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猴痘病毒检测研究进展
猴痘是由猴痘病毒引起的人畜共患病,人类中出现的症状与过去在天花患者身上所看到的症状相似,但病情相对较轻,人群传播力弱于天花.但是自1980年世界上消灭天花以后,猴痘仍然威胁人类的健康.对疫情做出及时正确的反应依赖于有效的病毒检测方法.本文对近年来猴痘病毒的检测方法的发展做一综述,为我国应对可能出现的猴痘疫情以及生物反恐提供参考.
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IL-2调节人外周血T淋巴细胞CTLA-4表达
目的探讨人外周血T淋巴细胞CTLA-4的表达情况及IL-2对其表达的调节作用. 方法采用流式细胞仪定量测定人外周血T淋巴细胞内及细胞膜上CTLA-4的水平,半定量RT-PCR检测T淋巴细胞内CTLA-4 mRNA的水平,并在体外用IL-2刺激T淋巴细胞后观察CTLA-4及CTLA-4 mRNA水平的变化. 结果人外周血T淋巴细胞膜表面几乎不表达CTLA-4,7.6%～18.0%的T淋巴细胞有胞内表达,CD4+T淋巴细胞表达CTLA-4的阳性比例略高于CD8+T淋巴细胞;人T淋巴细胞可溶性形式的CTLA-4 mRNA半衰期短于全长CTLA-4 mRNA;IL-2可以通过诱导人T淋巴细胞CTLA-4 mRNA的转录上调CTLA-4的表达,IL-2诱导的细胞多为CD25+T淋巴细胞. 结论 CTLA-4多存在于人外周血T淋巴细胞内,参与T淋巴细胞活化过程的调节.IL-2的免疫抑制作用可能与其诱导T淋巴细胞内CTLA-4 mRNA转录,从而上调CTLA-4的表达有关.
关键词： 淋巴细胞相关性抗原-4 T淋巴细胞 白细胞介素-2 流式细胞仪 聚合酶链式反应 -
铜绿假单胞菌PA-SD株外毒素A基因Ⅲ区的克隆及同源性比较
目的测定脓胸(CF)病人铜绿假单胞菌分离株外毒素A(ETA)的ADP核糖转移酶(ADPRT)活性及其酶活区(Ⅲ区)序列的变化,为研究ETA在CF病人慢性肺部感染致病机理中的作用提供试验基础和理论依据. 方法采用PCR技术,以铜绿假单胞菌PA-SD株的染色体DNA为模板,扩增ETAⅢ区基因.将产物克隆于pGEMR-T Easy载体,鉴定后测序.用DNASTAR软件将测定的序列与GenBank中获得的其它CF分离株序列进行比较.同时平行测定PA-SD株与标准株PA103的ADPRT活性. 结果扩增出目的基因片段,长度为658bp,获得了重组质粒(PA-SD-ETA).测序结果表明,PA-SD株与所比较菌株的氨基酸的同源性在94.4%～98.1%之间,其中与标准株的同源性为98.1%.第608位发生了相对于所比较的全部分离株的突变,第515位发生Ser到Gly的突变,同时ADPRT活性比标准株PA103低. 结论本研究进一步阐明第515位氨基酸与ADPRT活性的关系,从而为研究ETA在CF病人慢性肺部感染致病机理中的作用提供理论依据.
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广西地区汉族系统性红斑狼疮与HLA-DRB1等位基因相关性研究
系统性红斑狼疮(SLE)是典型的自身免疫性疾病,由于因人种、民族、地理环境等因素不同,HLA抗原分布可出现较大的差异,其与SLE相关的抗原型与基因型亦存在较大差异.我们应用聚合酶链式反应-序列特异性引物 (PCR-SSP) 技术,对广西汉族SLE的HLA-DRB1基因进行分型研究.
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枝状DNA信号放大与纸层析杂交检测方法的建立
血清中病原体的核酸(DNA或RNA)水平可确切地反映病原体的复制能力.现有诊断方法中多以各种模式的聚合酶链式反应(PCR)为主,该方法灵敏度较高,但需要依赖一些设备,且易出现假阳性.测定分子水平的技术多因要求高,一般临床较少开展.近年发展了极为敏感的枝状DNA(branched DNA, bDNA)分析技术,通过一系列的杂交反应后,由显示探针上的酶催化发光底物发光,由光电比色计可定量记录信号,从而达到对病原体核酸的定量分析目的.
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聚合酶链式反应鉴定肺炎链球菌
肺炎链球菌是一种致病率较高的病原菌.所采集临床标本中的细菌早期鉴定对疾病诊断至关重要.
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脐血单个核细胞表达IL-12、IFN-γ及其mRNA的观察
白细胞介素12(IL-12)的主要作用是促进TH1细胞和自然杀伤细胞(NK)产生γ-干扰素(IFN-γ),介导细胞免疫.脐血单个核细胞(CBMC)产生 IL-12的能力鲜见报道.重组 IL-12(rIL-12)在体外能促进新生儿CD4+T细胞产生IFN-γ [1].本文用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测8例CBMC体外表达IL-12p40 mRNA和IFN-γ mRNA的能力;用ELISA法测定8例CBMC培养上清液IFN-γ水平,并观察 rIL-12对CBMC IFN-γ及其mRNA表达的影响.
