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SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化
克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建原核重组表达质粒PET23a-M,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达、纯化.表达产物用WesternBlot检测其抗原性.RT-PCR扩增M编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.
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SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答
表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答.方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答.N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答.成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性.
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弓形虫RH株SAG2基因片段的克隆、表达、纯化与鉴定
克隆弓形虫RH株膜表面抗原2(SAG2)编码基因,构建原核重组表达质粒PET23a-SAG2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达及纯化SAG2蛋白.PCR扩增503bp的SAG2编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.限制性酶切分析及测序鉴定后以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD-18T-SAG2质粒与表达质粒载体Pet23a的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位点,构建重组体Pet23a-SAG2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.表达产物经金属鏊合层析纯化.用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达与纯化产物.PCR扩增出约503bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符;所构建的PET23a-SAG2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定,与预期结果一致.SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物约18kD.成功构建PET23a-SAG2表达质粒,诱导表达并纯化出了弓形虫RH株SAG2蛋白,并以免疫印迹鉴定.
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弓形虫主要表面抗原SAG1克隆、表达与纯化
扩增弓形虫RH株主要表面抗原SAG1基因编码序列,构建重组表达质粒,研究其在大肠杆菌中的表达,并予分离纯化.采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出编码截短的SAG1的编码序列,并克隆至pMD18-T载体上;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;将序列正确的阳性克隆的插入片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21,阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导,对融合的表达产物经洗涤、变性、复性后利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析进行初步纯化.表达产物以SDS-PAGE和免疫印迹分析.PCR扩增出SAG1基因的特异片段,与预期片段大小相符,其TA阳性克隆的序列正确,所构建的重组体pGEX-4T-2/SAG1阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致;诱导表达的融合蛋白经过复性纯化后,经SDS-pAGE和免疫印迹分析显示,SAG1基因在大肠杆菌中不仅有表达,且该重组抗原表达产物具有特异的免疫反应性.成功构建了弓形虫主要表面抗原SAG1的原核重组表达质粒,在大肠杆菌中表达了SAG1的融合蛋白,纯化的蛋白具有良好的免疫原性.
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弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达
构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒.设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVA C而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况.PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达.成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8.
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重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答
表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答.从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答.GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性.
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间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在E.coli中的融合表达
在大肠杆菌(E.coli)中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST-PvMSP1 C.方法:以限制性内切酶BamH Ⅰ和Sa1Ⅰ双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段,柱纯化后,插入表达质粒载体的多克隆位点,构建重组体pGEX-4T-2/PvMSP1C,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导表达,表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析.双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得1119bp的PvMSP1 C编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建的pGEX-4T-2/PvMSP1 C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE电泳显示,GST-PvMSP1 C融合表达蛋白的大小约63ku,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别.成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C端编码基因pGEX-4T-2/PvMSP1 C表达质粒,诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白,表达蛋白具有一定免疫活性.
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恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达
将恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株的56kDa和47kDa外膜蛋白基因嵌合,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生双抗原融合蛋白.采用PCR方法,从Ot Karp株基因组DNA中扩增56kDa蛋白基因片段,将该片段分别与原核表达载体pQE30及47kD蛋白基因重组质粒pQE30/47连接,构建pQE30/56及pQE30/56-47重组质粒;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达.SDS-PAGE显示,pQE30/56转化的大肠杆菌产生一约50kDa的融合蛋白和pQE30/56-47转化大肠杆菌产生一约90kDa融合蛋白(56-47融合蛋白),免疫印迹分析显示两融合蛋白均与OtKarp株感染鼠血清产生特异性反应,56-47融合蛋白分别与47kDa、56kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应,以及56-47融合蛋白免疫血清与56kDa和47kDa重组蛋白反应.Ot Karp株的56kDa与47kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达,表达的融合蛋白具有56kDa和47kDa外膜蛋白的抗原特性.
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贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因表达及重组外膜蛋白免疫保护性的研究
研制贝氏柯克斯体30kDa重组外膜蛋白和分析该重组蛋白的免疫保护作用.将克隆贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因与原核表达载体pQE30重组,用重组质粒转化大肠杆菌后用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠2次,用IFA和ELISA检查免疫小鼠的特异性抗体,以及用重组蛋白体外刺激小鼠T淋巴细胞增殖;免疫4周后,用柯克斯体毒株攻击免疫小鼠,攻毒后第7d,小鼠的主要脏器作病理学检查和柯克斯体量测定.(1)贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌细胞内表达,产生的重组蛋白约占全菌蛋白的14.6%,免疫印迹显示该重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应.(2)ELISA检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组外膜蛋白抗体,免疫小鼠的脾淋巴细胞经重组外膜蛋白刺激后,细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.(3)免疫小鼠的肺、肝、脾,无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏明显肿大并含有大量的柯克斯体.贝氏柯克斯30kDa重组外膜蛋白诱导小鼠产生抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答能有效地抵御贝氏柯克斯体的感染.
