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基于ICS技术的NK细胞ADCC效应评价方法建立及应用
目的 探究细胞因子的胞内染色(intracellular cytokine staining,ICS)技术是否可以评价自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应(antibody-depend-ent cellular cytotoxicity,ADCC)以及在HCV、HIV单独感染和HCV/HIV合并感染情况下ADCC效应的变化.方法 采用流式细胞术分析NK细胞的频数、表面受体的表达;ImageStreamX MarkⅡ流式成像技术鉴定CD56brightNK细胞和CD56dimNK细胞表面CD3/CD56/CD32/CD16的单细胞表达状态;通过P815细胞抗原抗体复合物模型(P815+Ab)以及细胞内因子染色技术评价NK细胞的脱颗粒能力以及细胞因子释放能力;通过流式检测细胞内因子表达和靶细胞杀伤比较HIV、HCV、HIV/HCV慢性感染与健康对照者的NK细胞介导ADCC效应的差异.结果 本研究证实,NK细胞介导ADCC,CD107a+和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)细胞频数与CD16平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)降低呈正相关;CD56dimNK细胞高表达CD16且CD107a+和IFN-γ+细胞比例较CD56brightNK高;利用ICS法检测NK细胞CD107a和IFN-γ的表达与快速荧光法检测靶细胞裂解率呈正相关;慢性HIV感染时,NK细胞介导ADCC效应受损.结论 研究表明ICS技术可以评价NK细胞的ADCC效应.在HCV、HIV和HIV/HCV慢性感染时,NK细胞介导的ADCC效应减弱.
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白藜芦醇对人γδT细胞生长和杀伤功能的影响
目的 探讨白藜芦醇对人外周血γδT细胞生长和杀伤功能的影响.方法 用异戊烯焦磷酸法体外扩增人γδT细胞,不同浓度的白藜芦醇作用γδT细胞后,MTT法检测γδT细胞生长情况,流式细胞术检测给药前后γδT细胞杀伤功能相关标志物颗粒酶B、穿孔素和CD107a的表达.结果 人外周血单核细胞(PBMC)培养l0d后,γδT细胞比例从扩增前的3.12％增至80.46％;白藜芦醇浓度为0.2～12.5 μmol/L时能促进γδT细胞生长,其中以1.56μmol/L作用明显,使细胞增殖率高出对照组约15.90％；白藜芦醇1.56 μmol/L可上调γδT细胞杀伤功能相关标志物颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达,随着给药浓度增高,γδT增殖及其颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达逐渐降低.结论 白藜芦醇在一定浓度范围内可促进YδT细胞增殖,且增强γST细胞杀伤功能相关标志的表达,这可能是其抗肿瘤作用机制之一.
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CD244与活动性肺结核患者CD56brightNK细胞表型及功能的关系研究
目的:探索CD244与活动性肺结核患者CD56brightNK细胞表型及功能的关系.方法:用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),用流式细胞术检测活动性肺结核患者与正常对照者CD56brightNK细胞表面CD244、CD94、NKG2D表达差异,进一步检测活动性肺结核患者CD56brightNK细胞CD244与Tim3、CD27、CD62L、CCR7、CD107a、IFN-γ表达的关系.结果:不经过结核菌抗原刺激的外周血中的CD56brightNK细胞表面CD244表达在活动性肺结核患者和正常对照中并没有显著性差异;经过结核菌抗原刺激的活动性肺结核患者CD56brightNK细胞表面CD244表达显著高于正常对照者;CD56brightNK细胞表面CD94和NKG2D表达,在活动性肺结核患者与健康对照者之间无显著性差异;活动性肺结核患者CD244+CD56brightNK细胞表面Tim3+细胞显著性升高,而细胞表面CD62L显著性降低,细胞内IFN-γ显著性降低;然而CD244+CD56brightNK细胞和CD244-CD56brightNK细胞之间CD107a表达无显著性差异.结论:在活动性肺结核患者PBMCs中CD56brightNK细胞表面高表达CD244,可能与抑制受体Tim3协同抑制IFN-γ的表达,但是与NK细胞的脱颗粒作用无关.
