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人Bcl-2基因短发夹样RNA真核表达载体的构建和鉴定
目的 构建人Bcl-2基因序列特异性的短发夹样RNA(Short Hairpin RNA,shRNA)质粒载体.方法 根据Bcl～2基因序列及shRNA设计原则,化学合成4段编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGPH1/GFP/Neo中H1启动子的下游,重组构建RNAi质粒,同时设立阴性对照,并对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.结果 限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGPH1/GFP/Neo质粒中,测序结果证实插入片断与设计序列完全一致.结论 针对人Bcl-2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究Bcl-2功能奠定了良好的基础.
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靶向XT-1基因shRNA真核表达质粒载体的构建及筛选
目的 构建靶向木糖转移酶-1(XT-1)的短发卡状小干扰 RNA(shRNA)质粒表达载体;为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具.方法 设计4个小分子短发卡状RNA(siRNA)序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNAR 的表达载体,进行酶切和测序,再转染体外培养的星形胶质细胞,筛选靶序列.结果 构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,G418可以筛选出阳性克隆.结论 成功构建了编码 XT-1-shRNA的质粒表达载体;该载体为寻找脊髓损伤治疗的新靶点奠定了基础.
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靶向多药耐药基因mdr1 RNA干扰载体的构建及鉴定
目的 构建靶向人多药耐药基因mdr1的microRNA(miRNA)干扰表达载体并进行鉴定. 方法 设计并合成4对编码mdr1 pre-miRNA的单链寡核苷酸,退火成双链后将其连接入miRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,构建成重组质粒,酶切并测序鉴定其正确性. 结果 获得的重组质粒经酶切测序证实其插入片段大小与预期相符,序列完全正确. 结论 成功构建了4个靶向mdr1的miRNA干扰载体.
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靶向表皮生长因子受体shRNA质粒表达载体的构建和鉴定
目的 构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体并进行鉴定.方法 设计两个小分子干扰RNA(siRNA)序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNA的表达载体,进行酶切鉴定和测序,再转染人大肠癌LoVo细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果 构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示为绿色,G418可以筛选出阳性克隆.结论 成功构建了编码EGFR-shRNA的质粒表达载体,并可以进行稳定筛选.
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血管内皮生长因子-C短发夹RNA对肝癌细胞的抑制作用
我们通过构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)-C的短发夹RNA(shRNA)质粒载体,观察其对肝癌细胞增殖及侵袭转移能力的抑制效应,探讨靶向VEGF-C的RNA干扰(RNAi)应用于肝癌基因治疗的可行性[1].
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甲胎蛋白增强子调控的小干扰RNA质粒载体的构建
目的 构建AFP增强子调控的小干扰RNA质粒载体.方法 从HePG2细胞中提取AFP基因.采用定向克隆的方法,构建质粒pGenesil-AFP.pGenesil-AFP质粒DNA扩增、提取后转化到DH5感受态细胞.针对目的 基因Survivin的序列,构建pGenesil-AFP-shRNA.结果 pGen-esil-AFP-shRNA质粒经XbaI和Hind Ⅲ双酶切鉴定,获得一856 bp大小和4506 bp大小的片段,通过基因测序分析,证明质粒载体构建正确,用紫外分光光度计测得质粒的浓度为1.3 g/L,A值为1.94,说明制备的质粒纯度较高.结论 成功构建AFP增强子调控的Survivin shRNA融合质粒.
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湖北株HPV16E7基因疫苗的构建及免疫性研究
用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PWR590-1,所得湖北株HPV16E7片段克隆入真核表达载体pcd3.1-,构建了湖北株HPV16E7基因疫苗,皮下注射BALB/c近交系小鼠,体外应用酶联免疫吸附实验(Elisa)法和MTT法分别检测了湖北株HPV16E7基因疫苗在体内产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力.