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恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中表达
采用PCR方法,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增58kDa热休克蛋白的基因,将该基因分别与原核表达载体pQE30及47kDa外膜蛋白的基因重组质粒(pQE30/47)连接,构建pQE30/58及pQE30/58-47重组质粒,用重组质粒转化大肠杆菌.SDS-PAGE显示,pQE30/58和pQE30/58-47转化的大肠杆菌分别产生一58kDa重组蛋白和一90kDa的双抗原(58-47)融合蛋白.免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别58kDa重组蛋白和90kDa融合蛋白,90kDa融合蛋白既与47kDa重组蛋白也与58kDa重组蛋白的免疫血清特异反应,58kDa与47kDa重组蛋白也被90kDa融合蛋白免疫血清所识别.研究结果证明58-47融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株47kDa外膜蛋白和58kDa热休克蛋白的抗原特性.
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表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗构建
构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗.用PCR技术从卡介苗(BCG)基因组扩增分支杆菌19kDa抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增27kDa外膜蛋白基因,将它们分别插入大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒(pSMT3)的XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/HindⅢ位点.将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌和从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗.从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性重组卡介苗菌落,用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗,发现一约27kD的蛋白带与贝氏柯克斯体27kD重组蛋白免疫兔血清特异反应,用27kD重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗,结果为阳性.重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白,表达的27kDa外膜蛋白存在卡介苗菌体表面,卡介苗菌体表面的27kD抗原可能有效地诱导特异性的抗Q热免疫应答.
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常氧及慢性缺氧的肺动脉内皮细胞急性缺氧后血栓素合酶(TXS)基因及PGI2、TXA2代谢产物的变化
目的:前列环素(PGI2)和血栓素A2(TXA2)均是花生四烯酸经环氧合酶(COX)途径生成的代谢产物,分别由前列环素合酶和血栓素合酶催化产生.本实验动态观察了常氧及慢性缺氧的肺动脉内皮细胞血栓素合酶(TXS)基因表达的变化及培养基上清中PGI2及TXA2的代谢产物6-Keto-PGF1α、TXB2随急性缺氧的变化.方法:采用连代常氧和缺氧培养的肺动脉内皮细胞,分别在2、4、6代给予急性缺氧刺激6 h,分为四组:常氧组(N)、急性缺氧6 h组(NH)、慢性缺氧后复氧12 h组(H)、慢性缺氧后复氧12 h再急性缺氧6 h组(HH).提取各组总RNA.将载有大鼠血栓素合酶基因片段的PBR322质粒,转化大肠杆菌HB101,扩增后提取质粒,经酶切、电泳后回收TXS 0.5 kb的cDNA片段作为探针,地高辛随机引物法标记探针作斑点杂交.以β-actin为对照,目的基因与对照的积分光密度比值作半定量分析.用放免法测定培养基上清中PGI2、TXA2代谢产物6-Keto-PGF1α、TXB2的变化.结果:常氧培养的PAEC急性缺氧后TXS mRNA、6-Keto-PGF1α、TXB2均增加,TXA2/PGI2在2、4代减少,第6代基本不变;慢性缺氧培养的PAEC急性缺氧后,6-Keto-PGF1α在2、4代减少,第6代不变;TXS mRNA、TXB2第4代增加,第6代减少,TXA2/PGI2在2、4代增加,第6代减少.结论:慢性缺氧改变了急性缺氧时肺动脉内皮细胞血栓素合酶(TXS)基因表达及TXA2与PGI2的比例,可能影响了肺动脉高压的发展及机体对慢性缺氧的习服过程.
