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小鼠 B10细胞的分离、鉴定及功能特征
目的：评估小鼠不同组织中B10细胞的比例，分离B10细胞并鉴定其生物学功能，探讨其对效应性T细胞（ CD4＋CD25-T）及调节性T细胞（ Treg）的免疫调节机制。方法采用流式细胞仪检测小鼠不同组织来源B10细胞的表达以及脂多糖（ lipopolysaccharide ，LPS）对B10激活的影响；采用流式细胞分选术（ FACS）和免疫磁珠分选术（ MACS）分选B10细胞、CD4＋CD25-T 细胞和Treg；利用混合淋巴细胞培养实验观察B10对CFSE标记的CD4＋CD25-T细胞和CD4＋CD25＋T细胞增殖的调节作用及机制。结果（1）脾脏CD19＋CD5＋CD1dhigh B细胞表达为（3．95±0．79）％，与外周血、肠系膜淋巴结和外周淋巴结相比较表达高，组间差异有统计学意义（P＜0．05）；脾脏CD19＋IL-10＋B细胞表达为（2．02±0．16）％，与外周血、肠系膜淋巴结和外周淋巴结相比较表达高（P＜0．05），且IL-10主要由CD1dhighCD5＋B细胞亚群分泌（P＜0．01）；（2） LPS联合乙酸佛波醇（PMA）、莫能菌素（monen-sin）和离子霉素（ionomycin）能活化B10细胞分泌IL-10。延长LPS的作用时间（48 h）能促进CD19＋CD5＋CD1dhigh B细胞高表达及IL-10分泌增加（P＜0．01）；（3） CD19＋CD5＋CD1dhigh B细胞在体外可抑制CD4＋CD25-T细胞增殖（P＜0．01）、促进CD4＋T细胞分泌IL-10（P＜0．01），同时可促进Treg增殖（P＜0．01）。结论 B10细胞在小鼠脾脏高表达，通过Toll样受体（TLR）信号通路被激活。活化的B10细胞具有免疫抑制性，可抑制CD4＋CD25-T细胞增殖，促进Treg增殖，其可能免疫调节机制是IL-10的释放增加。因此B10细胞有望为治疗多种自身免疫性疾病提供一种全新的治疗方法。
关键词： 调节性B细胞 IL-10 LPS CD4+CD25-T细胞 调节性T细胞 -
MicroRNA let-7e对LPS诱导的TNF-α表达的影响及机制的初步研究
目的 研究let-7e对LPS诱导的人原代单核细胞产生的TNF-α表达的影响及其机制.方法 用全血分离人原代单核细胞,流式细胞术检测单核细胞表面标记CD14;let-7e mimics或mimicsNC瞬转原代单核细胞24 h、36 h、48 h,qRT-PCR和免疫荧光法检测其转染效率;采用1 mg/L LPS刺激原代单核细胞1h、3h、6h、12 h后,ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α的浓度,筛选出LPS佳刺激时间;qRT-PCR法及ELISA法评估let-7e对LPS诱导原代单核细胞产生TNF-α的影响;Western blot法检测瞬转let-7e mimics后EZH2的表达水平以及瞬转siEZH2后NF-κB p65、ARFGAP1和Arfap-tin2的表达水平.结果 CD14+细胞大于70％;免疫荧光结果显示miRNA模拟物可以转染原代单核细胞,转染率约为70％;let-7e mimics转染原代单核细胞24 h,细胞内即可表达较高水平的let-7e;LPS刺激原代单核细胞12h即可产生较高水平的TNF-α.ELISA结果证实let-7e mimics显著抑制LPS诱导的TNF-α的产生,同时在mRNA水平也得到一致的结果;Western blot结果显示let-7e mimics组EZH2的水平明显低于let-7e mimics NC组,沉默EZH2后胞核中NF-κB p65显著下调,沉默EZH2后囊泡转运调节蛋白ARFGAP1和Arfaptin2的表达显著下降.结论 在原代单核细胞中,let-7e显著抑制LPS诱导的TNF-α的表达;其机制可能是let-7e靶向作用EZH2进而调节NF-κB的活性及囊泡转运相关蛋白ARFGAP1和Arfaptin2的表达水平.
