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生物技术药物中宿主DNA残留Q-PCR检测法的方法验证
自20世纪50年代，用于生产生物技术药物的细胞基质一直因其安全性而备受关注，生产用基质细胞经历了从原代细胞，二倍体细胞到传代细胞的发展历程，人们对其潜在风险的认识也在不断变化。虽然，至今没有因为生物制品中 DNA残留量而引发不良反应或安全事故，但其用量随着临床治疗的需求越来越大，需要长期反复用药的生物制品也越来越多，同时，疫苗的使用者为健康人群，这些都使得药品监管部门更加重视生物技术产品的安全性，其中 DNA残留量的质量控制一直是人们关注的热点。几十年来对于残余 DNA问题的争论一直在继续，有的观点认为应将残余 DNA作为一种重要危险因素[1]，也有人倾向于将残余 DNA作为一般杂质控制。各国研究机构围绕着残余 DNA问题都做了大量的工作，国内外也有很多有关细胞基质及残余 DNA的文献和技术指南发表[2-4]。但根据现有研究结果，现在认为应将其视为一般杂质，并控制其在生物制品中的含量达到纯化工艺可控制的低量。
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重组单克隆抗体的纯化研究
重组单克隆抗体是新一代生物工程技术产品，其通过特定的靶点发挥药效[1]。随着大规模哺乳动物细胞培养技术的发展，工业化细胞培养液体积可达1万升以上，抗体表达量可达5 g/L以上，极大地加重了重组单抗下游纯化的压力[2-3]，下游纯化成为限制重组单抗工业化扩大的主要因素[4-6]。重组单抗杂质控制浓度指标见表1，这些指标必须通过离心、过滤和色谱层析纯化后控制在一定浓度以下[7-10]。重组抗体的纯化一般可以分为细胞培养液澄清、抗体捕获、抗体精制纯化、病毒灭活和纯化工艺的放大等流程。
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浅谈欧洲药典对抗生素杂质控制的新要求
欧洲药品质量管理局(EDQM)于2006年9月21日～22日在法国Strasbourg欧洲议会本部召开了"关于欧洲药典对抗生素和合成多肽杂质控制要求"的国际研讨会,会议就抗生素杂质控制审评法规、药典标准和生产企业如何考虑制订标准等方面进行了研讨.
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美索巴莫杂质控制的研究
目的 结合生产工艺及所用物料,分析美索巴莫的杂质谱,并对杂质进行控制.方法 采用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)分别对美索巴莫的有机杂质、挥发性杂质进行测定.结果 有机杂质1、2、4在1～8 μg·mL-1内呈现良好的线性关系(r ＞0.999 3),回收率分别为101.6％(RSD为3.4％)、104.9％(RSD为2.0％)、106.3％(RSD为3.3％);挥发性杂质甲醇、乙酸乙酯、碳酸二甲酯与甲苯相邻峰间的分离度及检测灵敏度均符合要求.结论 HPLC、GC简便、快速、结果准确可靠,可用于美索巴莫的杂质控制.
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注射用哌拉西林钠舒巴坦钠中高分子聚合物加速实验考察
控制β-内酰胺抗生素中聚合物的含量是减少临床中过敏反应的有效措施［1］。高分子聚合物是指药品中比药物分子本身的相对分子质量更大的杂质，其相对分子质量一般在1000～5000。β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质按其来源通常可分为2类：外源性杂质和内源性杂质。外源性杂质一般来源于发酵工艺，内源性杂质是指抗菌药物的自身聚合产物。随着生产工艺的不断改进和提高，目前产品中的外源性杂质已日趋减少。故对内源性聚合物的控制是当前β-内酰胺类抗生素高分子杂质控制的热点［2］。本品中所含哌拉西林钠为半合成抗生素，高分子物质主要为哌拉西林内源性高分子聚合物。
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国际注册中抗生素杂质控制指南介绍
对药品中的杂质进行分析和控制是确保药品安全使用,保护患者利益的重要问题.在药品研发、药品生产和药品国际注册中,对于杂质分析和控制日益成为困扰制药企业的难点、热点和关键点.在已经颁布的ICH关于杂质指南和FDA关于杂质的指南中,都没有涉及抗生素药品中如何控制杂质的问题.2010年7月,EMA发布了
,重点阐述了欧盟对于如何控制抗生素类药品杂质问题的观点.为了帮助中国制药企业更好的理解和应用这个指南,促进抗生素药品杂质控制的工作,作者对这个指南进行了编译. -
化学药品标准中杂质控制及其限度的建立
药品质量控制的关键之一是进行药物杂质控制.该文介绍了ICH"人用药品注册技术要求国际协调会")有关技术文件对于药物杂质控制的具体规定,并举例比较了各主要国际中药典收载化学药品标准中杂质控制限度的制定与ICH的差距,提出了进行药物杂质控制的标准要求、限度设置的依据,特别介绍了生化药品目前中国药典收载品种杂质控制的现状.鉴于仪器分析的局限,有色杂质控制未被重视,是目前药物杂质控制中的薄弱环节,探讨了利用溶液颜色检查法进行有色杂质控制的必要性和需进一步改进检查方法的原因.
