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肠道mTOR信号分子调节GLP－1生成
目的：胰高血糖素样肽（ GLP－1）在餐后具有重要的刺激胰岛素分泌、降糖效应。 L细胞如何感受机体能量状态从而调控GLP－1合成分泌尚不清楚。哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（ mTOR）是细胞内重要的能量感受分子。本研究发现肠道mTOR 调节L细胞合成分泌GLP－1。方法：在对照组小鼠，高脂饲料诱导的糖尿病小鼠、db／db和Neurog3－Tsc1－／－小鼠，以及 STC－1细胞模型上采用实时荧光PCR和Western blot观察GLP－1表达。酶联和放免方法观察血浆、培养基中GLP－1和胰岛素分泌。结果：饥饿抑制回肠mTOR活性同时抑制了肠道GLP－1的表达和释放。而饥饿后重饲具有显著翻转效应。高脂喂养可显著抑制小鼠肠道mTOR活性同时抑制了肠道GLP－1的合成。雷帕霉素在正常、糖尿病小鼠模型上均具有抑制回肠mTOR活性同时抑制了肠道GLP－1的表达和释放功能，而亮氨酸灌胃和Tsc1基因敲除具有显著刺激肠道GLP－1合成效应。过表达mTOR质粒刺激GLP－1启动子活性以及生成。结论：肠道mTOR活性通过感受机体能量调节GLP－1生成。
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mTOR抑制剂AZD8055抑制喉癌细胞增殖并促进凋亡
目的：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ mammalian target of rapamycin， mTOR ）可调节细胞的生长、生存和自噬。本研究观察mTOR在人喉癌组织中的表达，明确其对喉癌发生与发展的关系；以mTOR抑制剂AZD8055处理人喉癌细胞系Hep－2，观察其抑瘤作用并探讨其作用机制。方法：免疫组织化学染色方法检测喉癌组织中mTOR的表达；分别以0．8、2．6、8、26和80μg／L的AZD8055处理Hep－2细胞24、48或72 h，MTT方法检测细胞增殖， TUNEL染色检测细胞凋亡，罗丹明123染色检测线粒体膜电位，Western blot和免疫荧光染色检测蛋白表达。结果：人喉癌组织中mTOR表达上调，并且其分化程度越低，mTOR表达水平越高。以AZD8055处理后， Hep－2细胞增殖减少，凋亡增加，线粒体膜电位下降；caspase－3表达上调， Bcl－2表达下调， BH3－only蛋白如Bim、Bid和Bad表达上调。结论：mTOR表达上调可参与喉癌的发生与发展，抑制mTOR活性可抑制喉癌细胞增殖，促进喉癌细胞凋亡，mTOR可作为喉癌治疗的潜在靶标。
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真核细胞翻译起始因子和雷帕霉素靶蛋白在食管鳞癌组织中表达的临床意义
目的：探讨真核细胞翻译起始因子（eIF4E）与雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在食管鳞癌组织中表达的临床意义。方法回顾性收集2010年1月至2012年12月在中山大学附属第一医院胸外科行手术切除的148例食管鳞癌患者的临床资料及肿瘤组织石蜡标本，应用Western blot和免疫组织化学（免疫组化）染色检测食管鳞癌组织、癌旁不同距离组织中eIF4E与mTOR的表达情况，并分析其与本组患者临床病理特征的关系。结果 mTOR主要表达于细胞质，而elF4E阳性部位位于细胞膜，呈棕黄色颗粒；两种标记物在癌组织中强表达，在癌旁组织呈弱表达或不表达。食管鳞癌组织、癌旁1 cm组织及癌旁5 cm组织中，mTOR蛋白的表达分别为85．8％（127／148）、35．1％（52／148）及3．