关键词： CD56brightNK细胞 CD244 TIM3 IFN-γ CD107a -
α-Thujone增强CD3AK细胞增殖及杀伤功能
目的:研究α-Thujone对CD3AK细胞增殖及杀伤功能的影响.方法:从人外周血来源的PBNC按常规方法培养成CD3AK细胞,用不同浓度的α-Thujone处理CD3AK细胞,CCK-8法检测CD3AK细胞增殖及其对K562、SW480、HO8910三株肿瘤细胞的杀伤情况.FCM检测经α-Thujone处理后CD3+ CD8+T细胞上CD107a的表达.结果:α-Thujone能显著促进CD3AK细胞的增殖,表现出一定的浓度依赖性.α-Thujone还能促进细胞CD107a的表达和对多种肿瘤细胞的杀伤活性.结论:α-Thujone能促进CD3AK细胞增殖并增强其细胞毒性.
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膜型IL-15联合RAE-1ε增强小鼠NK细胞的杀伤活性
目的:探讨视黄酸早期转录因子1ε(retinoic acid early transcript 1ε,RAE-1ε)和膜型IL-15对小鼠NK细胞杀伤功能的影响.方法:前期研究以小鼠原B淋巴细胞株BaF3为基础构建了3株BaF3工程细胞株,即表达膜型IL-15的BaF3/mb15细胞、表达RAE -1ε的BaF3/RAE细胞和同时表达膜型IL-15和RAE-1ε的BaF3/mb15/RAE细胞.将γ射线灭活后的3株BaF3工程细胞株作为刺激细胞,分别刺激小鼠NK细胞.流式细胞术检测刺激后NK细胞表面分子的表达,胞内染色法检测NK细胞穿孔素和颗粒酶B的分泌,流式细胞术检测NK细胞对小鼠淋巴瘤YAC1细胞的杀伤活性.结果:与BaF3/mb15和BaF3/RAE细胞相比,BaF3/mb15/RAE细胞可有效上调NK细胞表面CD25、CD44、FasL和CD107a的表达,但对穿孔素和颗粒酶B的分泌没有明显刺激作用.当效靶比为20:1时,BaF3/mb15、BaF3/RAE和BaF3/mb15/RAE细胞刺激后NK细胞对靶细胞YAC1的杀伤率分别为(39.7±2.9)％、(45.3±2.3)％和(59.0±6.9)％,均高于BaF3组的(28.3±1.5)％(P＜0.01),且BaF3/mb15/RAE组高于BaF3/mb15和BaF3/RAE组(P＜0.05).结论:膜型IL-15联合RAE-1ε可促进NK细胞活化并增强NK细胞的杀伤活性.
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人外周血γδT细胞CD107a的表达变化与细胞毒活性的关系
目的:探讨人外周血γδT细胞体外诱导过程中CDl07a的表达变化及其与γδT细胞细胞毒活性的关系.方法:分离健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),加入含有IL-2和异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)的培养基,体外诱导γδT细胞.分别在第7、10、14天以流式细胞仪对培养的γδT细胞进行鉴定,并同时检测其CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达.CCK-8试剂盒检测γδT细胞对胰腺癌细胞SW-1990的杀伤效应.采用SPSS13.0软件进行spearman相关分析.结果:在培养的第7、10、14天,γδTCR阳性细胞分别为(60.31±3.84)%、(66.45±4.25)%、(70.99±4.66)%.CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达在γδT细胞培养第7～10天达到峰值后呈下降趋势,第7天与第0天相比差异有统计学意义[(80.66±4.42)%、(70.11±3.34)%、(94.26±4.25)% vs (69.02±5.04)%、(62.31±4.66)%、(53.62±3.69)%,P＜0.05].培养第7天、第10天的γδT细胞对SW-1990细胞杀伤率显著高于第14天的γδT细胞[(58.86±5.12)%、(61.53±4.69)% vs (40.31±4.83)%,P＜0.05].γδT细胞CD107a表达与穿孔素、颗粒酶B、其对SW1990细胞杀伤效应显著相关(r=0.853,r=0.785,r=0.839,均P＜0.01).结论:人外周血γδT细胞CD107a的表达与其抗肿瘤能力正相关,可能是γδT细胞细胞毒活性的一个标志.