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pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒的构建及其在体外人脐静脉内皮细胞中抑制Ang2.Tie2基因的表达
目的 探讨应用RNA干扰(RNAi)技术抑制Ang2、Tie2基因的表达情况,为进一步研究其在体外抑制血管生成以及抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础.方法 构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条并予以鉴定.用pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测各组HUVECs中Ang2及Tie2的蛋白及mRNA的表达状况.结果 成功构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条,用其转染HUVECs后,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,Ang2、Tie2在蛋白和mRNA的表达水平均受到明显抑制(P＜0.05),并且siRNA的2条重组质粒之间均差异无统计学意义(P＞0.05).结论 pSilencer 1.0-u6-Ang2/Tie2-siRNA在体外能够抑制HUVECs的Ang2和Tie2的蛋白及mRNA的表达.
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Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定
目的 构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达我体.方法 先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过Xba I酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP- U6- Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度.结果 成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过Xba I酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL.结论 成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体.
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pHBAd-MCMV-GFP-NCAM1真核表达质粒的构建和鉴定
目的 将目的基因NCAM1与质粒载体pHBAd-MCMV-GFP进行连接,得到重组质粒pHBAd-MCMV-GFP-NCAM1.方法 对目的基因和质粒载体分别用内切酶NotI和Nsil进行双酶切,产物回收后进行连接、转化,得到重组质粒pHBAd-MCMV-GFP-NCAM1.转化后的菌液进行PCR阳性克隆鉴定,并对阳性样本进行测序.结果 首先对NCAM1进行扩增,从实验结果看符合预期效果,在双酶切、连接和转化实验后,对构建完成的重组质粒进行鉴定,PCR阳性克隆鉴定结果显示重组质粒构建成功,NCAM1已连接进入重组质粒中,测序的结果进一步印证阳性鉴定结果.结论 带有目的基因NCAM1的重组质粒构建成功.
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人α-防御素HNP1基因在气管上皮细胞的转染表达
已有报道将HNP1 cDNA重组到pBabe/neo质粒载体中,并转染体外培养的无内源防御素的小鼠巨噬细胞系,结果检测到HNP1 mRNA的表达,同时发现这些巨噬细胞的抗菌活性得到了增强.
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结核分枝杆菌ESAT-6基因重组卡介苗的构建与鉴定
目的:ESAT-6是结核分枝杆菌的一种分泌性蛋白质,具有免疫保护作用,可作为抗结核病新疫苗的候选分子.而卡介苗由于缺失ESAT-6基因,不能产生该抗原蛋白.本研究旨在构建ESAT-6基因重组卡介苗,使其表达ESAT-6抗原,从而增强其免疫原性和免疫保护性,探索将该重组卡介苗用作新型结核病疫苗的可行性.方法:分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到BCGα-抗原(α-Ag)信号肽序列和结核杆菌ESAT-6基因,将ESAT-6基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组,得到重组质粒pME.再将BCGα-Ag信号肽序列克隆至pME中,得到重组质粒pSME.后通过电穿孔法将pSME导入卡介苗中,并用抗性筛选、PCR扩增及打点杂交进行鉴定.结果:电转化后的卡介苗能在含10 mg/L卡那霉素的培养基上生长.以重组卡介苗总DNA为模板的PCR扩增得到阳性扩增带,大小与α-Ag信号肽序列加上ESAT-6基因的长度一致.打点杂交中探针与重组卡介苗显示阳性信号.结论:基因重组卡介苗构建成功,并有望分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT-6.该重组卡介苗既保留了卡介苗中原有的抗原,又增添了新的保护性抗原,且这种抗原可被广泛识别,能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆,因此ESAT-6重组卡介苗可能具有更好的免疫原性和保护力.本研究为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础.