4％（5／148），eIF4E蛋白分别为93．9％（139／148）、35．1％（52／148）及12．8％（19／148），均呈明显下降趋势（均P＜0．05）。 mTOR和eIF4E的表达均与肿瘤浸润深度和有无淋巴结转移有关（均P＜0．05），其中mTOR表达还与肿瘤分化程度有关（P＝0．003），而eIF4E表达与肿瘤分化程度无关（P＝0．062）。两者的表达均与患者性别、年龄、肿瘤大小无关（P＞0．05）。结论 eIF4E与mTOR在食管鳞癌组织中呈过度表达，可能与肿瘤恶性程度和淋巴结转移有关，两者联合检测可能有助于对食管鳞癌恶性程度及预后的判断。
关键词： 食管肿瘤 鳞癌 真核细胞翻译起始因子 雷帕霉素靶蛋白 -
吡格列酮对2型糖尿病大鼠肾脏雷帕霉素靶蛋白表达的影响
雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是胰岛素信号通路的关键效应蛋白,在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键性的作用[1].吡格列酮是过氧化物酶体增殖物激活受体( PPAR),可剂量依赖性地减轻高脂血症诱导的血管内皮功能障碍.目前有关mTOR的研究是移植免疫和肿瘤领域的热点,但其与糖尿病肾病(DN)的相关研究尚不多.本研究旨在观察2型糖尿病大鼠肾脏mTOR的表达以及吡格列酮干预后其表达的变化,探讨mTOR在DN发病中的作用及吡格列酮对肾脏的保护作用.一、材料与方法1.动物模型的建立与分组:清洁级雄性SD大鼠33只(由南昌大学医学院动物科学部提供),体质量( 200±20)g,随机分成正常对照组(A组)11只,2型糖尿病组22只,分别给予普通饮食及高糖高脂饮食4周.根据胰岛素抵抗指数( HOMA)判断动物出现胰岛素抵抗后,2型糖尿病组给予链脲佐菌素一次性腹腔注射( 30 mg/kg),而对照组仅注射等剂量的枸橼酸缓冲液.1周后,尾静脉采血测空腹血糖,以空腹血糖≥13.9 mmol/L作为2型糖尿病成模标准.将造模成功的2型糖尿病大鼠随机分成2组,即2型糖尿病组(B组)、吡格列酮干预组(C组).每天给予A、B组生理盐水灌胃(2 ml/kg),C组吡格列酮( 10 mg/kg)灌胃,持续6周.
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不同剂量氯胺酮的抗抑郁作用及其与海马mTOR及GluR1的关系
目的 探讨不同剂量氯胺酮对强迫游泳大鼠抗抑郁效应的影响及其潜在机制.方法 40只2月龄雄性Wistar大鼠随机均分为4组(n=10),行强迫游泳实验(forced swimming test,FST)15 min以建立大鼠抑郁模型.次日,分别腹腔注射生理盐水、氯胺酮5 mg/kg、氯胺酮10 mg/kg、氯胺酮20 mg/kg.30 min后,行FST5 min并记录其不动时间.行为学测试后,取海马组织测定雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及谷氨酸受体1(glumate receptor 1,GluR1)的含量.结果 氯胺酮5 mg/kg组、10 mg/kg组和20 mg/kg组大鼠强迫游泳不动时间分别为136±13 s、119±12 s和95 ±20 s,与对照组的169±12 s相比,各组氯胺酮大鼠强迫游泳不动时间明显减少且呈剂量依赖性,P<0.05;各组氯胺酮大鼠海马组织mTOR含量分别为1.52±0.19、2.36±0.13和2.95±0.22.较对照组的0.87±0.11显著增高,P<0.05;各组氯胺酮大鼠海马组织GluR1含量分别为1.23 ±0.11、1.45 ±0.06和1.60±0.13,亦较对照组的0.91±0.07显著增高,P<0.05.结论 氯胺酮具有确切的抗抑郁作用,其机理可能与海马组织mTOR及GluR1的上调有关.
