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杀菌性/通透性增加蛋白对大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤的保护作用研究
目的：通过观察预先使用杀菌性/通透性增加蛋白( BPI )的SD大鼠移植肝脏的转氨酶水平、TNF-α、白介素1(IL-1)水平的变化,探讨BPI预处理是否具有肝脏缺血再灌注损伤保护作用及其可能的相关机制。方法雄性SD大鼠96只,随机分为生理盐水对照组和 BPI组,Kamada’s袖套法经行肝移植。对照组切取供肝前10min 经腰静脉注射NS1．5mL；BPI组切取供肝前10min经腰静脉注射BPI(100μg/mL)1．5 mL。于再灌注后0h、3h及6h,酶联免疫吸附试验测定血清TNF-α及IL-1的含量；全自动血清自动生物化学仪检测血清转氨酶；光镜切片检测肝脏组织学。结果再灌注后0h,AST、ALT、TNF-α及IL-1含量两组间差异无统计学意义(P>0.05)；再灌注后3、6h,NS组及BPI组各项指标水平逐渐升高,但BPI组各项指标水平明显低于NS组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 BPI对大鼠移植肝脏的缺血再灌注损伤有明显抑制作用。
关键词： 杀菌性/通透性增加蛋白 缺血再灌注损伤 肝移植 LPS -
LPS的直接诱导对肺微血管内皮细胞内NF-κB的影响
目的:探讨LPS的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞(PMVEC)核因子kB(NF-κ B)的影响.方法:100ng/ml LPS刺激PMVEC 0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h或10ngg/ml、50ng/ml、100ng/mlLPS刺激1h,凝胶电泳迁移率试验检测NF-κ B的活化,免疫细胞化学观察其亚基p50、p65的核转位.并通过加入活化阻断剂TPCK观察对诱导的NF-κ B活化的影响.结果:LPS的刺激迅速诱导p50、p65亚基核转位,活化NF-κ B,1h达到高峰,且呈剂量依赖关系,后逐渐下降.PDTC能显著抑制其活化,P＜0.01.结论:LPS的直接刺激诱导NF-κ B的活化,这可能是IPS诱导炎症反应的一个重要环节.
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db/db2型糖尿病小鼠的肠道、门脉血中LPS水平与血糖的相关性分析
目的:探讨LPS水平与2型糖尿病血糖相关性.方法:采用db/db 2型糖尿病小鼠db/db组和对照组db/m,收集门脉血、结肠组织并取匀浆液,用酶联免疫法(ELISA)测定肠道、门脉血中脂多糖的水平；用血糖仪测血糖值.结果:db/db模型组与db/m组相比,肠道LPS水平高(P＜0.05),门脉血中LPS水平高(P＜0.05),肠道比门脉血中LPS水平高(P＜0.05),FPG是高的(P＜0.05),结肠、门脉血中LPS分别与血糖成正相关(r=0.72,P＜0.01；r=0.71,P＜0.01).结论:LPS水平与2型糖尿病的血糖有关,可为糖尿病的机制的研究提供有力的依据.
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PEPT2 mRNA在内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织表达的研究(摘要)
目的:研究PEPT2(Peptide transporter 2)mRNA在急性肺损伤大鼠肺组织表达.方法:(1)实验动物与分组:随机将健康SD大鼠60只[200±20)g,雌雄各半]分为3组:①正常对照组(n=12),不作任何处理;②生理盐水组(n=12),气管内滴入0.2mL生理盐水,2h后放血处死,检测各项指标;③LPS组(n=36),气管内滴入0.5 mg/kg LPS(E.coli O111:B4,Sigma公司),溶于0.2mL生理盐水中,分别于给药后2、4、8 h放血处死,观测各项指标.
