乳球菌分泌的白介素-12对哮喘小鼠的疗效观察

目的 将小鼠白介素-12基因(mIL-12)通过质粒载体pSEC导入乳酸乳球菌(NZ9000)中,观察mIL-12在细菌中的表达;通过鼻腔免疫来观察mIL-12对小鼠哮喘模型气道炎症及辅助T细胞亚群的影响.方法 将mIL-12连接到pSEC载体上并将其转化到NZ9000中,用乳链菌肽(Nisin)诱导其表达IL-12蛋白质并做鉴定,将菌液离心浓缩后给小鼠滴鼻.BALB/c小鼠50只,随机分为5组,即对照组(A组); PBS组(B组);野生菌组(C组);rIL-12组(D组);工程菌组(E组).除A组外,余各组每鼠在1、7、14 d腹腔注射卵白蛋白OVA(100μg/0.5ml ),在20～26 d雾化吸入2% OVA,每天1次.B、C、E组在1、2、3、14、19、20、21 d分别给予10μl 的PBS,不含质粒载体的野生乳酸菌(约5×108CFU),含IL-12的质粒载体的工程菌(约5×108CFU).D组20、21、22天给3 ng/只重组白介素-12,第28天杀小鼠测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸粒细胞(EOS)个数及白介素-4(IL-4)、干扰素(IFN-γ)水平,肺组织HE染色切片观察病变.结果 mIL-12能够在NZ9000中高效表达并释放到细胞外.A-E组BALF中EOS 的数量分别为(0.51±0.23)×104cell/ml、(21.32±5.71)×104cell/ml、(22.84±6.16)×104cell/ml、(2.15±0.63)×104cell/ml、(2.62±0.73)×104cell/ml;IL-4的含量分别为68.43±9.08 pg/ml、332.13±61.36 pg/ml、324.65±57.27 pg/ml、121.25±35.55 pg/ml、 114.22±15.70 pg/ml;IFN-γ的含量分别为110.28±12.19 pg/ml、56.25±12.08 pg/ml、70.36±8.27 pg/ml、166.11±57.12 pg/ml、171.75±60.90 pg/ml.B和C组的EOS数、IL-4与IFN-γ含量与A组相比有统计学差异(P＜0.01);D、E组与B、C组比较有统计学意义(P＜0.01).工程菌组小鼠肺组织炎症细胞浸润明显减少,气道上皮损害减轻.结论 mIL-12在乳酸乳球菌中能高效表达;鼻腔应用mIL-12能减少全身应用的副作用,且经济实用并较好地调节Thl/Th2平衡,对小鼠哮喘气道炎症的保护较为理想.

质粒载体介导的短发夹RNA对RPE细胞转染效率及毒性研究

目的 连接针对人血管内皮生长因子(VEGF)设计的短发夹RNA与质粒载体,并转染视网膜色素上皮(RPE)细胞,观察其转染效率及对细胞的毒性.方法 设计针对人VEGF的短发夹RNA (shRNAs,V1,V2),V3为阴性对照即不含特异性shRNA,其表达载体为pGCSilencerTM /U6/Neo/GFP/VEGF RNAi.用LipofectamineTM 2000转染RPE细胞,用倒置荧光显微镜及流式细胞仪观察其转染效率;用MTT法观察其对细胞的毒性.结果 质粒载体介导的GFP在细胞中的表达呈黄绿色,弥漫于整个胞浆和胞核,转染后24h GFP开始表达,转染后48h表达明显增强.流式细胞仪检测质粒pGCSilencerTM /U6/Neo/GFP/VEGF RNAi对体外培养的RPE细胞转染效率为43.9％,质粒转染后MTT法测定细胞活性的OD值与对照组相比明显降低(P=O.004).结论 质粒pGCSilencerTM /U6/Neo/GFP/VEGF RNAi可以有效地转染体外培养的RPE细胞,但质粒转染对细胞有明显的毒性.