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载体介导HER-2 RNA干扰治疗乳腺癌研究
目的探讨载体介导HER-2RNA干扰治疗HER-2阳性乳腺癌的可行性.方法构建能够产生HER-2 siRNA的质粒载体,利用载体转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR-3,利用RT-PCR与Western blot检测HER-2mRNA与蛋白表达情况,同时观察转染后SKBR-3细胞凋亡及生长情况.结果SKBR-3细胞HER-2受到载体介导的RNA干扰后,HER-2mRNA及蛋白表达出现明显下调,细胞凋亡增加,肿瘤细胞生长受到抑制.结论乳腺癌HER-2是理想的RNA干扰治疗靶点,靶向HER-2的RNA干扰可以诱导肿瘤凋亡,抑制肿瘤生长.
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HPV6bL1短发夹shRNA表达质粒的构建及鉴定
目的 用pSilencer2.1质粒载体构建人类乳头瘤病毒6b型L1衣壳蛋白HPV6bL1短发夹shRNA质粒重组体,并进行序列分析,为探索尖锐湿疣基因抗体防治研究治疗的新途径打好基础.方法 用DNA重组技术将针对人HPV6bL1基因的不同部位所设计的3对设计有小发夹结构的2对DNA序列.经退火成互补双链,再克隆至pSilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果 成功构建了HPV6bL1shRNA质粒重组体.结论 HPV6bL1 shRNA质粒重组体的成功构建为研究尖锐湿疣基因靶向抗体打下基础.
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HP450基因的克隆及质粒载体的构建和鉴定
目的HP450基因的克隆载体构建.方法用RT-PCR技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体,经菌液PCR,酶切鉴定.构建成pMD18-HP450重组质粒载体.结果测序显示完全正确,实现了HP450基因的克隆和质粒载体的构建.结论可以对重组成功的HP450基因进行体外表达和动物的体内应用.
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乙肝DNA疫苗的研究进展
免疫接种是预防 HBV感染的一项重要措施。第 1代 HBV疫苗以无症状携带者血浆中纯化的 22nm球形亚单位病毒颗粒作为疫苗。第 2代 HBV疫苗由在真核细胞中表达的相同的亚单位病毒颗粒组成 [1]。但是血源疫苗需要大量 HBsAg携带者血浆，又需要较高的灭活技术、成本也较高；基因工程疫苗、全程疫苗需接种 3剂疫苗，这可降低免疫覆盖率， 15％～ 20％的人群对其呈现无应答或应答低下，另外，对有可能逃避现有疫苗保护作用的 HBsAg突变株存在争论 [2]，所以乙肝 DNA疫苗在此基础上应运而生。 1 乙肝 DNA疫苗的组成 1.1 目的基因的选择 HBV 基因组含有多种抗原： preS1基因、 preS2基因、 S基因、 c基因、 e基因、和 X基因。因为 preS1蛋白、 preS2蛋白和 S蛋白均可诱导机体产生相应特异抗体，其中抗 -HBs具有保护力， preS2抗体可能与病毒清除密切相关。 c基因产物 -HBcAg是机体特异性 CTL的主要靶抗原。所以目前目的基因的研究主要集中在 S， S1， S2基因 [3]和 c基因 [4]。1.2 质粒载体的选择因涉及到 DNA 疫苗的安全性，美国 FDA已规定应用于人体的质粒 DNA疫苗不应含有氨基甙类抗生素（如氨苄青霉素）抗性基因，他们推荐使用含卡那霉素和新霉素等抗性基因的表达载体。国内学者袁正宏等分别构建插入 HBV表面抗原编码基因的表达载体 pcDNA1.1/SA（无抗性基因）和 pcDNAI/AMP/SA（含氨苄青霉素抗性基因），发现 pcDNAI/AMP/SA的免疫效果优于 pcDNA1.1/SA， pcDNA1.1/SA的免疫效果可被 CpG免疫刺激元件（ ISS）增强，而 pcDNAI/AMP/SA诱生特异性免疫应答的能力则被 ISS抑制 [5]。另外， Waltrand提出：（ 1） HCMV启动子的调节能力较佳。（ 2）在 HCMV启动子控制的 HBV DNA疫苗中，内含子、 neo基因、 HBV X 基因等存在与否意义不大。（ 3） DNA疫苗分子大小对免疫效果可能有影响，因大分子不易被摄取。