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丙酮酸乙酯抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞HMGB1的表达
目的:探讨丙酮酸乙酯(EP)抑制脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞高迁移族率蛋白B1 (HMGB1)的表达及分子机制.方法:培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7,分为LPS( 100 ng/mL)组及LPS( 100 ng/mL)+EP(5 mmol/L)组,刺激后0、6、12、18、24、30、36 h提取总RNA及胞质胞核蛋白,用RT-PCR法测细胞培养液中HMGB1 mRNA 表达；用Western blot测胞质和胞核HMGB1蛋白含量；用ELISA法测培养上清中HMGB1、TNF-α和IL-6的含量；用免疫细胞化学共聚焦显微镜观察细胞内HMGB1的转位分布.结果:LPS+EP组HMGB1 mRNA基因表达于24、36、48 h比LPS组明显减少；Western blot结果示,LPS+ EP组HMGB1蛋白含量胞质明显低于LPS组,而胞核明显高于LPS组；ELISA结果示,LPS+EP组细胞培养上清中HMGB1、TNF-α和IL-6的含量明显低于LPS组；免疫荧光、激光共聚焦显微镜结果示,LPS+ EP组细胞质内绿色荧光染色明显弱于LPS组,细胞核内绿色荧光染色明显强于LPS组.结论:EP能有效抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1的表达和释放.
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γ射线与LPS作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7的生物学效应
目的: 研究γ射线与LPS协同激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的效应机制, 以及γ射线与LPS诱导钙结合蛋白S100A8的表达及意义.方法: 相差显微镜观察细胞形态; 流式细胞计数方法检测细胞周期及活性氧介质(ROI)水平; Griess颜色反应测定细胞NO水平; 实时定量RT-PCR方法检测细胞S100A8 mRNA水平的表达.结果: γ射线与LPS作用于RAW264.7细胞引起细胞形态改变, 部分细胞出现非整倍性, 少量细胞出现凋亡, 胞内ROI水平、 NO水平明显升高, S100A8 分子mRNA水平明显升高, 而且这些效应几乎都比?射线或LPS单因素的作用要强.结论: γ射线与LPS协同诱导巨噬细胞激活是细胞周期改变、信使分子水平变化、炎症因子如S100A8的表达等多方面生物效应的综合结果, 其中S100A8基因的表达与巨噬细胞功能状态密切相关.
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NF-κB在大鼠急性肺损伤模型肺组织中的表达及N-乙酰半胱氨酸的影响
目的: 检测NF-κB在LPS诱导的急性肺损伤(ALI)肺组织中的表达, 以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对ALI的抑制作用.方法: 采用免疫组化染色(ABC法)和Western blot, 检测NF-κB在急性肺损伤大鼠气道和肺组织中的表达, 以及NAC干预后活性NF-κB表达的变化.结果: 正常对照组大鼠气道黏膜上皮和肺间质中, 仅见少量散在的NF-κB核阳性细胞; 而LPS诱导ALI后, 气道黏膜、肺间质、肺泡腔及血管内皮细胞中NF-κB核阳性的细胞明显增多(P<0.01).NF-κB核阳性反应细胞主要为气道黏膜上皮细胞、浸润的炎症细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞.NAC治疗组NF-κB核阳性细胞较LPS诱导的ALI组及对照组均明显减少(P<0.01).Western blot的结果显示, LPS诱导的ALI后不同时间点, NF-κB的表达不同, 于急性肺损伤3 h达高峰.各时间点NF-κB的表达均较正常对照组高.结论: LPS诱发的大鼠急性肺损伤的气道和肺组织内NF-κB的表达增加, 肺组织内的多数细胞参与了NF-κB的激活.NAC可通过抑制NF-κB的激活减轻急性肺损伤的炎症程度.
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IgG Fab-BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达
目的构建抗抗LPS Fab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达.方法通过RT-PCR,获得广谱抗LPS mAb C3A2(IgG)的Fd和完整轻链(LC)cDNA片段.在分别构建了pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPI N端抗LPS活性中心的180bp DNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白(FB)真核表达载体.将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGH polyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞.结果序列测定表明,重组质粒构建正确.pcDNA3-FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mRNA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗κ轻链和抗BPI抗体反应的蛋白区带的M,均为60 000左右.交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性.结论成功地在CHO细胞中表达出了抗LPS Fab-BPI(FB)融合蛋白.FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂.
