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梅毒螺旋体膜蛋白 Tpp17体外活化血管内皮细胞的实验研究
目的：研究梅毒螺旋体重组蛋白Tpp17体外对人脐静脉内皮细胞（ HUVEC ）的活化作用，探讨膜蛋白Tpp17在梅毒免疫学发病机制中的作用。方法将采用基因工程技术重组合成的梅毒螺旋体膜蛋白Tpp17刺激HUVEC， ELISA测培养上清中细胞因子TNF-α、MCP-1、ICAM-1及E-selectin的水平，荧光定量聚合酶链反应测HUVEC中TNF-α、MCP-1、ICAM-1及E-selectin mRNA的转录水平；将重组蛋白Tpp17预处理的HUVEC与Calcein-AM标记的THP-1细胞共培养，荧光倒置显微镜下观察HUVEC与THP-1细胞的黏附情况；将HUVEC接种于transwell小室的下室，重组蛋白Tpp17处理后，Calcein-AM标记的THP-1细胞接种于上室，荧光倒置显微镜观察下并计数THP-1细胞的迁移率。结果梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp17可上调HUVEC细胞因子TNF-α、MCP-1、ICAM-1及E-se-lectin的表达水平，提高其对THP-1细胞的趋化和黏附能力，与空白组比较，差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp17可体外活化HUVEC，提高HUVEC对THP-1细胞的趋化和黏附能力，可能在梅毒的免疫病理中起重要作用。
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LPS对THP-1细胞sCD14和mCD14表达的影响
目的 观察不同浓度脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞(human acute monocytic leukemia cell line)不同时间对可溶性CD14(soluble CD14,sCD14)和膜CD14(Membrane CD14,mCD14)表达的影响及sCD14、mCD14表达之间的关系.方法 不同浓度LPS(0、0.1、1.0、10、50ng/ml)刺激经佛波酯(PMA)诱导的THP-1细胞不同时间(0.5、1、3、5、8h),用酶联免疫吸附法检测sCD14的量,流式细胞术检测mCD14的量.结果 LPS浓度为0ng/ml时,sCD14的表达与时间呈正相关(r=0.915,P=0.029),8h达高值(1044.39±12.21 pg/ml),mCD14的表达与时间呈正相关(r=0.945,P=0.015),8h达高值(4.23％±2.11％),且随着时间的延长,sCD14的表达与mCD14的表达呈正相关(r=0.969,P=0.006);LPS浓度为0.1ng/ml时,随着时间的延长,sCD14的表达与mCD14的表达呈正相关(r=0.944,P=0.016);当LPS刺激细胞0.5h时,sCD14的表达与mCD14的表达呈负相关(r=-0.839,P=0.037);1h时,mCD14的表达与LPS浓度呈正相关(r=0.839,P=0.037),100ng/ml时达高值(3.24％±1.95％).结论 未经LPS刺激的THP-1细胞可以表达sCD14及mCD14;LPS的浓度及刺激细胞的时间促进sCD14和mCD14表达.
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拮抗Toll样受体4对于溶血磷脂酸诱导的THP-1细胞Toll样受体4／核因子-κB信号通路的影响
目的：通过拮抗Toll样受体4（TLR4）观察其对于溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）诱导的人单核细胞株THP-1细胞的核因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）p65表达的影响以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的变化。方法取THP-1细胞，LPA以不同浓度水平（0～10μmol·L－1）刺激4 h，或1μmol·L－1浓度刺激不同时间（0～8 h），酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞因子TNF-α，随后在LPA （1μmol·L－1）条件下分别予不同浓度TLR4单克隆抗体（TLR4 mAb）（5，20，30 mg·L－1）干预THP-1细胞，观察其对LPA诱导的核蛋白NF-κB p65表达及TNF-α分泌水平的影响。结果 LPA以剂量依赖方式促进TNF-α分泌，并可诱导THP-1细胞NF-κB p65活化，予TLR4 mAb阻断TLR4后，可显著抑制NF-κB p65表达及TNF-α分泌。结论 LPA可经由Toll4／NF-κB信号途径激活单核细胞，终引起TNF-α等炎性因子的分泌，参与动脉粥样硬化进程。
关键词： 溶血磷脂酸 THP-1 细胞 Toll样 受体4单克隆抗体核因子-κB -
姜黄挥发油对 THP-1细胞增殖及凋亡的影响
目的：研究姜黄挥发油（TVO）对急性单核细胞白血病 THP-1细胞株增殖及凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法不同浓度（5～80 mg ／L）TVO 体外作用于 THP-1细胞。应用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖抑制率；经吉姆萨染色，倒置显微镜观察细胞形态变化；DNA 片段化测细胞凋亡；流式细胞仪检测细胞凋亡及周期；比色法测Caspase-3酶活性。结果TVO 具有抑制 THP-1细胞株增殖的作用，并表现出时间－剂量依赖性。同时，TVO 能诱导 THP-1细胞凋亡，呈现剂量依赖性，镜下见典型细胞凋亡形态，Caspase-3酶活性随药物浓度增加而增强。经TVO 作用后的细胞周期被阻滞在 G1期，G2／M 期及 S 期细胞数减少。结论TVO 对 THP-1细胞株具有增殖抑制及促凋亡的作用，其机制可能是使细胞周期阻滞在 G1期，且激活了细胞凋亡途径中关键酶 Caspase-3活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖与分化。
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靶向沉默巨噬细胞中 Mcl-1基因 shRNA表达质粒的构建与鉴定
目的：研究髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)基因在小鼠巨噬细胞 Raw264.7和人巨噬细胞THP-1中的表达情况,筛选出表达含量高的细胞株作为实验用细胞,根据筛选的结果构建靶向小鼠 Mcl-1基因的短发夹 RNA(shRNA)真核表达质粒进行转染,后筛选出沉默 Mcl-1基因效果明显的 shRNA 表达质粒。方法利用半定量 RT-PCR 和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分别检测两种巨噬细胞中 Mcl-1mRNA 和蛋白表达情况。采用小分子干扰 RNA(siRNA)软件设计3个针对 Mcl-1基因不同位点的 shRNA 片段,由公司构建携带此 shRNA 片段的真核表达质粒(Mcl-1 shRNA1-3),然后通过脂质体将真核表达质粒载体转染到小鼠巨噬细胞株 Raw264.7中,24、48 h 后通过倒置荧光显微镜观察转染效果,并分别采用实时定量 PCR 和 Western blot 检测 Mcl-1 mRNA 和蛋白表达情况。结果小鼠巨噬细胞 Raw264.7中 Mcl-1的 mRNA 及蛋白质的表达显著高于人巨噬细胞,差异有统计学意义(P <0.05)；构建的 shRNA 表达载体在24、48 h 均能降低 Raw264.7细胞内 mcl-1 mRNA 和蛋白水平,尤其在48 h 沉默效果为明显；转染48 h 后与正常组、脂质体组和阴性对照组相比,差异有统计学意义(P <0.05)；与 Mcl-1 shR-NA1和 Mcl-1 shRNA2相比,Mcl-1 shRNA3对 Mcl-1 mRNA 和蛋白的沉默作用强。结论成功筛选出了实验所用细胞 Raw264.7及对小鼠巨噬细胞 Raw264.7内 Mcl-1具有明显沉默效果的靶向 Mcl-1 shRNA3真核表达质粒。
