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小鼠端粒酶逆转录酶基因重组腺病毒转染对树突状细胞功能的影响
用携带目的基因的病毒载体转染树突状细胞(DC)已广泛应用于抗肿瘤和诱导耐受等方面的实验研究和治疗.但用病毒载体转染DC过程中,存在病毒本身常能影响DC的抗原提呈细胞功能,有文献报道痘苗病毒载体和单纯疱疹病毒载体转染DC后可阻碍DC成熟和下调成熟DC表面的共刺激分子,因此,避免病毒载体干扰DC的功能十分
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病毒载体介导的帕金森病基因治疗研究进展
帕金森病(PD)是一种常见的神经系统变性疾病,其病理改变主要为中脑黑质致密区多巴胺能神经元变性和消失,以及体内多巴胺水平的下降.80年代末,随着基因治疗概念的不断深入,基因治疗技术日趋成熟,人们开始了对PD基因治疗的尝试.近年来PD动物模型基因治疗已经取得了不少进展.在基因治疗的体外及体内两种途径中,研究多的是病毒载体相关的基因导入系统.目前研究较多病毒载体有:腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、其他逆转录病毒载体.
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人类免疫缺陷病毒重组载体疫苗的研究进展
重组载体疫苗是目前人类免疫缺陷病毒疫苗的研究热点,近几年来不仅在病毒载体和细菌载体选用的种类方面有了新的突破,而且对载体疫苗的组合免疫策略和佳免疫的选用方面已有全新的认识.本文就用于该病毒重组疫苗的病毒载体(包括痘病毒、α病毒、仙台病毒、甲型流感病毒、腺病毒、狂犬病病毒、疱疹性口炎病毒和单纯疱疹病毒载体)以及细菌载体(包括卡介苗、李斯特单胞菌、沙门菌和布氏杆菌载体)等的研究进展进行综述.
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人Enk基因逆转录病毒包装细胞系的建立
目前治疗慢性疼痛、癌痛的常用药物仍是阿片类药.由于其副作用及不良反应较多,限制了它在临床上的应用,因此国内外都在寻求新的有效镇痛方法.脑啡肽是一种内源性阿片肽,通过作用于δ和μ阿片受体而发挥镇痛效应[1,2].目前关于应用质粒载体及单纯疱疹病毒载体转脑啡肽基因镇痛的动物实验已广泛开展[3,4],但用逆病毒载体转导脑啡肽基因,国内外均未见报道.本研究构建了人脑啡肽基因逆转录病毒载体pLNCX2-Enk,并筛选出了高滴度缺陷性逆转录病毒的产毒细胞系,该产病毒细胞系产生的病毒,为疼痛基因治疗的实验研究奠定了基础.
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大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体的构建与鉴定
目的以真核表达载体单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)质粒型载体(pHSV)作为表达载体,构建大鼠MeCP2基因反义表达载体.方法用PCR方法扩增出大鼠MeCP2 cDNA部分片段,将其反向插入表达载体pHSV,并以PCR、酶切电泳以及DNA测序等方法对重组质粒进行鉴定.结果经过PCR、酶切电泳以及DNA测序,鉴定出连接方向和插入序列正确的反义表达载体.结论成功构建了大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体,为进一步研究该基因的功能打下了基础.
关键词: 甲基化CpG结合蛋白2 Rett综合征 反义RNA 单纯疱疹病毒载体 大鼠 -
两种单纯疱疹病毒载体在大鼠脑内所致炎性反应的比较
目的在比较质粒型HSV-1载体包装系统(pHSVlac/helper) 和无辅助病毒的载体包装系统(pHSVlac/helper virus-free)导致的特异性免疫应答的基础上,进一步选择LCA、Mac-1和GFAP等标记抗原,探讨载体引入后引起的非特异性炎性反应.方法采用免疫组化技术结合细胞计数,观察载体引入后引起的非特异性炎性反应以及星形胶质细胞的反应.结果免疫组化结果显示,LCA的反应高峰出现在基因转移后第4天,pHSVlac/helper引起的反应强度显然大于pHSVlac/helper virus-free组(P<0.001).与LCA不同, Mac-1对pHSVlac/helper virus-free的反应在第4天达到峰值,并高于pHSVlac/helper引起的反应.两种载体系统及PBS均使注射侧纹状体内GFAP阳性细胞增多、增大,突起变粗,反应增强,而非注射侧半球内GFAP阳性细胞数量少,突起细长.结论无辅助病毒载体包装系统仅引起较弱的炎性反应.
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两种单纯疱疹病毒载体在大鼠脑内所致免疫应答的比较
目的比较使用pHSVlac/helper 或pHSVlac/helper virus-free两种载体包装系统进行基因转移时所引起的免疫应答.方法分别将两种载体定位注射到大鼠纹状体内,采用免疫组化方法检测并计数包括TCR、CD4、CD8、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ在内的几种免疫反应阳性细胞.结果两种载体包装系统引起的TCR、CD4和CD8免疫反应阳性细胞浸润高峰出现在基因转移后的第7天,MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ反应高峰在第4天.它们对pHSVlac/helper的反应明显大于对pHSVlac/helper virus-free的反应(P<0.001),前者是后者的3~12倍,并且,pHSVlac/helper virus-free所致的细胞浸润迅速消退接近PBS对照组水平.结论无辅助病毒载体包装系统仅引起较弱的免疫应答.