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肿瘤标记蛋白Prdx1-pMSCV质粒的构建和鉴定
目的 构建含有过氧化物氧化还原酶1(Prdx1)基因的pMSCV重组质粒,转染至人气道上皮细胞内,并进行鉴定,为进一步研究Prdx1在细胞内的功能奠定基础.方法 构建Prdx1-pMSCV质粒,将Prdx1mRNA编码区序列克隆至pMSCV载体上,测序验证后大量提取,转染至BEAS-2B细胞内,细胞内可高表达Prdx1蛋白,收集总mRNA和蛋白裂解液分别进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Prdx1-mRNA和蛋白质印迹(Western blot)检测Prdx1蛋白变化.观察质粒转染后细胞内Prdx1高表达.结果 重组质粒经限制性内切酶EcoR工和BglⅡ双酶切及测序鉴定均证实Prdx1基因已正确克隆到pMSCV质粒载体中.Westernblot结果进一步证实Prdx1-pMSCV重组质粒构建正确.结论 本研究正确构建了Prdx1-pMSCV质粒.
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乙型肝炎病毒X蛋白对NFκB启动子和增强子反式激活作用
应用杆状病毒穿梭质粒载体与HBV X表达质粒共转染HepG2细胞，研究HBV X蛋白对杆状病毒载体中的NFκB启动子和增强子反式激活作用，作为进一步杆状病毒载体应用研究的基础。
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pSIREN/PB1 siRNA重组质粒抗甲型流感病毒研究
目的 研究重组质粒pSIREN/PB1在鸡胚尿囊液中干扰甲型流感病毒复制的效果.方法 设计1对编码PB1siRNA的寡核苷酸序列,经退火互补形成双链,再克隆至带有U6启动子的RNAi ready pSIREN-shuttle线性化载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,双酶切和测序鉴定重组质粒pSIREN/PB1.大量提取重组质粒pSIREN.PB1,用脂质体进行包裹后,按每只鸡胚90 μg质粒量接种于10日龄鸡胚尿囊腔,4血凝单位甲型流感病毒液分别于质粒接种后0 h、24 h、48 h接种于鸡胚尿囊腔,流感病毒接种48 h后收集无色澄清尿囊液进行血凝实验检测流感病毒效价.结果 甲型流感病毒PB1基因的siRNA编码序列成功克隆至pSIREN质粒载体.经酶切和测序分析,重组质粒pSIREN/PB1中的siRNA编码序列均完全正确.将脂质体包裹的pSIREN.PB1质粒和病毒液同时注射入鸡胚尿囊腔后,收获的甲型流感病毒效价低.结论 成功构建了表达甲型流感病毒PB1siRNA的重组质粒pSIREN.PB1,并且它可以抑制鸡胚中流感病毒复制.此研究进一步证实了RNA干扰对流感病毒复制的抑制作用,为开发流感基因防治新方法奠定了基础.
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shRNA表达载体对HSV-2 ICP4基因的干扰效应
目的 构建针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探究该载体表达的shRNA对HSV-2的抑制作用.方法 重组表达载体通过脂质体转染法转染HEK293细胞,并接种HSV-2,48 h后,实时荧光定量RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot检测ICP4蛋白的表达情况,终点滴定法测定病毒的滴度.结果 与对照组相比,干扰组对mRNA抑制率为71％,使蛋白表达减少71.81％,并且病毒滴度也明显降低(P＜0.05).结论 构建的pGPU6/Neo-shRNA ICP4重组质粒表达载体能在体外细胞水平上千扰HSV-2 ICP4的基因表达,抑制HSV-2在细胞中复制.