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重症感染控制:抗微生物药物是奢侈品吗?
2011年10月礼来公司宣布抗严重脓毒血症药物Xigris(人类活化蛋白C重组体)主动下市,Xigris与它的特异性抗脓毒血症的前任Centoxin(LPS单克隆抗体,1993年撤出市场)命运相近,是抗脓毒症特异性治疗又一次不体面的终结[1].
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连续性血液净化联合血必净注射液对重症急性胰腺炎患者血清AMY、GAS、LPS水平的影响
目的 探讨连续性血液净化联合血必净注射液治疗重症急性胰腺炎(SAP)的临床效果及安全性.方法 回顾性选取焦作市人民医院2014年10月至2017年8月收治的84例SAP患者作为研究对象,按照治疗方法分为观察组与对照组,每组各42例.常规治疗基础上,对照组给予连续性血液净化治疗,观察组给予连续性血液净化+血必净注射液治疗.对比两组患者症状及体征缓解情况、治疗前后血清相关因子[淀粉酶(AMY)、胃泌素(GAS)、内毒素(LPS)]水平、炎性指标[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)]水平、病情(APACHEⅡ)评分及安全性.结果 ①症状、体征缓解情况:观察组恶心/呕吐、腹痛、腹胀缓解时间及体温恢复时间均较对照组短(P＜0.05);②血清相关因子水平:两组血清AMY、GAS、LPS水平治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05),治疗后两组血清AMY、GAS、LPS水平均较治疗前明显降低(P＜0.05),且观察组血清AMY、GAS、LPS水平均较对照组低(P＜0.05);③血清炎性指标水平:两组血清TNF-α、IL-6、CRP水平治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05),治疗后两组血清TNF-α、IL-6、CRP水平均较治疗前明显降低(P＜0.05),且观察组血清TNF-α、IL-6、CRP水平均明显低于对照组低(P＜0.05);④病情评分:两组APACHE Ⅱ评分治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05),治疗后两组A-PACHE Ⅱ评分均较治疗前明显降低(P＜0.05),且观察组APACHE Ⅱ评分较对照组低(P＜0.05);⑤安全性:观察组治疗期间不良反应发生率[7.14％(3/42)比9.52％(4/42)]与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)o结论连续性血液净化联合血必净注射液治疗SAP疗效显著,可有效缓解其临床症状及体征,降低血清危险因子水平,促进疾病早期转归,且具有一定的安全性.
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脂多糖与酒精性肝病
酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)即由酒精引起的一 系列临床综合征及肝脏病理改变,包括酒精性脂肪肝、酒精性肝 炎、肝纤维化和肝硬化.ALD 的病理机制涉及酒精及其有毒代 谢产物对肝脏各种细胞的直接影响和其他特定细胞对肝脏的影 响之间复杂的相互作用[1] .已经证实,脂多糖(Lipopolysaccha- ride,LPS),也被称为内毒素,是ALD 发病机制中的一个主要因 素.事实上,LPS 可导致脂肪肝的发生,因为它诱导炎症和引起 肝硬化,这是ALD 的所有特征[2] .LPS 的这些影响体现在肝脏 各种细胞类型中,LPS 的来源似乎是在ALD 患者的肠道内,由酒 精引起的肠道通透性破坏所导致.从细胞和分子水平角度看, LPS 是Toll 样受体复合物(Toll-like receptor 4,TLR4),其诱导特 定的细胞内活化途径.本篇综述主要探讨LPS 在ALD 中的作 用及酒精相关的肠肝轴变化的新研究进展.