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口服青霉素V钾片在我院的临床观察
青霉素V钾片是国际上使用极其广泛的一种常用口服抗生素,临床上主要用于革兰氏阳性菌感染.它易溶于水、耐酸、口服后不易被胃酸破坏.与注射用青霉素G相比,其高分子杂质控制在限量以内(小于0.2克).因此,无青霉素过敏史和无严重过敏体质的患者可不必做皮试,口服安全方便.现对我院使用口服青霉素V钾片的80例患者进行了安全性及疗效的观察,其中主要是过敏性的观察,现报告如下.
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离子色谱法测定丁二磺酸腺苷蛋氨酸中的丁二磺酸
目的 采用离子色谱法测定丁二磺酸腺苷蛋氨酸原料药中丁二磺酸的含量.方法 采用Dionex ICS 5000离子色谱仪,用Ionpac(R) AS14(250 mm ×4 mm)阴离子交换色谱柱(分析柱),流动相为3.5 mmoL· L-无水碳酸钠溶液-1.0 mmoL· L-1碳酸氢钠溶液,流速2.0 mL· min-,电导检测器,进样量25 μL.结果 丁二磺酸0.037 ～ 558 μg· mL-1与峰面积的线性关系良好(r=0.9996),平均回收率为99.9％,RSD=0.61％ (n =9),检出限为0.3 ng.结论 所用方法可准确测定丁二磺酸腺苷蛋氨酸中丁二磺酸的含量,可有效控制其质量.
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阿奇霉素颗粒剂中常用辅料对其HPLC有关物质分析方法的影响
目的 通过对阿奇霉素颗粒剂中常用辅料的分析,考察其对法定HPLC法分析颗粒剂中阿奇霉素杂质的影响.方法 采用中国药典2010年版二部方法,HPLC-DAD检测分析各辅料的色谱、紫外光谱.结果 在检测波长210nm下,颗粒处方中的填充剂在色谱检测范围内无吸收峰;崩解剂、表面活性剂、助流剂和甜昧剂出峰位置的相对保留时间均小于0.15,在中国药典2010版规定的辅料峰出峰范围内;矫味剂如苹果香精、椰子香精虽与阿奇霉素GX(EP-H)的保留时间较接近,但其紫外光谱存在明显区别,苹果香精紫外曲线的大吸收峰为223.4nm,椰子香精紫外曲线的大吸收峰为199.8、276.8和321.2nm,而阿奇霉素GX呈阿奇霉素的典型吸收曲线,为末端吸收.结论 国产阿奇霉素颗粒剂处方添加的诸辅料不影响法定HPLC法对阿奇霉素杂质的检查.
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单唾液酸四己糖神经节苷脂钠杂质检查及含量测定方法的研究
目的:采用高效液相色谱法对单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(GM1)进行含量测定及杂质控制.方法:色谱柱为Lichro-sorb NH2柱.流动相:溶液A:5 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(pH 5.6)-乙腈(17:83),溶液B:20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(pH 5.6)-乙腈(50:50);梯度洗脱:A(0→7 min)-7→60 min→A-B(66:34)-60→80 min→A-B(36:64);检测波长:205 nm;流速:1.0 mL·min-1;进样量:20 μL;柱温:25℃.结果:GM1在0.05-5 mg·mL-1浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系,RSD≤0.51%.GM1与其各有关物质均达到基线分离,各杂质低检测限为100 ng.结论:该法专属性强,操作方便,结果准确,重现性好.
关键词： 单唾液酸四己糖神经节苷脂钠 杂质控制 高效液相色谱 含量测定 -
离子色谱法测定奥沙拉嗪钠原料药中甲磺酸的含量
目的:建立离子色谱法测定奥沙拉嗪钠原料药中甲磺酸含量的方法.方法:用高纯水溶解样品作为供试品溶液,使用离子色谱仪测定其中甲磺酸的含量.使用A Supp 7-250阴离子分析柱(250 mm×4.0 mm,5μm),以3.2 mmol·L-1碳酸钠和1.0 mmol·L-1碳酸氢钠-丙酮(95∶5)为流动相,流速0.7 mL·min-1;进样量20 μL.结果:甲磺酸浓度在1.334～13.34μg·mL-1范围内线性关系良好(r =0.9999),3个浓度水平下甲磺酸的平均回收率为99.8％(n=9),小检出限为0.10 μg·mL-1 (S/N =3).结论:本法可准确测定奥沙拉嗪钠原料药中甲磺酸的含量,有效控制其质量.