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辐射对小鼠免疫系统损伤远期影响的研究
目的:探讨4Gy 137Csγ射线一次性全身照射小鼠免疫细胞对LPS刺激反应性的远期影响.方法:将C57BL/6实验小鼠分为假照射组和照射组,照射组给予4 Gy照射.照射10周后小鼠按组别分别提前24 h和1h腹腔注射LPS( 20mg/kg),对照组注射生理盐水.取外周血进行白细胞计数及CD4、CD8、B220细胞比例检测,脾脏与胸腺称重,计算脏器指数.冲洗单侧股骨进行有核细胞计数.结果:与假照射对照组小鼠比较,照射对照组小鼠的CD4,CD8细胞比例和脾脏、胸腺指数显著升高,B细胞比例显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05).LPS刺激1h后,照射组小鼠的CD4细胞较假照射组小鼠显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).LPS24 h后,与假照射组小鼠相比,照射组小鼠CD8细胞比例显著降低,胸腺指数显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:小鼠4 Gy照射10周后,免疫系统尚未完全恢复；在接受LPS刺激后,两组小鼠反应也有差异.辐射对小鼠免疫系统损伤的远期影响有待进一步研究.
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Toll样受体4和巨噬细胞移动抑制因子对血管内皮细胞生物活性的影响
目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对ECV304内皮细胞增殖、黏附及炎症因子水平的影响.方法:ECV304细胞经TLR4 MIF单克隆抗体(mAb)和脂多糖(LPS)处理后,通过~3H-TdR掺入实验、黏附实验和放射免疫分析研究细胞增殖、黏附和细胞因子水平.结果:LPS(10 mg/L)明显促进ECV304细胞TLR4的表达,而抗MIF mAb(10、50 mg/L)明显抑制其表达.抗MIF(50 mg/L)和抗TLR4mAb(1 mg/L)明显抑制了ECV304细胞的增殖,而LPS(10 mg/L)明显促进增殖.抗MIF mAb明显抑制了人外周血淋巴细胞对ECV304细胞的黏附,而LPS和抗TLR4 mAb对黏附无显著影响.抗MIF、抗TLR4 mAb明显抑制ECV304细胞TNFα的分泌,并呈剂量依赖,而LPS作用相反.与对照组相比,LPS(1 mg/L,48 h)可以促进ECV304细胞IL-8的分泌,抗MIF mAb(50 mg/L,48 h)可以明显抑制IL-8的分泌(P＜0.05).但是抗TLR4 mAb(1 mg/L)对ECV304细胞IL-8的分泌无明显影响.结论:LPS、抗TLR4及抗MIF mAb对血管内皮细胞TLR4表达及活性有显著影响.
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可溶性CD14在酵母细胞中的分泌表达与LPS结合活性分析
目的:在酵母系统中实现可溶性CD14基因的分泌表达,并进行LPS结合活性分析.方法:将可溶性CD14基因克隆入表达载体pPIC9K,用SacⅠ将重组质粒线形化,电转化Pichia pastoris GS115细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达.结果:经过诱导表达条件的优化,sCD14在pH 6.5培养基BMMY中实现了分泌表达.免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体.经流式细胞仪检测,重组产物具有结合细菌内毒素(LPS)的生物学活性.结论:具有良好LPS结合活性的重组可溶性CD14分子可以用于进一步的结构与功能研究.
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痢疾菌毒力表型与抗原表达的关系
目的分析研究本室保存或构建的各类痢疾菌毒株、减毒突变株、菌苗株的毒力及其生物表型的相互关系,探讨与致病有关的成分,为改进现有菌苗和构建新型菌苗提供参考依据.方法采用刚果红结合试验、接触性溶血试验、HeLa细胞入侵试验及豚鼠角结合膜炎试验,对不同痢疾菌的毒力表型进行检测,并对大质粒及其侵袭相关的基因(4.1kb)进行遗传背景分析.用BA-immunoblot法,对痢疾菌和侵袭性大肠杆菌等进行毒力相关抗原的分析.结果有侵袭毒力的痢疾菌株均与刚果红染料结合、有接触性溶血活性,可侵入HeLa细胞,豚鼠角结合膜炎试验阳性,并都含有大质粒(120～140MD),与4.1kb侵袭探针杂交也均呈阳性反应;而无毒力的痢疾菌株上述生物表型均为阴性.有毒痢疾菌和侵袭性大肠菌均表达4种主要毒力相关抗原Ipa(A,B,C,D),而无毒株不表达这些抗原.痢疾菌的毒力不仅与Ipa有关,而且还与LPS抗原有关.结论细菌的毒力与生物表型密切相关.并且Ipa与LPS这两类抗原均表达时细菌才有毒力.
