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microRNA 家族成员 let-7e 对人单核细胞系THP-1细胞活性的影响及机制研究
目的：研究let-7e对单核细胞系THP-1细胞凋亡和细胞因子分泌的影响及其机制。方法免疫荧光法检测cy3标记的mimic 对照转染THP-1细胞转染率，qRT-PCR法检测let-7e mimic及对照、let-7e inhibitor及对照转染THP1-细胞后let-7e的表达；MTT法检测转染后THP-1细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot法检测let-7e靶基因IFI6（interferon alpha-inducible protein 6）、EZH2（enhancer of zeste homolog 2）、caspase-3的表达；转染48h 后THP-1细胞用LPS 刺激2 h收集细胞培养上清，细胞因子芯片法检测上清中炎性因子的表达。结果 miRNA模拟物可以转染THP-1细胞，转染率约为75％，转染 let-7e mimic 12h 、24 h、48 h 后THP-1细胞的 let-7e 表达倍数分别为8．551±0．365、83．893±15．941、38．858±2．743，转染 let-7e inhibitor 12 h、24 h、48 h后THP-1细胞的let-7e表达倍数分别为0．594±0．174、2．427±1．229、3．053±0．207；let-7e mimic转染组THP-1细胞活性升高、凋亡率降低；miranda数据库分析证实let-7e与EZH2、IFI6、caspase-3结合的mirSVR score 分别为－0．1608、－0．5693、－09．423，证实IFI6、EZH2、caspase-3可能是let-7e的靶基因；let7-e mimic转染组IFI6、EZH2、caspase-3表达都有所下降；let-7e mimic 转染组 CD154、粒细胞集落刺激因子（ G-CSF）、CD54、IL-13、IL-1RA和IL-23表达有所下降。结论 let-7e有抗THP-1细胞凋亡的作用，可影响LPS诱导的细胞因子的表达。 let-7e可能通过调节其靶基因caspase-3、IFI6、EZH2对THP-1细胞的生物学功能产生影响。
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MicroRNA let-7e对LPS诱导的TNF-α表达的影响及机制的初步研究
目的 研究let-7e对LPS诱导的人原代单核细胞产生的TNF-α表达的影响及其机制.方法 用全血分离人原代单核细胞,流式细胞术检测单核细胞表面标记CD14;let-7e mimics或mimicsNC瞬转原代单核细胞24 h、36 h、48 h,qRT-PCR和免疫荧光法检测其转染效率;采用1 mg/L LPS刺激原代单核细胞1h、3h、6h、12 h后,ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α的浓度,筛选出LPS佳刺激时间;qRT-PCR法及ELISA法评估let-7e对LPS诱导原代单核细胞产生TNF-α的影响;Western blot法检测瞬转let-7e mimics后EZH2的表达水平以及瞬转siEZH2后NF-κB p65、ARFGAP1和Arfap-tin2的表达水平.结果 CD14+细胞大于70％;免疫荧光结果显示miRNA模拟物可以转染原代单核细胞,转染率约为70％;let-7e mimics转染原代单核细胞24 h,细胞内即可表达较高水平的let-7e;LPS刺激原代单核细胞12h即可产生较高水平的TNF-α.ELISA结果证实let-7e mimics显著抑制LPS诱导的TNF-α的产生,同时在mRNA水平也得到一致的结果;Western blot结果显示let-7e mimics组EZH2的水平明显低于let-7e mimics NC组,沉默EZH2后胞核中NF-κB p65显著下调,沉默EZH2后囊泡转运调节蛋白ARFGAP1和Arfaptin2的表达显著下降.结论 在原代单核细胞中,let-7e显著抑制LPS诱导的TNF-α的表达;其机制可能是let-7e靶向作用EZH2进而调节NF-κB的活性及囊泡转运相关蛋白ARFGAP1和Arfaptin2的表达水平.
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let-7e生物学作用的研究进展
let-7e是由22个核苷酸构成的内源性非编码RNA,是let-7 miRNA基因家族的一员.近的miRNA筛查研究发现:let-7e在胚胎干细胞分化、肿瘤的发展过程、神经系统功能和炎症反应等方面可通过调控其mRNA靶基因的表达,发挥极其重要的生物学作用.
