包括G34C、C136T、G144T、G227A、C624G、G736A、C1009G、A1036G、C1081T、G1099A、G1138A、A1139C、T1430A、C1441A和C1442T等),同时对检测到的突变结果进行生物信息学分析.结果 在该家系中,发现1个G227A(Arg76Lys)突变,该突变存在2例已确诊的POAG患者和1例家系表型正常者中,健康对照者中未榆出.发现1个缺失突变(C1009del),该突变存在于家系中所有发病患者和1例4岁的子代亲属,健康对照者中未检出.未发现其他突变.由于C1009del突变是首次发现,据此我们申请了GenBank号,已发表的GenBank序列号为FJ237047,对应的蛋白序列号为ACI62293.结论 G227A(Arg76Lys)突变为已报道的多态性位点,与该家系青光眼的发病无相关性.移码突变C1009del突变与青光眼的发病密切相关,也可由此推测青光眼患者亲属的发病率较正常人高.
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CSF-1受体/c-fms与肝癌
肝癌的致癌机制是一个多步骤、多因素、多基因协同或单独作用不同阶段的复杂过程.正常情况下原癌基因参与细胞的生长、分化及信号传递调节,部分原癌基因的编码产物就是生长因子和(或)受体.原癌基因的突变或转录活化在不适当时期的表达或过量表达,在肝癌的发生机制中具有重要意义[1-15].集落刺激因子1受体(CSF-1R)是c-fms原癌基因的编码产物,具有酪氨酸激酶活性.CSF-1R在肝癌及癌旁肝组织中过量表达与肝癌的发生、发展、生长相关.CSF-1/CSF-1R可能是肝癌发生、发展中的一对自泌/邻泌系统.因此,阐明CSF-1R在肝癌发生、发展机制中的作用具有药物开发和临床诊治的意义.
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幽门螺杆菌粘附素研究进展
粘附定居是细菌感染不可缺少的致病过程.幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,简称Hp)要侵及胃粘膜需有Hp定植因子,包括动力、尿素酶活性和粘附素[1].研究表明,粘附素是Hp重要毒力因子之一[2-5],可与胃粘膜上皮上的特异受体结合,是其得以致病的先决条件.现对目前Hp粘附素的相关研究作一综述.
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肿瘤标志物对消化系统恶性肿瘤诊断价值的初探
目的初步探讨肿瘤标志物在消化系统恶性肿瘤诊断价值、放疗前后观察疗效监测复发、转移及其临床意义方法采用放射免疫法(RIA)和免疫放射法(IRMA)测定放射治疗前后消化系统恶性肿瘤患者63例和对照组30例的甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖蛋白(CA50,CA199)的含量.结果食管癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、贲门癌患者血清CA199放疗前与放疗后比较有显著差异(P＜0.01);结肠癌、直肠癌、胃癌患者CEA放疗前、后比较有显著差异(P＜0.01).结论这提示我们放疗前血清CA199,CA50含量增高,放疗观察CA199,CA50下降说明疗效好,放疗后不下降或升高提示放疗预后差.对CA199,CA50放疗前在正常范围内的消化系统肿瘤患者手术后及放疗后如出现CA199,CA50含量增高则提示肿瘤复发或恶化.动态观察CA199,CA50及AFP,CEA可作为消化系统恶性肿瘤早期诊断、观察疗效、监测复发或转移及判断预后的一项重要指标.
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GP-2在急性胰腺炎诊断中的临床价值
目的对血清GP-2(glycoprotein 2)浓度在急性胰腺炎中的诊断价值进行研究.方法通过临床症状、血清酶学、影像学和病理学诊断的48例急性胰腺炎患者分为重症急性胰腺炎(n ＝ 28)和轻症急性胰腺炎(n ＝ 20)两组,另选择20例非胰腺炎腹痛患者作为对照组,测定他们血清中的GP-2浓度,并和他们的血清酶学结果进行比较.结果 GP-2诊断急性胰腺炎的特异性为100%,高于淀粉酶(83.3%)和脂肪酶(89.6%);淀粉酶和脂肪酶水平分别在入院后的第3及第4天降至正常值上限的3倍以下,而在观察的第6天,GP-2水平仍然维持在诊断标准的5倍以上;同时在轻症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎患者,GP-2平均水平分别为4.71U和11.30U,后者明显高于前者(P＜ 0.05).结论 GP-2对急性胰腺炎的早期诊断特异性高,持续时间长,同时对病情的判断有一定的帮助,因此有相当的临床应用价值.