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LPS直接诱导对肺微血管内皮细胞IL-8表达的影响及通过核因子κB调控机理的研究
目的探讨LPS的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞(PMVEC)IL-8表达的影响及通过核因子κB(NF-κB)的调控机理.方法以100ng/ml LPS刺激PMVEC 0,0.5,1,2,4,6,8 h或1,10,100ng/mlLPS刺激1h或6h为检测时相点,ELISA、原位杂交试验分别检测的培养液上清中分泌的IL-8及PMVEC内IL-8mRNA的表达;凝胶电泳迁移率分析(EMSA)检测NF-κB的活化;并观察NF-κB活化抑制对IL-8表达的影响.结果 LPS能显著促进PMVEC表达IL-8,包括促进IL-8mRNA的表达及IL8的分泌,在时间上mRNA的表达先于IL-8分泌;且LPS的直接诱导能迅速活化NF-κB,1h达到高峰,后逐渐下降.PDTC能显著抑制NF-κB的活化及IL-8的表达(P＜0.01).结论表明细菌致病因子LPS的直接诱导确能通过促进NF-κB的活化,从而启动IL-8的高效表达和分泌,为多形核中性粒细胞(PMN)的迁移提供必需的物质条件,导致肺损伤.
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LPS诱导宫颈癌上皮间质转化的作用
目的:探讨LPS在宫颈癌细胞株Hela细胞增殖和上皮间质转化中的作用.方法:体外培养Hela细胞,以LPS(10μg/ml)诱导后,利用MTT法检测细胞的增殖情况.qPCR检测上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin的RNA水平上的表达.Western blot检测上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin的蛋白水平上的表达.Transwell检测LPS对Hela细胞迁移能力的影响.结果:在LPS诱导后能够明显的促进Hela细胞的增殖.E-cadherin在RNA和蛋白水平上都明显下降,N-cadherin、Vimentin在RNA和蛋白水平上都明显升高;LPS诱导后,明显促进Hela细胞的迁移能力.结论:LPS能够诱导宫颈癌细胞株Hela细胞的增殖和上皮间质转化.
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上调自噬抑制LPS诱导的小胶质细胞死亡
目的:观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理后,N9细胞自噬水平的变化,并探究LPS刺激下不同自噬水平对N9细胞的损伤和存活的影响.方法:体外培养N9细胞,给予24 h LPS处理,免疫荧光(IF)检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)的表达,Western Blot检测LC3与Beclin1的表达.LPS处理后分别使用自噬诱导剂雷帕霉素(RAP)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)调节N9细胞自噬水平,Western Blot检测不同处理组自噬标记蛋白LC3、Beclin1的表达;使用乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase)试剂盒、Cell Count Kit(CCK8)试剂盒检测细胞损伤及存活.结果:(1)LPS刺激造成N9细胞损伤,LDH释放量(113.6％±3.2％)较对照组(100.0％±3.9％)显著增加(P＜0.01),存活细胞数(69.8％±2.1％)较对照组(100.0％±3.9％)显著减少(P＜0.001);(2)与对照组相比,LPS显著上调N9细胞LC3以及Beclin1水平(P＜0.05)并同时上调LAMP2水平;(3) RAP上调LPS处理后N9细胞的自噬水平并减少小胶质细胞损伤(100.8％±2.3％),促进细胞存活(87.4％±5.7％)(P＜0.05).3-MA则抑制LPS处理后N9细胞自噬水平并降低细胞存活(60.6％±2.9％),而细胞损伤(123.2％±3.7％)与LPS组相比未见统计学差异;(4)RAP与3-MA分别促进或抑制LPS诱导的N9细胞自噬相关蛋白的表达(P＜0.05).结论:上调自噬水平减少LPS刺激诱导的N9细胞损伤,促进细胞存活.