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人参皂苷Rb1通过抑制PI3K/AKT信号通路保护脂多糖诱导的心肌细胞炎症反应
目的 探究人参皂苷Rb1在脂多糖(LPS)诱导的H9C2心肌细胞炎症反应中的作用及分子机制.方法 建立LPS诱导的H9C2心肌细胞炎症反应模型.在用1μg/ml的LPS诱导H9C2心肌细胞炎症反应前,使用100μM人参皂苷Rb1或1μM PI3K抑制剂Wortmannin预处理1 h,2 h后收集细胞样本.利用qPCR检测白介素-6(IL-6),白介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达水平;用ELISA试剂盒检测细胞上清IL-6,IL-1β,TNF-α的蛋白表达;用WB实验检测p-AKT和AKT的表达水平.结果 人参皂苷Rb1显著抑制LPS诱导的IL-6,IL-1β,TNF-α的mRNA(P<0.001)和蛋白(P<0.001)表达水平;人参皂苷Rb1显著抑制LPS诱导的PI3K/AKT信号通路的激活(P<0.001);PI3K抑制剂Wortmannin也能显著抑制LPS诱导的p-AKT表达水平以及IL-6,IL-1β,TNF-α的mRNA(P<0.001)和蛋白(P<0.001)表达水平.结论 人参皂苷Rb1通过抑制PI3K/AKT信号通路阻止LPS诱导的心肌细胞炎症反应.
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一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞内毒素耐受模型的建立
内毒素(LPS)耐受是生物在进化过程中形成的一种适应性防御机制,它可以使机体避免对LPS刺激的持续性反应,在感染性休克和脓毒症机体防御机制的建立中具有重要的作用.探讨LPS耐受建立的机制有助于深入认识机体的抗炎调节机制,可为与LPS介导的失控炎症反应性疾病的防治提供新的思路和依据.
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LPS对HepG-2细胞因子表达的影响
目的 探讨LPS对HepG-2细胞TGF-β1,VEGF,IL-6表达的影响.方法 用LPS刺激HepG-2细胞,RT-PCR和Western-blot方法检测TGF-β1,VEGF,IL-6基因的转录和蛋白的表达的情况,同时用HTA125阻断TLR4受体检测LPS对HepG-2细胞TGF-β1,VEGF,IL-6基因的转录和蛋白的表达的情况.结果 LPS刺激细胞后可以促进TGF-61、VEGF、IL-6基因的转录和蛋白的表达增加,抑制TLR4受体后LPS对细胞TGF-β1、VEGF、IL-6表达影响下降.结论 LPS可以通过TLR4受体来促进HepG-2细胞分泌TGF-131、VEGF、IL-6.
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脂多糖刺激单核巨噬细胞培养上清液对成骨细胞成骨特性的影响
目的 探讨建立牙周炎症的体外实验模型的可行性,为后续进行牙周炎症状态下应力对牙槽骨改建的研究奠定基础.方法 以牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)Pg-LPS刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)的培养上清液作用于体外培养的小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)24 h和48 h后,分别通过噻唑蓝(MTT)法和碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测MC3T3-E1的增殖活性和碱性磷酸酶活性,观察脂多糖刺激的小鼠单核巨噬细胞培养上清液对小鼠成骨细胞成骨功能的影响.结果 Pg-LPS刺激RAW264.7后其上清液含L-1β、IL-6 和TNF-α等炎症因子,且与LPS的浓度和刺激时间呈依赖性.此上清液对MC3T3-E1的增殖和ALP活性均有抑制作用,亦与上清液中以上炎症因子的浓度呈依赖性,与体内牙周炎症状态相似.结论 Pg-LPS体外刺激RAW264.7的培养上清液可以应用于建立体外牙周炎症模型,这将为后续研究牙周炎症状态下应力对牙槽骨改建的影响奠定初步的基础.