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食管癌患者外周血MAGE-C2抗原特异性CD8+T细胞的功能及临床意义
目的:评价食管癌患者外周血恶性黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)-C2抗原特异性CD8+T细胞的功能,并分析其与临床病理参数的相关性.方法:密度梯度离心法获取130例食管癌初治患者(收集自2014年11月至2015年11月郑州大学第一附属医院胸外科)的PBMC,流式细胞术、RT-PCR方法筛选HLA-A2* 0201和MAGE-C2共阳性的患者,其PBMC培养7、14 d后加MAGE-C2(336-344)抗原肽1μg/m1、IL-2 100 μg/ml和CD3/CD28 Dynabeads 2μl处理,诱导扩增抗原特异性CD8+T细胞,流式细胞术检测CD8+T细胞表面CD107a和胞内IFN-γ的水平,并分析其与临床参数的相关性.结果:筛选出52例HLA-A2* 0201和MAGE-C2共阳性的患者,MAGE-C2(336-344)处理其PBMC后,MAGE-C2(336-344)处理组CD8+T细胞中CD107a+ IFN-γ+,CD107a+ IFN-γ-和CD107a IFN-γ+细胞的比例明显升高(P＜0.05);CDI07a的表达在早期、未发生淋巴结转移和高分化的食管癌患者明显高于晚期、发生淋巴结转移和低分化的癌症患者(P＜0.05);IFN-γ的表达在高分化的食管癌患者明显高于低分化的食管癌患者(P＜0.05).结论:成功诱导扩增MAGE-C2抗原特异性CD8+T细胞,并发现其功能与食管癌的分期和淋巴结转移相关,似可作为一种理想的免疫治疗靶点.
关键词： 食管癌 CD8+T细胞 恶性黑色素瘤相关抗原-C2 CD107a 干扰素-γ -
云芝多糖对人CIK细胞及其杀伤功能相关分子表达的影响
目的 探讨云芝多糖对人CIK细胞增殖及细胞杀伤功能相关分子表达的影响.方法 体外培养CIK细胞,不同浓度云芝多糖诱导人CIK细胞24h,CCK-8比色法检测人CIK细胞增殖,流式细胞仪测定CIK细胞表达的穿孔素、颗粒酶B和CD107a的变化.结果 不同浓度的云芝多糖可促进CIK细胞增殖,促进CIK细胞穿孔素、颗粒酶B的和CD107a的表达,25 mg/L云芝多糖作用强;但随着药物浓度的增加,CIK细胞增殖率逐渐降低,且细胞杀伤功能相关分子表达含量下降.结论 云芝多糖在低浓度下可促进CIK细胞增殖,提高CIK细胞的杀伤活性和功能.