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MicroRNA let-7e与食管鳞癌临床分期研究
目的：检测食管鳞癌患者不同临床分期癌组织及癌旁组织中MicroRNA let-7e表达水平的差异。方法：应用实时荧光定量RT-PCR Taqman MGB探针法，检测60例食管癌癌组织及癌旁组织中MicroRNA let-7e表达水平。以U6 snRNA为内参，进行荧光定量PCR,统计分析表达水平的差异。结果：MicroRNA let-7e的表达水平在癌组织比癌旁组织高，病理分期I期与III期相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：MicroRNA let-7e在食管鳞癌中表达水平明显高于癌旁组织，可能用于食管鳞癌临床分期诊断的重要标记。
关键词： 食管鳞癌 微小RNA let-7e 实时荧光定量聚合酶链反应 -
microRNA let-7e 逆转人卵巢癌细胞顺铂耐药及其作用机制
目的：研究人类 microRNA let-7e(hsa-let-7e)在人卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达及其作用机制。方法：采用实时荧光定量 PCR 法检测 let-7e 在卵巢癌亲本细胞株A2780及耐顺铂卵巢癌细胞 A2780/ CP 中的表达；采用实时荧光定量 PCR 法和 Western blot 法分别检测 A2780细胞和 A2780/ CP 细胞中果蝇 zeste 基因增强子同源物2(EZH2) mRNA 和蛋白的表达。将 let-7e 模拟物(mimics)及阴性对照(negative control,NC)转染A2780/ CP 细胞,采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 法分别检测 EZH2 mRNA 和蛋白的表达,MTT 法检测细胞的半数抑制浓度(IC50),台盼蓝染色实验检测经顺铂作用不同时间后的细胞存活率。结果：与 A2780细胞比较 A2780/ CP 细胞中 let-7e 呈低表达、EZH2 mRNA 和蛋白相对表达水平显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。 A2780/ CP 细胞转染 let-7e mimics 后,EZH2 mRNA 和蛋白的相对表达水平较阴性对照组明显下降(P<0.05),细胞对顺铂的敏感性显著增强,其半数抑制浓度(IC50值)与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。顺铂作用于转染 let-7e mimics 的 A2780/ CP 细胞后,细胞的存活率较阴性对照组明显降低(P<0.05)。结论：let-7e 在卵巢癌耐药细胞 A2780/ CP 中异常低表达,上调其表达可部分逆转细胞耐药性。 let-7e 可能通过作用于靶蛋白 EZH2参与卵巢癌细胞顺铂耐药的发生和发展。
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外周血miR-494及Let-7e在诊断急性缺血性脑卒中患者中的临床价值
目的：通过检测急性缺血性脑卒中患者与正常对照组外周血中miR-494及Let-7e的表达水平，探讨其与急性缺血性脑卒中的关系。方法：收集67例急性缺血性脑卒中患者及50例非卒中正常健康人群，采用实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR)检测血浆中miR-494及Let-7e表达水平，比较两组外周血中表达水平的差异。并对miR-494及Let-7e行ROC曲线分析，分析其对急性缺血性脑卒中的诊断价值。进一步将急性缺血性脑卒中患者分为预后不佳组(MRS 3-6)和预后良好组(MRS0-2)，分析其在两组之间的差异。结果：急性缺血性脑卒中患者外周血中的miR-494(1.71±1.14)及Let-7e(1.43±0.93)的表达水平较正常对照组外周血明显升高(P<0.05)。miR-494及Let-7eROC曲线下面积分别为0.777、0.756。预后不良组的miR-494(2.04±0.11 vs.1.46±0.05)及Let-7e(1.68±0.61 vs.1.24±0.27)表达水平均较预后良好组显著升高，两组之间有统计学差异(P<0.05)。结论：miR-494及Let-7e可能与急性缺血性脑卒中相关，对急性缺血性脑卒中患者的临床诊断和预后判断具有潜在的应用价值。
关键词： 缺血性脑卒中 miR-494 let-7e 实时荧光定量PCR法 MRS评分 -
let-7e对PBMCs和原代单核细胞产生IL-10的影响
目的 研究let-7e对PBMCs和原代单核细胞产生IL-10的影响.方法 生物信息学分析let-7e的靶基因并通过荧光素酶报告实验进行验证;用1 μg/ml或10 μg/ml LPS刺激PBMCs和原代单核细胞24、48和72 h后,ELISA法检测细胞培养上清中IL-10的质量浓度,筛选出LPS佳刺激时间和质量浓度;用let-7e mimic或阴性对照(NC)瞬时转染PBMCs和原代单核细胞24、36和48 h后,qRT-PCR和免疫荧光法检测其转染效率;转染细胞经LPS刺激后,ELISA法检测细胞培养上清中IL-10的质量浓度.结果 let-7e可能直接靶向抑制IL-10;1(u)mlLPS刺激细胞24 h即可产生较高水平的IL-10;瞬转let-7e mimic 24 h即可使细胞高表达let-7e;let-7e mimic组细胞培养上清中IL-10的质量浓度低于let-7e NC组.结论 let-7e可抑制PBMCs和原代单核细胞产生IL-10.