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高效液相色谱-单四极杆质谱仪结合同位素峰形校正检索技术快速确定头孢呋辛水溶液降解杂质
目的:探索一种利用同位素峰形校正检索技术(CLIPS),在低分辨率单四极杆液质联用仪上,实现对未知杂质元素组成的分析,进而快速推断降解杂质结构的方法.方法:头孢呋辛对照品经水浴降解获得未知杂质混合样品,用HPLC - MS进行分离,并获得降解产物的准分子离子和碎片离子的同位素峰形;用元素组成已知的同位素峰做校正,对未知降解杂质进行CLIPS校正分析,确定元素组成,再根据质谱谱图信息初步确定其结构式.结果:水浴降解溶液中7个降解杂质得到了有效分离.用CLIPS确定了降解杂质的准分子离子和部分碎片离子的元素组成,并初步推测出其中4个降解杂质的结构.结论:同位素峰形校正检索技术结合高效液相色谱-单四极杆质谱联用仪可以确定降解杂质的元素组成,进而帮助降解杂质的结构解析和确证.
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荧光定量PCR法测定重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA的残留量
目的:利用wako DNA提取试剂盒结合荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术,建立重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA残留量测定的方法并进行验证,用于对该产品进行质量控制.方法:通过wako DNA提取试剂盒提取重组人/门冬胰岛素原料中的宿主残留DNA,再利用SYBRGreen染料法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析.对建立的方法进行引物特异性以及结果准确性和精密性验证,同时对本室留样的3批重组人胰岛素原料和3批重组门冬胰岛素原料中的残留DNA进行测定.结果:该方法检测酿酒酵母菌基因组DNA的低准确定量质量浓度可达0.137 8 ng· mL-1,DNA质量浓度在0.137 8～137 800 ng·mL-1范围内,其质量浓度的对数值与Ct值呈良好线性关系,标准曲线的相关系数(r)为0.994;DNA提取试剂盒提取不同量的加标样品回收率均在50％～200％范围内;该方法检测3批重组人胰岛素原料和3批重组门冬胰岛素原料中的DNA残留量均小于10 ng·剂量-1,符合进口药品注册标准中关于重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA残留量的要求.结论:wako DNA提取试剂盒能解决重组人/门冬胰岛素原料中样品前处理的技术难点,与定量PCR法结合能够简便、快速、准确地对重组人/门冬胰岛素原料中残留的DNA进行定量测定.
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醋酸奥曲肽原料及其制剂的杂质分析
目的:探讨醋酸奥曲肽原料及其制剂的杂质情况.方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为HypersilC18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相A为四甲基氢氧化铵溶液(取10％四甲基氢氧化铵溶液20 mL,加水880 mL,用10％磷酸溶液调节pH至5.4)-乙腈(900∶100),流动相B为四甲基氢氧化铵溶液(取10％四甲基氢氧化铵溶液20 mL,加水380 mL,用10％磷酸溶液调节pH至5.4)-乙腈(400∶600),流速1.0 mL· min-1,紫外检测波长为210 nm,分析醋酸奥曲肽原料及制剂的杂质谱,并比较了原料间、制剂间的杂质情况.再结合影响因素试验、加速试验、配伍稳定性试验,分析影响杂质产生的因素及杂质的变化情况,并确证未知杂质的结构.结果:醋酸奥曲肽杂质谱显示其主要杂质共21个,不同企业间的原料、制剂杂质谱均有差异,同一企业不同剂型的制剂杂质谱也有差异;影响因素试验及加速试验表明温度、湿度、光及贮藏均可增加醋酸奥曲肽的杂质;确定了5个未知杂质的结构,分别为杂质6(D-Th6-OCTR)、杂质7([des-Thr-ol8]-OCTR)、杂质9(Des-Thr6-OCTR)、杂质12(D-Cys7-OCTR)、杂质13(Des-Lys5-OCTR)及杂质15([AC-D-phe1]-OCTR).结论:醋酸奥曲肽的杂质主要来源于制剂的生产及贮藏过程,应进一步提高制剂的生产工艺及严格控制贮藏条件,以提高产品的质量.