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人FL-FEN-1基因功能的初步研究
目的:FEN-1是一种结构特异性核酸酶,它识别特定的核酸分叉结构,并切除含有游离5'末端的单链核酸.FEN-1具有对DNA复制和修复都必需的双重功能.对酵母和体外实验的研究表明,在DNA复制过程中,FEN-1去除了冈崎片段前端RNA引物的后一个核糖核苷;在DNA修复中,FEN-1参与了损伤碱基的修复过程.方法和结果:采用反义核酸技术,从人FEN-1表达质粒hPET-FCH经双酶切得到1084 bp的hFEN-1片段,反向克隆入采用经改建的哺乳动物表达载体pMAMneoAmp ,并得到hFEN-1反义表达质粒pMAMneoAmp FNB .采用改进的磷酸钙介导的细胞转染法,将pMAMneoAmp FNB 和pMAMneoAmp 质粒分别导入FL细胞,用含400 μg/mL G418的MEM完全培养基筛选,分别得到FL-FEN 和FL-M细胞.细胞生长曲线的测定发现,FL-FEN-1 在地塞米松的诱导下,细胞生长速度明显下降,细胞倍增时间TD为3.03 d,而FL和仅含有空载体的FL-M细胞在地塞米松存在下的细胞倍增时间TD分别为2.03 d和2.22 d,不经地塞米松诱导的FL-FEN-1 细胞的TD为2.38 d.采用流式细胞仪对细胞周期的研究表明,在地塞米松诱导下,用不含精氨酸的MEM培养48 h同步化处理后,FL-FEN-1 细胞的S期百分比为9.95%,而FL和FL-M细胞分别为26.31%和23.07%.采用DEAE介导的细胞转染法将穿梭质粒pZ189分别转染经地塞米松诱导的FL、FL-M和FL-FEN-1 细胞,以Hirt's法提取质粒并转化大肠杆菌MBM7070,得到的自发突变率依次为3.91/104、7.79/104和14.4/104.结论:在哺乳动物细胞中FEN-1基因在DNA复制和细胞繁殖的过程中起着重要作用,并且可能参与维持细胞DNA遗传稳定性的过程.
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特异性抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建及鉴定
噬菌体单链抗体(ScFv)弥补了传统McAb制备繁琐、抗原性强、穿透力弱等不足,为HCC临床和基础研究提供新的手段。我们用基因工程技术和噬菌体表面呈现技术构建和筛选特异性抗HCC噬菌体ScFv库。 1. 材料与方法:(1)抗HCC噬菌体ScFv库的构建:应用HCC细胞常规免疫BALB/C小鼠,从其脾脏提取tRNA并纯化mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增抗体轻链和重链可变区,应用linker-(Gly4Ser)3装配ScFv基因,在其5′端和3′端分别引入内切酶SfiⅠ和NotⅠ酶切位点,连接到噬菌体载体pCANTAB 5E,转化大肠杆菌TG1细胞,铺SOBAG平板,记数菌落。
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乙型肝炎DNA疫苗系列质粒的构建及其在SP2/0细胞中的表达
近年来兴起的核酸疫苗对某些病毒感染同时具有预防和治疗作用。我们构建了一系列能表达乙型肝炎病毒大、中、小蛋白的疫苗质粒,并研究了其在SP2/0细胞中的表达情况。一、材料与方法1. S、MS、LS蛋白编码基因片段的获取:以含有adr亚型HBV全基因组pBHB4质粒为模板,用3对人工合成的引物SF/SR、S2F/SR、S1F/SR分别扩增编码小蛋白S(nt28-708)、中蛋白MS(nt3077-708)和大蛋白LS(nt2719-708)的DNA片段。引物SF、S2F和S1F分别互补于S、前S2和前S1基因起始区域,SR则互补于S基因相应的终止区。2. S1S重组基因片段的获取:采用重叠扩增PCR法对S1S2S基因进行剪切和重组,即获得不含S2的S1S重组基因片段。3. 重组质粒的构建及鉴定:将上述获得的S、S1S、S2S及S1S2S基因片段分别插入质粒pSG5UTPL/Flag载体的SV40启动子下游和质粒pRc/CMV载体的CMV启动子下游。将以上8个重组质粒转化大肠杆菌XL Blue 1,经菌落PCR鉴定技术筛选含相应插入片段的阳性克隆,然后抽提、扩增、纯化并酶切鉴定,以373A型核酸自动分析仪测定所插入片段的核酸序列。4. 重组质粒在SP2/0细胞中的表达:将纯化的质粒转染SP2/0细胞并筛选、建立长期转染细胞株。分别收集部分转染细胞,超声破碎后收集上清液,以Western-Blot检测相应蛋白质在SP2/0细胞中的表达情况。
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抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库
目的 应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库 ,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因. 方法 用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与 两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR 产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定, 反向Northern blot分析差异基因的可靠性. 结果 成功地构建了具有高消 减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5%的 克隆均具有100~600 bp左右的插入片段. 随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝 癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡 相关基因cDNA片段. 结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋 亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有 助于了解细胞凋亡的分子机制.