转化生长因子β 1基因克隆及重组真核表达质粒的构建

背景:通过基因转移方法研究某一外源性基因存细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段,与病毒载体相比,应用pcDNA4.0-TGF.B 1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性,有更高的安全性.目的:通过克隆转化生长因子γβ1基因,观察构建重组转化生长因子β1l基因真核表达质粒的可行性.设计、时间及地点:以细胞为观察对象的体外实验,于2007-03/2008-02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成.材料:2月龄清洁级健康SD大鼠,雌雄不拘,用于分离细胞中RNA.方法:从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子β 1的mRNA,反转录-聚合酶链反应扩增后,克隆入pGEM-T载体,PCR鉴定重组子;酶切下目的基因转化生长因子β1,再亚克隆入载体pcDNA4.0质粒,酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析.主要观察指标:TGF-β1cDNA、pGEM-T-TGF-β1和重组子pcDNA4.0-TGF-β1的表达.结果:经过反转录-聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带;PCR扩增鉴定得到pGEM-T-TGF-β1.酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4.0-TGF-β1,经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致.结论:成功克隆大鼠转化生长因子β1基因,并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体.

大鼠抗组胺药敏感性细胞色素P450基因的克隆及其反转录病毒载体的构建和鉴定

目的:构建反转录病毒表达载体pLXSN-HP450.方法:实验于2004-12/2006-05在广西医科大学生化药理实验室完成.提取正常的Wistar大鼠肝组织的总RNA,反转录-聚合酶链反应技术扩增出抗组胺药敏感性细胞色素P450(HP450)基因.并克隆到pMD18-T载体,经蓝白斑筛选后进行聚合酶链反应,酶切,测序鉴定.BamHI,EcoRI双酶切构建好的重组质粒和反转录病毒载体pLXSN在16℃下经T4连接酶连接过夜,并转化到感受态细胞DH5α,以菌液为模板做聚合酶链反应,结合酶切筛选及鉴定阳性重组反转录病毒载体pLXSN-HP450.结果:反转录-聚合酶链反应扩增出HP450基因.重组质粒pMD18-HP450经双酶切后得到1 461 bp的酶切产物.测序的结果用Clustal W在线与Genebank对比,此目的基因与基因库中的H1基因100%同源.阳性重组载体pLXSN用其菌液聚合酶链反应扩增出目的条带.对重组体pLXSN-HP450进行双酶切得到1 461 bp和5 900 bp两条特异性条带.结论:克隆了HP450基因,并成功构建了重组反转录病毒载体pLXSN-HP450,为进一步研究肝癌的基因治疗奠定了基础.

靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。
　　目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。
　　方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列，经退火成互补双链，与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定，应用蛋白质印迹和免疫荧光技术，在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。
　　结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明，重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实，实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体，此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。

RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景：端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)对端粒酶活化起重要作用，但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。
　　目的：构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体，并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。
　　方法：通过设计合成出shRNA-TERT序列，经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒，经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞，包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度，再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞，实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平，并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。
　　结果与结论：基因测序鉴定证明，pLentilox3.7U6-TERT 重组质粒构建成功，并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明，Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后，对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%，Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实，实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒，感染大鼠脊髓星形胶质细胞后，该载体可以有效抑制TERT的表达。

双歧杆菌质粒聚合酶基因对质粒载体稳定性的影响

目的 探讨双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)对人工构建的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭质粒载体(shuttle vector)在长双歧杆菌中稳定性的影响.方法 首先电转化质粒pBADs-A和pBADs-BPP至长双歧杆菌,培养鉴定后,接种含质粒pBADs-A和pBADs-BPP的双歧杆菌于AMP-和AMP+的MRS培养液中.厌氧培养后,将样品涂布于AMP+的MRS固体培养板上计数菌落数.结果 相同条件下质粒pBADs-BPP组菌落数高于质粒pBADs-A组(P<0.05).结论 BPP可以增加质粒载体的稳定性.

自我复制性核酸疫苗

迄今,核酸疫苗免疫诱导效力偏低,是限制其实际应用的原因之一.尽管目前发展了许多策略,在不同程度上提高了核酸疫苗的免疫效力,但仍然未达到可供实用化的理想效果.而且,质粒载体长期在宿主细胞中存留,存在着可能与宿主细胞染色体DNA随机整合和细胞转化的潜在危险[1].此外,外源基因在体内长期高水平表达,可能会刺激机体产生抗DNA抗体,导致自身免疫病或免疫耐受等问题[2].所以,提高核酸疫苗在机体内的表达水平,加强其免疫效力,同时又能保证核酸疫苗的安全性,已成为核酸疫苗研究中的关键问题.