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右美托咪定对术后认知功能障碍小鼠海马组织中雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响
目的 探讨右美托咪定对术后认知功能障碍(POCD)小鼠海马组织中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响. 方法 清洁级成年C57BL/6J小鼠64只,采用随机数字表法分为4组:假手术组、POCD组和右美托咪定低剂量组(DEX-L组)及高剂量组(DEX-H组),每组16只.假手术组小鼠只麻醉而不行部分肝脏切除手术;POCD组小鼠采取麻醉下部分肝脏切除手术的方法复制POCD模型;DEX-L组和DEX-H组小鼠于术前30 min腹腔注射右美托咪定25 μg/kg、50μg/kg,随后复制POCD模型;假手术组和POCD组小鼠均于术前30 min腹腔注射等体积的生理盐水.行为学测试采用条件恐惧实验,分别于术前1d和术后第3天进行训练和行为学测试,记录僵直时间百分比.酶联免疫吸附法(ELISA)检测术后第3天小鼠脑脊液β淀粉样蛋白42 (Aβ42)和磷酸化tau-181(p-tau-181)蛋白水平.术后第3天留取小鼠海马组织,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)测定海马组织mTOR、tau、核因子-κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α) mRNA表达水平,Westernblotting法测定海马组织mTOR、磷酸化tau蛋白(pS396 tau蛋白)、NF-κB p65及TNF-α蛋白表达水平. 结果 (1)场景性恐惧记忆实验中,与对照组比较,POCD组小鼠僵直时间百分比明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与POCD组比较,DEX-L组和DEX-H组小鼠僵直时间百分比均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).(2)与假手术组比较,POCD组、DEX-L组和DEX-H组小鼠脑脊液中Aβ42和p-tau-181蛋白含量均明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).与POCD组比较,DEX-L组和DEX-H组小鼠脑脊液中Aβ42和p-tau-181蛋白含量均明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).与DEX-L组比较,DEX-H组小鼠脑脊液中Aβ42和p-tau-181蛋白含量进一步减少,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)与假手术组比较,POCD组海马组织mTOR、NF-κB p65和TNF-α mRNA及其蛋白表达水平、tau mRNA及pS396 tau蛋白表达水平均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).与POCD组比较,DEX-L组和DEX-H组海马组织上述指标明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与DEX-L组比较,DEX-H组小鼠上述指标进一步降低,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 右美托咪定可改善小鼠早期POCD,其机制可能与抑制小鼠海马组织mTOR信号通路有关.
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抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对血管性痴呆大鼠海马CA1区自噬相关蛋白表达的影响
目的 探讨抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对血管性痴呆(VD)大鼠海马CA1区自噬相关蛋白表达的影响. 方法 108只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、VD组、PI3K抑制剂LY294002组(LY294002组)和mTOR抑制剂雷帕霉素组(雷帕霉素组),每组再依据取材时间不同分为1、2、4、8周4个时间点.后3组采用改良Pulsinelli四血管阻断法制备大鼠VD模型,后2组在制备VD模型前侧脑室注射10 mmol/LLY294002溶液10 μL或8 ng/μL雷帕霉素4μL.分别在各时间点采用Western blotting检测大鼠海马CA1区Beclin1蛋白表达及微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ/LC3 Ⅰ比值,在4周时间点采用免疫荧光染色检测大鼠海马CA1区LC3表达. 结果 (1)与假手术组比较,VD组各时间点Beclinl蛋白表达及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均增高,差异均有统计学意义(P＜0.05);与VD组比较,LY294002组和雷帕霉素组各时间点Beclin1蛋白表达及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均明显增高,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)免疫荧光染色结果显示:4周时,假手术组神经元胞质内LC3呈散在低表达,VD组LC3表达增多,LY294002组和雷帕霉素组LC3表达明显增多. 结论 抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能促进VD大鼠海马CA1区自噬相关蛋白Beclin1及LC3表达,神经元自噬得到明显增强.