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GDNF及dvHSV-GDNF对坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的影响
为了探讨胶质细胞源性神经营养因子及单纯疱疹病毒载体介导的胶质细胞源性神经营养因子(dvHSV-GDNF)对坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的作用,本实验对成年大鼠造成双侧坐骨神经损伤后,于右侧损伤处分别施加胶质细胞源性神经营养因子和dvHSV-GDNF;左侧损伤处施加生理盐水作为对照.分别取损伤后4、7、14和28 d大鼠的脊髓L4~L6节段,经石蜡包埋切片后行Nissl染色,计数前角运动神经元数量并进行统计学分析. 结果发现:坐骨神经损伤后4、7、14和28 d,右侧脊髓前角运动神经元的数量明显高于左侧.提示:胶质细胞源性神经营养因子和dvHSV-GDNF可减少坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的死亡.
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质粒型单纯疱疹病毒载体介导GDNF和GFP基因在体外培养的BHK细胞和大鼠脊髓、背根节神经元中的转移和表达
为了观察质粒型单纯疱疹病毒载体介导的外源性胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因在体外培养的金黄地鼠肾细胞以及脊髓神经元和背根节神经元中的转移和表达,本研究采用了以质粒型单纯疱疹病毒载体为基础构建的分别含有重组胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因的混合毒株dvHSV-GDNF和dvHSV-GFP感染体外培养的金黄地鼠肾细胞、脊髓神经元和背根节神经元.用免疫组织化学方法和荧光显微镜观测法分别检测了胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因的转移和表达.结果发现:质粒型单纯疱疹病毒载体可以成功地将外源性胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因导入金黄地鼠的肾细胞以及脊髓神经元和背根节神经元中.提示质粒型单纯疱疹病毒载体可以作为转基因胶质细胞源性营养因子治疗脊髓损伤的转移载体,为脊髓损伤的基因治疗提供了实验基础.绿色荧光蛋白作为报告基因,也可因其适用广泛、观察简便等特性而得到更加广泛的应用.
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质粒型HSV载体介导的GDNF和GFP基因在BHK细胞和骨骼肌细胞中的转移和表达
为了进一步探索治疗中枢神经损伤的新途径,本实验以质粒型单纯疱疹病毒(HSV)为载体,分别构建了含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组载体HSV-GDNF和HSV-GFP,用包装出的混合毒株分别感染体外培养的BHK细胞及原代培养的大鼠骨骼肌细胞.2 d后,对感染HSV-GDNF组的细胞进行GDNF免疫组织化学反应;感染HSV-GFP组的细胞在荧光显微镜下进行观察.结果发现:质粒型HSV载体可成功地将外源性GDNF和GFP基因导入BHK细胞和原代培养的大鼠骨骼肌细胞.提示:质粒型HSV载体可以作为转基因GDNF治疗中枢神经系统损伤的转移载体,为中枢神经系统损伤的治疗展示了广阔的前景.GFP作为报告基因,也可因其适用广谱、观察简便等特性而得到更加广泛的应用.
关键词: 胶质细胞源性神经营养因子 绿色荧光蛋白 单纯疱疹病毒载体 中枢神经系统 大鼠 -
Ⅰ型单纯疱疹病毒载体在中枢神经系统基因治疗中的应用
Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)是一种基因组为152 kb的双链线状DNA病毒,由共价连接的长片断(L)和短片断(S)组成.HSV-1具有天然嗜神经性,可感染非分裂细胞,同时能进入感觉神经元突触末端并逆轴突到达胞体,然后在神经元中建立长期稳定静止的潜伏状态.由于其在已知的84 kb基因中约一半为非必需基因,适合大片断外源基因的插入,同时因为熟悉该病毒的生活周期,构建载体相对容易.HSV-1是唯一能在神经元内保持潜伏状态而不被激活的病毒载体,仅以病毒相关启动子1(LAPI)进行转录,因此HSV-1是第一个显示其大量克隆能力,并可获得目的基因的长期表达的载体,其嗜神经性对于开展神经系统基因治疗具有十分诱人的前景.
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单纯疱疹病毒载体转基因治疗神经疾病的潜力
基因治疗人类神经系统疾病是近才提出来的并且已取得成功[1,2].目前,国外已建立了许多病毒载体,如单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒、反转病毒、腺病毒相关病毒等载体,但主要是用于体外试验和动物.现已成功地把外源基因插入到上述病毒载体.而这种外源基因可以激活神经系统的一些特殊区域.从病毒在神经元细胞建立潜在感染的能力来看,HSV特别适合于神经元产生基因.病毒载体用于治疗某些疾病,如恶性脑胶质瘤、帕金森氏病及已知的单基因疾病和脑缺血等具有很大的潜力.本文着重综述病毒载体的以下几个方面.