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血清AFP联合GP73在原发性肝癌的诊断中的意义
目的 探讨甲胎蛋白(AFP)和高尔基体糖蛋白-73(GP73)在原发性肝癌患者和健康者血清中的水平及其诊断价值.方法 回顾性分析原发性肝癌患者的类型及可能的危险因素,采用电化学发光法及酶联免疫法(ELISA)分别对37例肝癌患者和38例健康体验者进行血清AFP及GP73的含量检测,分析AFP、GP73及AFP + GP73在肝癌诊断中的敏感性和特异性.结果 37例原发性肝癌患者中,34例(91.89%)为肝细胞癌,28例(75.68%)有病毒性肝炎病史.肝癌患者血清中AFP和GP73的含量分别为(418.31 ± 189.93)ng/ml和(252.03 ± 238.34)ng/ml,显著高于对照组的(16.28 ± 9.39)ng/ml和(34.03 ± 22.67)ng/ml,均P ＜ 0.01.AFP和GP73联合检测肝癌的敏感性及特异性可达86.49%和84.20%,与单项检测相比,可明显提高诊断的准确性.结论 血清中AFP及GP73含量是原发性肝癌发生、发展的重要检测指标,二者联合检测对肝癌患者诊断具有重要意义.
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老年高血压伴下肢动脉硬化症患者血小板微粒膜蛋白的变化
目的探讨老年原发性高血压(EH)伴下肢动脉硬化症(LEASD)患者血小板微粒膜蛋白的变化.方法选择老年EH伴LEASD患者组(32例),老年EH患者组(30例)、健康老年组(30例),用流式细胞术检测上述3组的血小板微粒膜蛋白CD62p、活化的糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa的表达百分率.结果老年EH伴LEASD患者组血小板微粒膜蛋白CD62p、活化的GPⅡb/Ⅲa表达的百分率明显高于老年EH患者组及健康老年组(P＜0.01),而老年EH患者组明显高于健康老年组(P＜0.01).结论老年EH伴LEASD患者血小板微粒膜蛋白CD62p、活化的GPⅡb/Ⅲa指标显著升高,提示老年EH伴LEASD患者存在高凝状态,即血栓前状态.
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缬沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肥大心肌细胞糖蛋白130表达的影响
目的 在原代培养的新生大鼠心肌细胞上观察缬沙坦对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的肥大心肌细胞糖蛋白130(glucoprotein130,gp130)表达的影响.方法 AngⅡ刺激新生大鼠的原代培养心肌细胞,建立体外心肌肥大模型,并用不同浓度的缬沙坦作用于肥大心肌细胞,分为对照组,AngⅡ组,缬沙坦1组,缬沙坦2组,缬沙坦3组.采用相差显微镜测量细胞大小,3H-亮氨酸的掺入作为测定心肌细胞肥大的指标;采用RT-PCR及Western blot检测肥大心肌细胞gp130 mRNA及蛋白水平的变化.结果与对照组比较,AngⅡ组、缬沙坦1组、缬沙坦2组心肌细胞直径明显增大,3H-亮氨酸掺入明显增加,gp130 mRNA及蛋白表达明显增加(P<0 05);与AngⅡ组比较,缬沙坦1组、缬沙坦2组、缬沙坦3组心肌细胞直径明显减小,3H-亮氨酸掺入明显减少,肥大心肌细胞gp130 mRNA及蛋白的表达被抑制,且呈一定浓度依赖性(P<0.05).结论 缬沙坦浓度依赖性地抑制AngⅡ诱导的肥大心肌细胞gp130的表达,延缓了AngⅡ诱导的心肌肥大的发生、发展,从而对心肌细胞发挥保护作用.
关键词： 肌细胞 心脏 血管紧张素Ⅱ 糖蛋白类 细胞因子受体gp130 -
阿司匹林抵抗与其分子生物学机制
阿司匹林抵抗(aspirin resistance,AR)可分为临床AR和生化AR:临床AR指规律服用治疗剂量阿司匹林仍不能减少或避免血栓事件.因临床AR原因众多,目前倾向于用阿司匹林治疗失败代替临床AR.阿司匹林发挥药效是通过不可逆的抑制环氧合酶(cyclooxygenase,COX)而阻止血栓素A2产生.因此,可依据血栓素A2的代谢产物或依赖于血栓素的血小板聚集率判断阿司匹林是否起效,即生化AR,其包括2种概念:狭义的是指阿司匹林不能有效抑制血栓素A2的产生;广义的是指依赖于血栓素的血小板聚集不能被抑制.但生化AR诊断标准尚缺乏客观实用的指标.引起AR的可能机制研究众多,其中遗传因素占据重要成分.以下是近年有关AR分子生物学机制的新进展.
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血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体阻滞剂相关临床研究中的血小板减少症
血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体阻滞剂可阻断纤维蛋白原与血小板GPⅡb/Ⅲa受体的结合,有效地抑制血小板的聚集,在急性冠状动脉综合征的治疗中有着重要的作用.由于使用血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体阻剂后血小板的功能被抑制以及与此类药物常与其他抗凝剂/抗血小板药物合并使用,一旦发生严重的血小板减少症将是非常危险的甚至是致命的,其相关的血小板减少症已在多个临床试验中报道.