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AMPK信号通路在蛛网膜下腔出血后自噬激活中的作用及机制
目的 探讨单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信号通路参与蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤中自噬激活的机制. 方法 成年雄性SD大鼠60只按随机数字表法分为假手术组、SAH组、SAH+AICAR(AMPK激活剂)组、SAH+Compound C(AMPK抑制剂)组、SAH+生理盐水组,每组各12只.后4组采用血管内穿刺法建立SAH模型,后3组于造模前30 min分别经左侧侧脑室注射AICAR、Compound C或生理盐水.术后24 h采用免疫组化染色检测磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达,采用Western blotting检测皮层自噬相关蛋白LC3、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)表达,采用Loeffler的5分制评分法进行神经行为学评分. 结果 与假手术组相比,SAH组p-AMPK水平显著升高;p-mTOR组织学表达增高,主要表达于细胞浆,分布在出血周围的皮质、深部皮质与脑白质结合部;自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值显著增加;神经行为学评分显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与SAH组及SAH+生理盐水组相比,AICAR干预显著增高了SAH后p-AMPK水平,抑制了p-mTOR表达,显著增高了LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值,降低了神经行为学评分,差异均有统计学意义(P＜0.05);而Compound C干预则有效降低了p-AMPK水平,抑制LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的表达上调,有效改善了大鼠神经功能评分,差异均有统计学意义(P＜0.05),但对p-mTOR表达没有显著影响. 结论 AMPK信号通路参与了SAH后早期脑损伤中神经元自噬的激活,其机制可能与调控mTOR活性有关;调控AMPK可以发挥与自噬相关的神经保护作用.
关键词： 蛛网膜下腔出血 早期脑损伤 单磷酸腺苷活化蛋白激酶 自噬 雷帕霉素靶蛋白 -
雷帕霉素对人肺癌细胞株增殖抑制的研究
目的:探讨雷帕霉素对人肺癌细胞株的生长影响及磷酸化核糖体蛋白s6激酶(P-S6K1)的表达在雷帕霉素抑制肺癌细胞增长中的意义.方法:用不同浓度(0、0.1、1.0、10.0、100.0 nmol/L)的雷帕霉素处理人肺癌细胞株,药物敏感试验判断雷帕霉素的敏感株和不敏感株.MTT法检测其对人肺癌细胞增殖的影响.Westernblotting观察人肺癌细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路上下游蛋白分子及其磷酸化蛋白的表达,比较P-S6K1在用药前后的表达.结果:4个浓度(0.1、1.0、10.0、1130.0 nmol/L)的雷帕霉素持续作用72 h,除H1299细胞株外,对HLAMP、A549和PAa细胞株的抑制率相应增加(P<0.05),100.0 nmol/L时的抑制率达到大(P<0.05),A值的变化与抑制率一致.位于mTOR上下游的AKT、S6K1、4E.BP1、eIF4E蛋白在所有细胞株中均有表达,P-S6K1在敏感株中呈高表达,在不敏感株中未检测到.在HLAMP和A549中P-S6K1用药后6、12、18和24h较用药前有所降低.结论:雷帕霉素能抑制人肺癌细胞生长,P-S6K1在一定程度上可代表肺癌细胞株对雷帕霉素的敏感性.
关键词： 磷酸化核糖体蛋白S6激酶 肺癌 雷帕霉素 雷帕霉素靶蛋白 -
电针治疗对缺氧缺血性脑病模型大鼠mTOR表达的影响
【目的】观察电针对缺氧缺血性脑病模型大鼠雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表达的干预作用。【方法】选择7日龄SD大鼠，随机分为3组：假手术组、模型组、电针组。每组又以1、3、7、21 d分为4个亚组，采用苏木精—伊红（HE）染色观察缺氧缺血侧脑组织的形态学变化， Western blot法检测mTOR的蛋白表达。【结果】 HE染色显示：电针组在21 d时，神经细胞界限清楚，排列有序，细胞肿胀变轻，细胞轮廓及核仁清晰，可见胶质细胞增生。模型组mTOR蛋白的表达均在第1天开始增加，第3、7、21天持续增加，与假手术组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。电针组在1、3、7、21 d 4个时间点与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。【结论】电针能够促进mTOR蛋白水平的表达，对缺氧缺血性脑损伤大鼠可起到脑保护作用。
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两株子宫内膜癌细胞中mTOR信号通路激活的研究
目的 探讨PTEN缺失lshikawa和PTEN完整HEC-1A细胞中mTOR信号通路的激活.方法 激光共聚焦显微镜检测Ishikawa和HEC-1A细胞中PTEN蛋白表达;RT-PCR和western blot法从mRNA和蛋白水平分别检测mTOR mRNA和下游磷酸话靶蛋白s6K1和4E-BP1表达.结果 Ishikawa细胞中PTEN蛋白表达缺失,HEC-1A细胞PTEN蛋白表达显著(P<0.01);两株细胞中均存在mTOR mRNA表达,而Ishikawa细胞中表达水平要高于HEC-1A细胞(P<0.05);Ishikawa细胞中S6K1和4E-BP1蛋白的磷酸化要明显高于HEC-1A细胞(P<0.05).结论 两株子宫内膜癌细胞中均存在mTOR信号通路的激活,这种激活水平与PTEN相关,PTEN缺失Ishikawa细胞的激活水平较高.