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海马内注射LPS后诱导大鼠脑内BACE-1的表达变化
目的:探讨脑内注射内毒素脂多糖(lipoolysaccharide,LPS)诱导的大鼠慢性神经炎症脑内β-位点淀粉蛋白剪切酶-1(β-site amyloid precursor protein cleavage enzyme-1,BACE-1)的表达变化.方法:依赖立体定位技术,在成年SD雄性大鼠右侧海马内注入LPS,动物存活15 d.运用免疫组织化学方法检测大鼠脑内BACE-1,β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)以及β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)等阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)相关蛋白的表达变化;采用免疫荧光双重标记技术,观察BACE-1在大鼠脑内的表达情况和定位分布.结果:在正常哺乳动物的大脑内,BACE-1主要表达在海马苔藓纤维和嗅球的嗅小球层,脑皮质内则表现为弱而弥散的神经毡反应性.本研究结果显示:LPS注射对侧大脑半球中BACE-1表现出上述正常的表达模式.然而,与注射对侧相比,LPS处理的大鼠注射侧大脑的皮质和海马区域均有BACE-1的位点特异性的表达上调,尤其在注射的针道周围明显,同时伴有APP和Aβ的表达增加.免疫荧光双标结果显示:上调的BACE-1定位于失营养性轴突末梢.结论:LPS诱导的大鼠神经炎症脑内,BACE-1表达上调,且上调的BACE-1主要定位于轴突末梢,高表达的BACE-1可能对AD的发生具有促进作用.
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帕金森病动物模型神经炎症反应与损伤的研究进展
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的慢性神经元退化性疾病.目前,PD的发病机制尚不清楚,为更好地理解其发病机制,我们通过建立PD的多种动物模型来模拟PD病的发病过程,为PD发病机制的研究提供实验依据.近年来有报道小胶质细胞是脑组织中主要的免疫细胞,在中枢神经系统免疫反应中起重要作用.小胶质细胞静息状态下对机体起到一定保护作用,但其长期慢性激活有神经毒性,对机体会造成损伤.
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白藜芦醇减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤并抑制TLR4/NF-κB活化
目的:探究白藜芦醇(RES)对脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜细胞(hPDLCs)损伤的保护作用.方法:体外培养并鉴定hPDLCs,将培养的hPDLCs随机分为5组:对照组、LPS(10 μg/ml)+RES(0、30、60、90tμmol/L)组,MTT法检测各组细胞增殖能力,ELISA检测各组细胞分泌TNF-α/IL-6水平,PCR和Western blot检测各组细胞TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达.结果:分离培养的hPDLCs抗波丝蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性.与对照组比,LPS处理后细胞增殖能力明显降低,细胞分泌TNF-α/IL-6水平和TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达明显增加;30～90 μmol/L白藜芦醇预处理后,细胞增殖能力增加(P＜0.05),细胞分泌TNF-α/IL-6水平、TLR4/NF-κB mRNA以及蛋白表达则下调(P＜0.05),均呈现一定的浓度依赖性.结论:白藜芦醇可抑制TLR4/NF-κB活化并减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤.
关键词： 白藜芦醇 LPS 人牙周膜细胞(hPDLCs) TLR4 NF-κB -
LPS刺激牙龈成纤维细胞IL-6、IL-8的产生和膜表面受体CD14的表达
目的:观察牙龈卟啉菌和中间普氏菌LPS刺激人牙龈成纤维细胞合成IL-6、IL-8的能力,并了解LPS是否通过细胞表面膜受体mCD14介导信号传导.方法:4种浓度的LPS在不同时间段,分别作用于体外培养的人牙龈成纤维细胞.采用ELISA检测IL-6、IL-8含量的变化,同时利用逆转录聚合酶链反应,进一步观察IL-6、 IL-8、 CD14在 mRNA水平的表达特征.结果:ELISA和RT-PCR的反应结果证实,受LPS的刺激,细胞合成和分泌细胞因子IL-6、IL-8的能力明显增强,但未检测到细胞表面膜受体mCD14 mRNA的表达.结论:LPS作用于牙龈成纤维细胞合成和分泌细胞因子没有通过膜受体mCD14的介导.
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IL-6在牙周炎中的作用及其调控因素
IL-6是一种多功能的细胞因子,与牙周炎的发生发展有着密切的关系.在牙周炎中,IL-6的产生和作用受到多种因素的调控,如LPS、IL-1β、IL-10,一些全身性的疾病也影响了IL-6的作用,他们通过各自的信号传导途径诱导或抑制IL-6的产生.