FGF8一FGF家族的新成员

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor FGF)家族是能够紧密结合肝素,并在核酸序列上具有一定同源性的一组蛋白,在各种不同的生理、病理过程中起着重要的作用.包括:胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、血管发生、肿瘤生长和浸润等.FGF家族目前共有19个成员,其中FGF18是FGF家族新发现的的一个.1998年,Mickey等人先用全长的小鼠FGF--18作为探针筛选人心脏λTripEx cDNA文库,获得了几个阳性的克隆,这几个噬菌体克隆的cDNA的插入片段插入到pTripEx质粒载体中,然后进行序列测定和分析,结果发现一种新的FGF因子,遂命名为FGF18.人FGF-18cDNA序列的结果被收入在Genbank中,编号为AFO75292.人FGF-18 cDNA序列全长621个核苷酸,N端的前26个氨基酸为信号肽,有2个糖基化位点,有2个半胱氨酸(不包括信号肽部分),迄今为止还不知这2个半胱氨酸是否参与二硫键的形成.将人FGF-18氨基酸序列与人FGF-17、人FGF-8、小鼠FGF-18进行比较发现,人FGF18与小鼠FGF18的氨甘酸序列有99%相同;与人FGF-8有60%相同;与人FGF-17有58%相同;在某种程度上,人FGF18与其他FGF家庭的成员也有一定的同源性.

Livin shRNA质粒载体的构建及评价

目的:构建有效的Livin shRNA重组质粒.方法:设计、合成Livin shRNA,与pGenesil-1质粒载体链接构建重组质粒,通过酶切电泳、基因测序证实是否正确构建,通过转染高表达Livin的大肠癌HT-29细胞检测Livin mRNA下降水平,筛选出佳的shRNA.结果:重组质粒pGenesil-shRNA经酶切电泳、基因测序证明寡核苷酸片段成功插入预计位点,且序列与我们设计合成的完全一致;重组质粒载体转染HT-29细胞后,肿瘤细胞Livin mRNA含量较转染前及对照组均有明显的下降(p＜0.01),其中尤以Livin1抑制作用明显,抑制率达到66%.结论:我们正确构建了Livin ShRNA重组质粒,且制备的shRNA能有效抑制Livin基因的表达,为探讨针对Livin基因的RNAi对肿瘤的治疗奠实验基础.

短双链RNA在病毒性心肌炎小鼠模型中的抗病毒研究

目的:通过在小鼠病毒性心肌炎动物模型研究短双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对病毒感染和复制的抑制作用,研究RNAi在治疗病毒性疾病的可行性.方法:利用质粒载体将siRNA转染至HeLa细胞和Balb-c小鼠后感染病毒,荧光显微镜现察GFP表达量观察细胞内质粒转染效率和持续时间,通过病毒致细胞病变作用(CPE)保护实验病毒空斑形成实验检测病毒受抑制程度,动物模型中观察动物死亡率和易感组织病理变化评价siRNA的保护作用.结果:在HeLa细胞中针对CVB3 2B区的siRNA能显著抑制柯萨奇病毒B3的感染和复制,抑制率可达90%.动物模型中sigNA质粒可改善动物存活率(30%),并降低易感脏器中病毒含量,减轻病理反应.结论:针对CVB3基因组2B区的siRNA在病毒性心肌炎动物模型中具有保护作用.

人Enk基因逆转录病毒包装细胞系的建立

目前治疗慢性疼痛、癌痛的常用药物仍是阿片类药.由于其副作用及不良反应较多,限制了它在临床上的应用,因此国内外都在寻求新的有效镇痛方法.脑啡肽是一种内源性阿片肽,通过作用于δ和μ阿片受体而发挥镇痛效应[1,2].目前关于应用质粒载体及单纯疱疹病毒载体转脑啡肽基因镇痛的动物实验已广泛开展[3,4],但用逆病毒载体转导脑啡肽基因,国内外均未见报道.本研究构建了人脑啡肽基因逆转录病毒载体pLNCX2-Enk,并筛选出了高滴度缺陷性逆转录病毒的产毒细胞系,该产病毒细胞系产生的病毒,为疼痛基因治疗的实验研究奠定了基础.