关键词： 子宫内膜肿瘤 雷帕霉素靶蛋白 PTEN Ishikawa细胞 Hec-1A细胞 -
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白及其抑制剂与肾脏疾病的研究进展
雷帕霉素靶蛋白(TOR)是近年来发现的一类进化上非常保守的蛋白激酶家族,广泛存在于各种生物细胞中.1994年,Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因,其产物只有一种蛋白,即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[1].mTOR有两个不同的复合物,即mTORC1和mTORC2.这两个复合物分别含有不同的骨架蛋白raptor和ricter,使mTOR连接到不同的信号通路.mTORC1可以刺激蛋白质翻译、核糖体合成和抑制细胞自我吞噬,mTORC2的激活有助于肌动蛋白的调节和细胞骨架的形成.雷帕霉素是一种有效的mTOR特异性抑制剂,它除了抑制mTOR外不抑制任何其他蛋白激酶,由于其对mTOR特异性高,雷帕霉素已建立了mTOR在细胞生物学和疾病发病机制的重要作用.雷帕霉素进入细胞后与FK506结合蛋白12(FKBP-12)结合形成FKBP-雷帕霉素复合物,再与mTORC1的FKBP-雷帕霉素复合物结合区结合进而抑制mTORC1活性[2].
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哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与肾脏疾病
雷帕霉素(rapamycin,RAPA),又称西罗莫司,是加拿大 Ayerst研究所1975年从土壤细菌中分离的一种新型大环内酯类免疫抑制药物,新的研究证实RAPA具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制、神经保护和抗衰老的作用[1-2],因其对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)有高度特异性, 被广泛运用于移植免疫和肿瘤的靶向治疗研究.RAPA扩散进入细胞后,可与细胞内的FK506-结合蛋白12(FK506-binding protein 12)形成复合体,再与mTOR结合并抑制其活性[3].本文主要对mTOR在肾脏疾病中的作用进行综述,期待能为肾脏疾病的研究和治疗提供思路.
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哮喘大鼠气道中雷帕霉素靶蛋白的表达对气道重塑的影响
目的:探讨哮喘大鼠气道中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达对气道重塑的影响.方法:将20只大鼠随机分为正常组(10只)和哮喘组(10只).哮喘组分别于1d和8d用卵蛋白(OVA) 10 mg、氢氧化铝20 mg生理盐水2 mL制成悬液腹腔注射致敏.15d开始用1％ OVA雾化吸入激发,每周3次,共8周.末次激发24 h后行支气管肺泡灌洗,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)离心,上清液用酶联免疫(ELISA)法测mTOR浓度,重悬液用RT-PCR测mTORmRNA.用图像分析仪测定气道内周径(Pi),外周径(Pe),并计算管壁面积(WA),气道平滑肌面积(SMC-A),气道平滑肌细胞数(N),且WA、SMC-A、N均用Pi进行标准化；正常组大鼠用生理盐水替代卵蛋白,余同哮喘组.结果:哮喘组mTOR浓度、mTORmRNA、WA/Pi、SMC-A/Pi和N/Pi均高于正常组,差异均有统计学意义;mTOR浓度和mTORmRNA与WA/Pi、SMC-A/Pi和N/Pi均呈正相关性.结论:哮喘大鼠气道中mTOR浓度和mTORmRNA高表达可能参与气道重塑.