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脂多糖对皮肤纤维母细胞和表皮细胞的影响
在我们从事的某些植物提取物实验中证实了其刺激纤维母细胞和表皮细胞生长的效果[1].植物提取过程中可能存在内毒素污染问题.据报道某些细菌来源的内毒素具有促进细胞分裂增殖的作用[2]. 本研究旨在证明植物提取物常受污染的E coli内毒素对纤维母细胞和表皮细胞增殖的促进作用,并通过其刺激生长所需浓度与植物提取物实际浓度的对比,来看其是否对我们既往显示的植物提取物的促细胞增殖效果产生了影响.
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神经生长因子对大鼠脑损伤神经细胞凋亡的影响
目的 探讨神经生长因子(NGF)对LPS致大鼠脑损伤神经细胞凋亡的影响.方法 采用颈内动脉注射LPS造成大鼠脑损伤模型.大鼠30只随机分为5组:生理盐水组(A)、LPS致脑损伤组(B)、NGF处理组C,各组分别于6、12、24、48h处死取脑标本,TUNEL 法观察大鼠脑损伤神经细胞凋亡的变化.结果 与生理盐水组相比,LPS组大鼠脑皮层神经细胞凋亡数目显著增多(P<0.05);与LPS组相比,NGF处理组大鼠脑皮层神经细胞凋亡数目显著减少(P<0.05).结论 NGF能明显减轻LPS致大鼠脑损伤神经细胞凋亡,具有明显脑保护作用.
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番荔枝酰胺衍生物FLZ对LPS联合MPTP诱发小鼠慢性帕金森病的治疗作用
利用细菌内毒素脂多糖(LPS)联合神经毒素MPTP诱发的慢性小鼠帕金森病(PD)模型,考察番荔枝酰胺衍生物FLZ片剂对PD的治疗作用.C57/BL小鼠腹腔注射LPS(5 mg.kg-1)一次,1周后,小鼠皮下注射MPTP (25 mg.kg-1),每天1次,共注射2天.8周后,FLZ (25、50及75 mg.kg-1)及阳性对照药L-DOPA治疗性给药,每天1次,共给药2个月.以爬杆法及足迹法不同时间评价PD小鼠的行为学能力,高效液相色谱法检测纹状体多巴胺含量,免疫组化法分析黑质纹状体酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数.结果显示,LPS与MPTP合用能成功诱发小鼠PD样病理改变,在造模后第8周模型组动物爬杆行为学评分与正常对照组相比有显著性降低,在步伐测定实验中出现明显的步伐紊乱和步伐长度减小.FLZ (25、50及75 mg·kg-1)治疗性给药2个月,能显著改善PD小鼠的行为学障碍,表现在增加爬杆行为学评分,改善动物的步伐紊乱及步伐长度；同时,提高小鼠黑质TH阳性神经元的数量,增加纹状体内多巴胺含量.结果表明,FLZ片剂对LPS联合MPTP诱发的慢性炎症性PD小鼠有良好的治疗作用,目前该药己申报临床试验,有望成为新型抗PD药物.
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丹酚酸D通过抑制NF-κB的激活减轻LPS诱导的BV2细胞炎症反应
目的:研究丹酚酸D对脂多糖(LPS)诱导BV2小胶质细胞炎症反应的抑制作用及机制.方法:采用LPS诱导BV2细胞炎症反应,MTT法检测LPS与丹酚酸D对细胞存活率的影响,通过Griess法检测细胞上清中NO水平,并对其上游iNOS的表达进行检测.采用ELISA和qPCR法分别检测细胞中TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10的分泌及转录水平.应用Western Blot法测定NF-κB p65和IκBα的磷酸化水平,免疫荧光法检测BV2细胞中NF-κB p65的核转位.结果:1μg·mL-1的LPS和0.1～20 μmol·L-1丹酚酸D对BV2细胞无明显毒性作用.丹酚酸D能够显著抑制LPS刺激所致NO和iNOS的水平增加,降低TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10的转录水平,同时丹酚酸D能够显著抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的激活,抑制NF-κB p65的转位入核.结论:丹酚酸D能够通过抑制NF-κB的激活减轻LPS诱导的BV2细胞炎症反应.