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PBMC中CD69、CD107a表达上调在诊断迟发型药物变态反应中的意义
目的 检测药疹患者外周血单个核细胞中CD69和CD107a的表达,评价其与迟发型药物变态反应的相关性.方法 2010年5月至2011年4月采集20例药疹患者和10例健康对照者的外周血,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,按2 ×106细胞/孔种植于24孔板,给予致敏药物刺激,培养72 h后采用流式细胞术染色并检测外周血单个核细胞中CD69和CD107a分子的表达.结果 健康对照组外周血单个核细胞中CD107a阳性、CD69阳性、CD107a与CD69双阳性细胞刺激前的比例分别为(0.41±0.18)％、(0.33±0.13)％、(0.12±0.06)％,经致敏药物刺激后分别为(0.38±0.28)％、(0.35±0.12)％、(0.14±0.08)％,刺激前后无明显差异,药疹患者外周血单个核细胞中CD107a阳性、CD69阳性、CD107a与CD69双阳性细胞刺激前的比例分别为(0.45±0.25)％、(0.31±0.12)％、(0.15±0.07)％,与健康对照组无明显差异,但经致敏药物刺激后外周血单个核细胞中CD69阳性、CD107a阳性、CD107a与CD69双阳性细胞表达比例明显增高[分别为(9.01±2.91)％、(1.78±0.76)％、(0.74±0.19)％],和健康对照组、药疹未刺激组比较有统计学差异(P＜0.01),且随着致敏药物浓度的增加,CD69和CD107a的表达呈剂量依赖性上调.结论 药疹患者外周血单个核细胞经致敏药物刺激后CD69、CD107a表达增加.
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HIV感染者外周血CD8+NK细胞百分比及功能变化研究
目的 探讨HIV感染者外周血中CD8+NK细胞百分比的变化与表达CD107a的能力.方法 选取未经高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy,HAART)治疗的HIV慢性感染者,感染者按照CD4叩细胞数量分成高、低2组,用流式细胞仪检测其外周CD8+NK细胞百分比的变化情况和CD 107a的表达量.结果 HIV感染者外周血中CD8+NK细胞的百分比明显低于正常人(P=0.011 1),CD8+NK细胞的百分比与病毒载量成明显的负相关关系(r=-0.541 9,P=0.045 3).K562细胞系刺激后,CD4+T细胞高组CD107a的表达量明显增高.结论 具有抗病毒作用的CD8+NK细胞在HIV感染后百分比下降;CD8+NK细胞水平高以及功能较强者HIV病毒水平相对降低,CD4+T细胞数量相对高.
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HIV感染者自然杀伤细胞功能研究
目的 研究人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染后NK细胞及各亚群分泌IFN-γ,表达CD107a和释放颗粒酶B的功能变化.方法 选取未经高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy,HAART)治疗的HⅣ慢性感染者,按照CD4+T细胞数量分成高、低2组,用流式细胞仪检测其外周血NK细胞及各亚群IFN-γ、CD107a和颗粒酶B的表达情况.结果 CD4+T细胞高组NK细胞及各亚群分泌IFN-γ和CD107a的水平较HIV抗体阴性对照组高(P=0.034,P=0.045),颗粒酶B释放百分比高于HIV抗体阴性对照组和CD4+T细胞低组(P=0.004,P=0.028),其IFN-γ+ NK细胞百分比与病毒载量呈显著负相关(r=-0.382,P=0.015).结论 NK细胞功能增强可能是控制HIV感染疾病进程的因素之一.
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NK细胞与初发2型糖尿病患者的关系
2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mel itus，T2DM）是一种常见的内分泌代谢疾病，具有遗传易感性，多在环境因素的触发下发病。研究发现，T2DM现已成为继肿瘤和心脑血管病之后，威胁人类健康和生命的第三大非传染性疾病。但是目前为止，关于T2DM的具体发病机制目前还不明确。有研究提出T2DM的发病机制与长期慢性炎症有关，这些炎症来自于天然免疫系统的异常[1,2]，但是具体机制目前还不明了。本课题研究NK细胞与新发2型糖尿病的关系。
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自然杀伤细胞在恶性血液肿瘤中作用的研究进展
自然杀伤(NK)细胞是机体天然免疫的重要承担者,与感染性、免疫性、肿瘤性疾病关系重大.NK细胞与恶性血液肿瘤的关系日益受到国内外学者的关注,深入探讨NK细胞功能、活性及其与恶性血液肿瘤的关系具有重要意义.