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mTOR抑制剂雷帕霉素的抗肿瘤作用
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是参与生命活动的多条信号通路的下游因子,其中就包括PI3K/Akt/mTOR信号通路,在细胞生长、分化、转移和存活中地位显著,已成为癌症治疗的一个重要靶标.第一代mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)初作为一种新型的免疫抑制药物在器官移植领域应用广泛.随着对该药物及mTOR信号通路的深入研究,人们慢慢地认识到RAPA除免疫抑制外还具有诱导肿瘤细胞凋亡、阻断细胞周期、抑制信号传导、影响基因转录水平及其对表观遗传学的调控作用.本文主要综述了近年来雷帕霉素在抗肿瘤方面的研究进展,同时讨论了雷帕霉素抗肿瘤的局限性.
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mTOR信号通路调控1，25二羟维生素D3抑制喉癌细胞H ep-2细胞增殖的研究
目的：研究1，25二羟维生素D3抑制喉癌细胞Hep‐2细胞增殖作用以及对雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的影响。方法用不同剂量1，25二羟维生素D3（10－8mol／L、10－7mol／L、10－6mol／L）分别处理Hep‐2细胞24、48、72h，四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测Hep‐2细胞的增殖情况，并计算抑制率；采用流式细胞仪分析1，25二羟维生素D3对Hep‐2细胞周期分布的影响，Westernblot检测1，25二羟维生素D3对mTOR信号通路的影响。结果不同浓度1，25二羟维生素D3均可抑制Hep‐2细胞增殖，改变细胞周期分布，使G0／G1期Hep‐2细胞比例增高。1，25二羟维生素D3干预后Hep‐2细胞TSC1、TSC2蛋白表达较对照组增高（P＜0．01），Rheb蛋白表达明显降低；mTOR蛋白及其磷酸化水平表达与对照组比较均降低（P＜0．01），mTOR蛋白磷酸化表达降低尤为明显（P＜0．01）；4EBP‐1蛋白表达较对照组增高（P＜0．01）。结论1，25二羟维生素D3改变喉癌细胞Hep‐2细胞周期分布，影响mTOR信号通路蛋白表达，从而抑制细胞增殖。
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二氢杨梅素通过抑制mTOR信号通路抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭
目的 探讨二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)对人乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用及其可能的分子机制.方法 以不同浓度DHM(0、10、20 μmol/L和40 μmoL/L)处理乳腺癌细胞MDA-MB-231,采用Transwell实验检测DHM对癌细胞迁移和侵袭能力的影响,采用蛋白印迹法检测迁移与侵袭标志蛋白(Snail、vimentin、MMP-2和MMP-9)及抑迁移蛋白E-cadherin表达的变化;同时利用乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型和免疫组织化学检测法,观察DHM膳食干预(100 mg/kg)对体内癌细胞迁移与侵袭相关蛋白表达的影响.结果 DHM处理乳腺癌细胞24 h,与对照组相比,细胞迁移和侵袭能力均显著降低(P＜0.05),40 μmol/L处理组细胞迁移能力下降至(37.8±3.1)％,侵袭能力下降至(21.4±2.3)％;蛋白表达检测结果显示,DHM处理细胞其Snail、vimentin、MMP-2和MMP-9表达水平显著降低(P＜0.01),40 μmol/L处理组蛋白表达分别下降至(31.2±2.9)％、(11.1±0.9)％、(14.4±1.2)％、(12.7±1.1)％,而E-cadherin表达水平显著升高(P＜0.01),升高至(3.9±0.4)倍;体内研究结果也显示,DHM膳食干预可显著降低移植瘤组织内Snail、vimentin和MMP-9的表达,提高E-cadherin的表达(P＜0.01).进一步研究表明,DHM处理细胞24 h,与对照组相比,细胞内p-mTOR、p-4EBP1、p-S6 K70和p-eIF4B表达水平均显著降低(P＜0.05),表明其mTOR信号通路被显著抑制.结论 DHM可有效抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭,其机制可能是通过抑制mTOR信号通路实现的.