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花椒提取物调节固醇和脂多糖诱导的胆固醇积聚
本研究旨在通过体内和体外实验探索花椒的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物调节固醇类物质和脂多糖诱导的胆固醇积聚.通过测定总酚含量萃取物和DPPH清除率评价萃取物的抗氧化活性.在体外我们用25-羟胆固醇+胆固醇诱导HepG2 细胞,经PE、EtOAc、BuOH预处理之后,发现细胞总胆固醇含量和ApoB的分泌降低,SREBP2、HMGCR和ACAT的表达下调的同时CYP27A1、ABCA1和LDLR的表达上调.在体内我们用腹腔注射LPS诱导C57BL 6小鼠产生炎症,血清TNF-α水平和促炎因mRNA的检测结果发现EtOAc和BuOH组分有抗炎的作用.另外,BuOH萃取物能降低肝脏总胆固醇含量,提高 LX R-α、ABCA1 的 mRNA表达.通过活性追踪分离,我们从EtOAc和BuOH两个组分中分离得到β-谷甾醇、芝麻素、核脂素和syringaresinol-β-D-glucoside 4个化合物.
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内毒素与降钙素原在icU脓毒症中的联合诊断价值
目的：探讨内毒素（lPs）与降钙素原（Pct）在重症医学科（icU）脓毒症中的联合诊断价值。方法：选择icU住院患者81例。根据1991年美国胸科医师学会与危重医学会（accP/sccM）共识会议制定的脓毒症诊断标准分为：脓毒症组（sP组）、细菌感染组（Bc组）与系统性炎症反应综合征组（si组）。细菌感染组与系统性炎症反应组统称为非脓毒症组（ns组）。同时选取20名健康志愿者作为正常对照组(nc组)。elisa方法检测血清中lPs与Pct蛋白水平，分别比较lPs与Pct在不同组的差异。结论：1、lPs的升高对于早期区别脓毒症与细菌感染是无效的，lPs并不能作为脓毒症早期的诊断标记。2、Pct不能区别脓毒症与系统炎症反应，Pct并不能作为早期脓毒症的诊断标记。3、lPs与Pct的早期联合检测可有效提高脓毒症的阳性率，为早期脓毒症的诊断、早期干预治疗提供有效检测方法。
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LPS对THP-1细胞sCD14和mCD14表达的影响
目的 观察不同浓度脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞(human acute monocytic leukemia cell line)不同时间对可溶性CD14(soluble CD14,sCD14)和膜CD14(Membrane CD14,mCD14)表达的影响及sCD14、mCD14表达之间的关系.方法 不同浓度LPS(0、0.1、1.0、10、50ng/ml)刺激经佛波酯(PMA)诱导的THP-1细胞不同时间(0.5、1、3、5、8h),用酶联免疫吸附法检测sCD14的量,流式细胞术检测mCD14的量.结果 LPS浓度为0ng/ml时,sCD14的表达与时间呈正相关(r=0.915,P=0.029),8h达高值(1044.39±12.21 pg/ml),mCD14的表达与时间呈正相关(r=0.945,P=0.015),8h达高值(4.23％±2.11％),且随着时间的延长,sCD14的表达与mCD14的表达呈正相关(r=0.969,P=0.006);LPS浓度为0.1ng/ml时,随着时间的延长,sCD14的表达与mCD14的表达呈正相关(r=0.944,P=0.016);当LPS刺激细胞0.5h时,sCD14的表达与mCD14的表达呈负相关(r=-0.839,P=0.037);1h时,mCD14的表达与LPS浓度呈正相关(r=0.839,P=0.037),100ng/ml时达高值(3.24％±1.95％).结论 未经LPS刺激的THP-1细胞可以表达sCD14及mCD14;LPS的浓度及刺激细胞的时间促进sCD14和mCD14表达.