以质粒为载体的基因治疗现状

近年来,质粒载体在基因治疗中的应用已引起人们的关注,并取得了很大进展.与病毒载体相比,质粒的优点为:制备简单,快捷,成本低廉,用于基因治疗较安全,并能与其它合成载体联合使用.本文就近年来质粒载体的发展,对质粒的设计,质粒导人机体的方法和途径、体内分布,和质粒抗癌药物的疗效进行了综述.

靶基因xylE质粒载体转基因小鼠的建立

体内电穿孔技术及其在DNA疫苗中的应用

DNA疫苗(又称"裸"DNA或核酸疫苗)是一种新型的、具有巨大发展潜力的亚单位疫苗,即为携带保护性抗原基因的质粒载体或重组病毒载体,接种后可在哺乳动物细胞内表达保护性抗原,以刺激机体产生保护性的体液免疫和细胞免疫.

APRIL siRNA表达载体构建、微流控芯片筛选及转染优化

目的:构建增殖诱导配体(APRIL)异构体特异性siRNA质粒载体,利用微流控芯片电泳筛选APRIL异构体特异性siRNA表达质粒.方法:以高表达APRIL的人结肠癌细胞株SW480为肿瘤细胞模型,选择APRIL异构体特异性siRNA序列,微流控芯片电泳筛选siRNA表达质粒并经测序后转染SW480细胞,半定量RT-pCR法检测瞬时转染前后SW480细胞中APRILmRNA水平.结果:成功构建hOligo637、hOligo1450、hOligo1534、hOligo1750.微流控芯片电泳成功分辨出被双酶切的插入片段.瞬时转染SW480细胞后均产生特异性的mRNA抑制效应.结论:采用微流控芯片电泳成功筛选出APRIL为靶点的siRNA质粒,并可广泛应用于筛选siRNA质粒.

HGF基因对大鼠血管内皮细胞增殖的作用

目的 构建肝细胞生长因子(HGF)真核细胞表达质粒pEGFP-HGF-C1,探讨HGF对大鼠血管内皮细胞(VECs)的作用.方法 通过亚克隆技术,构建含有人HGF cDNA全长的真核细胞表达质粒pEGFP-HGF-C1并测序；向大鼠原代骨骼肌细胞转染质粒pEGFP-HGF-C1,测定转染效率；ELISA法测定细胞上清液中HGF蛋白表达浓度；MTT法测定HGF表达产物对大鼠VECs促增殖作用.结果 成功构建正向表达HGF的真核细胞表达质粒pEGFP-HGF-C1,该质粒可有效转染原代培养的骨骼肌细胞并表达HGF,且其表达产物HGF对大鼠VECs的促增殖作用具有量效和时效关系(P＜0.05或P＜0.01).结论 成功构建的真核表达质粒pEGFP-HGF-C1能有效转染大鼠骨骼肌细胞,分泌的HGF对大鼠VECs有促增殖作用.

弓形虫RH株SAG2基因片段的克隆、表达、纯化与鉴定

克隆弓形虫RH株膜表面抗原2(SAG2)编码基因,构建原核重组表达质粒PET23a-SAG2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达及纯化SAG2蛋白.PCR扩增503bp的SAG2编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.限制性酶切分析及测序鉴定后以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD-18T-SAG2质粒与表达质粒载体Pet23a的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位点,构建重组体Pet23a-SAG2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.表达产物经金属鏊合层析纯化.用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达与纯化产物.PCR扩增出约503bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符;所构建的PET23a-SAG2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定,与预期结果一致.SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物约18kD.成功构建PET23a-SAG2表达质粒,诱导表达并纯化出了弓形虫RH株SAG2蛋白,并以免疫印迹鉴定.

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET 23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.成功构建了pET 23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.

间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在E.coli中的融合表达

在大肠杆菌(E.coli)中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST-PvMSP1 C.方法:以限制性内切酶BamH Ⅰ和Sa1Ⅰ双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段,柱纯化后,插入表达质粒载体的多克隆位点,构建重组体pGEX-4T-2/PvMSP1C,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导表达,表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析.双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得1119bp的PvMSP1 C编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建的pGEX-4T-2/PvMSP1 C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE电泳显示,GST-PvMSP1 C融合表达蛋白的大小约63ku,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别.成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C端编码基因pGEX-4T-2/PvMSP1 C表达质粒,诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白,表达蛋白具有一定免疫活性.