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哺乳动物雷帕霉素靶蛋白重组 RN Ai慢病毒载体的构建
目的：构建哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）重组RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法按照RNAi设计规则，针对mTOR基因设计4个干扰靶点和阴性对照序列（FAM ），先用人工合成寡核甘酸片段，通过PCR拼接的方法，即可获得小干扰RNA（siRNA）有效片段，采用Lipofectamine 2000转染试剂，对肺腺癌A549细胞进行转染，1 d后，通过高倍荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白在肺腺癌A549细胞中的表达情况。采用半定量RT-PCR方法，检测mTOR基因在1 d后mRNA水平的表达，采用Western blot检测2 d后蛋白表达水平，从而筛选出高效的干扰靶序列，将其合成双链DNA ，通过pGCL-GFP载体，与pHelper 1．0和pHelper 2．0质粒共同组成载体系统，进一步转染293T细胞，终包装后产生慢病毒，通过Western blot方法检测GFP蛋白表达水平来检测293T细胞中的病毒滴度，并进行活性鉴定。结果 mTOR基因的高效siRNA干扰靶点被成功筛选出；mTOR siRNA感染体外培养的人肺腺癌 A549细胞后，不管是从 mRNA 水平，还是蛋白水平，该基因都明显沉默；该基因mTOR siRNA的慢病毒载体被成功构建，同时收获病毒上清，并检测出病毒滴度为1×108 UT/mL。结论 mTOR siRNA感染体外培养的人肺腺癌A549细胞，能够导致mTOR基因明显沉默；该基因mTOR siRNA的慢病毒载体被成功构建。
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mTOR/p70S6K信号通路与NIH3T3成纤维细胞增殖
[目的]探讨mTOR/p70S6K信号通路激活在成纤维细胞增殖中的作用. [方法]以mTOR基因转染小鼠NIH3T3成纤维细胞,用MTT法检测其是否增殖,用RT-PCR和Western印迹分析测定细胞mTOR、p70S6K mRNA与蛋白的表达. [结果]MTT法检测转染组细胞增殖能力增强;RT-PCR与Western印迹分析转染组中mTOR和p70S6K的mRNA与蛋白表达水平明显增加(P<0.01). [结论]mTOR/p70S6K信号通路激活可能介导成纤维细胞增殖.
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mTOR信号通路与组蛋白乙酰化在胃癌细胞中的相互作用
目的 研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路与组蛋白乙酰化在人胃癌细胞生存活力、细胞周期、相关基因及蛋白表达方面的相互作用.方法 分别单独或联合脱乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(trichostatin A,TSA)、mTOR抑制剂雷帕霉素和PI3K抑制剂LY294002干预人胃癌MKN45和SGC7901细胞,以噻唑蓝法检测细胞生存活力,流式细胞术检测细胞周期,实时定量PCR检测p21WAF1基因表达情况,蛋白免疫印迹检测Akt、p70S6K及4E-BP1蛋白表达情况.结果 联合用药比单独用药对胃癌细胞生长抑制作用更明显(P＜0.01);不管单独或联合用药,均可使MKN45细胞阻滞在G2期(P＜0.05),使SGC7901细胞阻滞在G1或G2期(P＜0.05);联合用药比单独用药更能提高抑癌基因p21WAF1的表达; 联合用药使Akt、p70S6K及4E-BP1磷酸化表达较单独用药显著下降(P＜0.01),联合用药后组蛋白H4/H3乙酰化也较单独用药表达升高(P＜0.01).结论 mTOR信号通路与组蛋白乙酰化在胃癌的发生发展中存在相互关系,mTOR抑制剂与脱乙酰化酶抑制剂联合应用具有协同作用,可望成为肿瘤基因防治的新靶点.