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枯否细胞在非酒精性脂肪肝炎发生中的作用
目的探讨枯否细胞(Kupffer cell,KCs)在高脂饮食致小鼠非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)发生中的作用.方法选取雌性昆明种小鼠46只,随机分为高脂组与对照组.高脂组给予高脂饮食,12周后每组取小鼠10只,腹主动脉采血后测定血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、内毒素(LPS)水平.取肝组织用于组织病理切片的制备及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平检测.分离培养KCs,以探讨发生NASH时,KCs吞噬聚苯乙烯乳珠的能力及其在LPS刺激下分泌TNF-α的变化.同时,采用Western blot方法研究肝组织CD68及KCs CD14的表达.结果 12周后组织病理学显示高脂组小鼠已发生NASH,血清ALT(215.70±15.65)、LPS(0.19±0.04EU/m1)及肝组织匀浆TNF-α(4.81±0.98ng/ml)水平均明显高与对照组(53.87±6.63,0.08±0.03EU/ml,3.73±0.67ng/ml,t=2.87～30.11,P＜0.01).KCs分离培养结果表明,小鼠发生NASH时,KCs呈活化状态,但其吞噬聚苯乙烯乳珠能力降低(高脂组为25.54±8.28,对照组为46.75±10.40,t=5.04,P＜0.01),给予LPS刺激后TNF-α的分泌明显增加(高脂组为84.60±14.25,对照组为60.50±8.05,t=4.17,P=0.001).Westem blot结果显示,发生NASH时肝组织CD68及KCsCD14受体表达上调.结论在高脂饮食所致小鼠发生NASH时,虽KCs处于活化状态,但其吞噬功能降低而分泌TNF-α能力则增强.提示KCs功能紊乱与NASH发生密切相关.
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LPS和PDTC对子宫内膜细胞培养上清液中IL-1β浓度的影响
目的 了解LPS及LPS+PDTC对正常及子宫内膜异位症患者的子宫内膜细胞IL-1β浓度的影响.方法 分别用LPS及LPS+PDTC干预正常及内异症患者的子宫内膜细胞,取培养上清液,用ELISA方法 检测IL-1β的浓度变化.结果 正常子宫内膜细胞IL-1β浓度变化差异无统计学意义,而内异症患者的在位及异位子宫内膜细胞IL-1β浓度变化差异有显著统计学意义.结论 用LPS及PDTC激活及抑制NF-κB的活性,通过检测IL-1β浓度变化,了解NF-κB与子宫内膜异位症的关系及其在子宫内膜异位症的发病机制中起着重要作用.
关键词： LPS PDTC 子宫内膜异位症 子宫内膜细胞 IL-1β NF-κB -
血液灌流用内毒素吸附剂的研究进展
一、内毒素及内毒素血症内毒素(endotoxin)是革兰阴性(G-)细菌的细胞外壁溶解后释放出的脂多糖(LPS)[1].细菌释放出大量内毒素至血液可引发内毒素血症.内毒素血症进入血液后引起一系列反应,终导致器官坏死、不可逆休克和死亡,目前临床上尚无有效的治疗方法[2].
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LPS诱导鼠急性肺损伤模型的评价分析
急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是通过干扰与肺泡毛细血管屏障有关的临床急危重症.过去由于对ALI和ARDS机制研究不清、临床上没有针对性治疗方法,导致疾病的死亡率很高.近年来,随着利用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)创建ALI动物模型实验的研究的不断深入,在ALI模型的建立及其机制方面有了较新的进展,新的研究指导临床有望降低ALI和ARDS的死亡率.本文对LPS诱导鼠急性肺损伤不同模型进行评价分析,以便广大研究者对急性肺损伤动物模型建立和研究提供进一步认识,为前临床研究提供动物实验基础.