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HPLC-MS/MS法分析氟胞嘧啶中痕量基因毒性杂质N,N-二甲基苯胺
目的:建立液相色谱-质谱联用方法测定氟胞嘧啶中痕量基因毒性杂质N,N-二甲基苯胺的含量.方法:采用C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色谱柱,以水(含0.1％甲酸)-甲醇(含0.1％甲酸)(95∶5)为流动相,流速0.2 mL· min-1,电喷雾离子化(ESI),正离子模式下MRM采集.结果:N,N-二甲基苯胺质量浓度在0.4～10 ng·mL-1范围内,与峰面积线性关系良好(r=0.999 5);检测限为0.1 ng· mL-1,定量限为0.4ng·mL-1;平均回收率(n=9)为101.3％.3批样品中N,N-二甲基苯胺的含量均小于0.02 μg·g-1.结论:本方法可用于氟胞嘧啶中痕量基因毒性杂质N,N-二甲基苯胺含量的检测.
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青蒿素有关物质检查方法探讨
目的:建立青蒿素有关物质含量的HPLC检查方法.方法:采用高效液相色谱法对青蒿素原料中有关物质进行定量测定,以CAPCELL PAK C18 MG(4.6 mm×150 mm,5μm)为色谱柱,以乙腈-水(60∶40)为流动相,流速为1.0 mL·min1,检测波长为210 nm;采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术(UPLC-MS/MS)对实测样品中的主要杂质进行结构确认,离子源为ESI,检测模式为正离子模式.结果:主峰与各杂质分离良好,样品中检测出2个主要杂质.其中,杂质I为青蒿烯,杂质Ⅱ可能为青蒿素的异构体.所建立的HPLC方法,青蒿素和青蒿烯的检出限分别为2μg·mL-1和0.05 μg·mL-1,线性范围分别为0.01～0.12 mg·mL-1和0.000 5～0.01 mg·mL-1;青蒿烯的平均加样回收率为101.4％,RSD为1.8％;青蒿烯和杂质Ⅱ进样精密度分别为0.6％和1.7％.结论:本法经方法学验证,可用于青蒿素中有关物质的测定.
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气相色谱法测定美沙拉嗪肠溶片中苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚3种有关物质的含量
目的:建立气相色谱法测定美沙拉嗪肠溶片中苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚3种有关物质的含量.方法:采用安捷伦HP-5(5％ Ph Me Silicone)毛细管柱(10 m×0.53 mm×2.65 μm),载气为高纯氮气(99.999％),流速15 mL·min-1,进样口温度280℃,氢火焰离子检测器(FID) 300℃,柱温为程序升温(起始温度70℃,保持2 min,以10℃· min-1的速率升温至150℃,维持6 min).结果:在选定的色谱条件下,苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚3个杂质分离度良好,回收率在97％ ～ 103％之间,精密度、线性回归等良好.3批样品中苯胺含量均为0.00012％;2-氨基苯酚含量分别为0.00022％、0.00018％和0.00019％;4-氨基苯酚含量分别为0.00025％、0.00024％和0.00024％.结论:本方法能用于美沙拉嗪肠溶片的质量检测.
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HPLC-MS法分析甲苯磺酸拉帕替尼中痕量基因毒性杂质
目的:建立液相色谱-质谱联用方法测定甲苯磺酸拉帕替尼中基因毒性杂质的含量.方法:采用色谱柱C18(4.6 mm×250 mm,5μm),以0.1％甲酸溶液-乙腈(20∶ 80)为流动相,流速1.0 mL·min-1,电喷雾离子化(ESI)正离子模式下选择m/z252离子进行检测.结果:基因毒性杂质4-(3-氟苯甲氧基)-3-氯苯胺质量浓度在0.08～8 ng·mL-1范围内,与峰面积线性关系良好(r=1.000);检测限为0.003 6 ng,定量限为0.010 7 ng;样品中基因毒性杂质测定结果的重复性良好,RSD(n=6)为7.5％;基因毒性杂质平均回收率(n=9)为96.6％.结论:本方法操作简便,结果可靠,可以用于甲苯磺酸拉帕替尼中基因毒性杂质4-(3-氟苯甲氧基)-3-氯苯胺含量的检测.
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HPLC-ELSD法同时测定丙泊酚注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量
目的:建立HPLC-ELSD法同时测定丙泊酚注射液中溶血磷脂酰胆碱(LPC)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)的含量.方法:采用Ultimate Diol色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶ 15∶0.5:0.05)为流动相A,以正己烷-异丙醇-流动相A(20∶ 48∶ 32)为流动相B,进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,柱温为40℃.使用蒸发光散射检测器,雾化气为N2,载气压力为172 kPa,漂移管温度为70℃.结果:溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的浓度分别在0.02192 ～0.2192 mg·mL-(r=0.9997)和0.01056～0.1 mg·mL-1(r =0.9980),呈良好的线性关系;检测下限分别为0.4μg和0.2 μg;定量下限分别为0.8 μg和0.6 μg;平均回收率(n=9)分别为95.0％(RSD=1.3％)和94.0％(RSD％＝1.1).结论:本方法经方法学验证,可同时测定丙泊酚注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量.