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聚合酶链式反应在蜱传立克次体病诊断中的应用
蜱传立克次体病（ tick - borne rickettsia diseases， TBRD）在很多国家和地区蔓延，近年来发病率呈逐年上升趋势。该类疾病临床表现无特异性，目前使用的检测方法有病原学观察和血清抗体检测技术，这些方法阳性率低且很难达到早期诊断的目的。随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）已逐渐应用于 TBRD 的诊断中，呈现出较好的敏感性和特异性。但目前针对该类疾病的 PCR 检测方法尚缺乏临床应用的统一标准。因此，笔者就近年来 PCR 检测技术在 TBRD 原检测中的应用作一综述，希望为进一步探索 TBRD 的诊断方法提供参考。
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ER△E5在乳腺癌组织中的表达及临床意义
目的 雌激素受体α(ERα),其剪切变异体为ER△E5,在正常乳腺组织和乳腺癌中,通过检测其表达水平,探讨研究ER△E5在乳腺癌组织中的表达水平和其对临床的指导意义.方法 实验采用普外科的59例乳腺癌组织和59例正常乳腺组织,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测目的基因ER△E5.培养乳腺癌细胞株作为阳性对照,分析ER△E5在乳腺癌组织和正常乳腺组织的差异,研究其临床意义.结果 在乳腺癌标本中ER△E5与HER-2显著相关(P＜0.0001).在乳腺癌标本与正常乳腺组织中ER△E5的表达水平,两者检测水平有统计学意义(P＜0.0001).并且ER△E5的表达与临床分期无相关性.结论 ER△E5的水平在乳腺癌组织中显著增高,HER-2表达与其呈正相关,因此ER△E5可以作为新的临床预后指标,并指导临床内分泌治疗.
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SYBR Green Ⅰ聚合酶链反应检测人白细胞抗原-DRB1*12
目的建立一种人白细胞抗原(HLA)基因分型方法.方法用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法,对1份已知HLA-DRB1*12的标本和12份未知型别的临床标本进行HLA-DRB1*12位点检测和分型.结果 12份标本的扩增产物经熔解曲线分析,有3份标本为DRB1*12,产物用离心柱纯化后,直接进行DNA测序,结果证实为DRB1*12阳性.结论 SYBR GreenⅠPCR 操作简便,结果准确,可成为一种HLA基因分型的新方法.
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汉族人多囊肾病1型致病基因突变检测体系的建立及初步应用
目的建立适合筛查汉族人多囊肾病1型致病基因(PKD1)突变的检测体系.方法利用设计的82对引物[8对针对PKD1 5′端多拷贝区的长链聚合酶链式反应(PCR)引物和57对巢式PCR引物,17对针对3′端单拷贝区PCR引物]分别对PKD1的46个外显子进行扩增,扩增产物通过单链构象多态性(SSCP)分析筛检出异常条带后,再经测序确定基因突变位点.利用建立的PCR-SSCP检测体系对汉族人2个常染色体显性遗传性多囊肾病患者家系进行PKD1突变检测,健康献血员为对照.结果用82对PCR引物,可成功扩增PKD1各个外显子区域,并经测序证实为PKD1目的片段.将建立的SSCP-PCR基因突变检测体系,分别从2个汉族人常染色体显性多囊肾病(ADPKD)家系检测出PKD1基因Del 3 bp(G49761-G49763)和C47629T 2个突变,其可分别导致编码产物第3827位缺失谷氨酸(Glu3827)和第3555位丝氨酸,而产生由苯丙氨酸(S3555F)替代的改变.结论本研究建立的PCR-SSCP检测体系,可完成 PKD1各外显子区域特异性扩增,并成功检测出了汉族人2个ADPKD家系基因突变位点,不仅为PKD1基因突变的致病机理研究提供宝贵资料,而且为下一步汉族人多囊肾病的大规模基因突变筛查和临床诊断试剂盒的研制奠定了基础.
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荧光定量逆转录聚合酶链反应检测高苯丙氨酸对2种神经元发育相关基因表达的影响
目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),研究高苯丙氨酸对神经元发育相关基因表达的影响.方法在体外培养3 d的原代胚鼠大脑皮层神经元中,加入高苯丙氨酸诱导12 h,用实时荧光定量RT-PCR方法,检测高苯丙氨酸对胚鼠大脑皮层神经元生长相关蛋白43(GAP-43)和鸟苷酸结合蛋白α1(Goα1)基因的影响.结果胚鼠大脑皮层神经元经高苯丙氨酸诱导,其GAP-43基因表达较正常对照增高2.25倍,Goα1较正常对照降低3.31倍.结论高苯丙氨酸可能通过影响GAP-43和Goα1基因表达,干扰大脑皮层神经元正常生长发育.
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优化聚合酶链反应产物银染测序法鉴定白细胞抗原-DQA1*0102等位基因纯合子
聚合酶链式反应-序列特异引物(PCR-SSP)技术在人类白细胞抗原(HLA)基因分型中被广泛使用.然而,分型过程中常出现"空白基因"而影响整个结果的可靠性.对此,目前多采用DNA测序以确定各等位基因纯合子或存在新突变或结合PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法进行确认[1].我们用PCR-SSP对109名广西巴马县壮族长寿老人和71名对照组进行HLA-DQA1座位基因分型,发现了33个HLA-DQA1*0102/- 个体,经本室优化DNA直接银染测序法[2]测定,确定均为HLA-DQA1*0102/*0102等位基因纯合子,现报告如下.
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序列特异性寡核苷酸探针基因分型在造血干细胞与肾脏移植中的应用
异基因造血干细胞或实体器官移植成功率与人类白细胞抗原(HLA)配型密切相关,因此探讨准确的分型方法对指导临床移植十分重要.本研究应用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)杂交技术对造血干细胞移植、肾移植的供、受者进行HLA分型,并与聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)分型、血清学分型进行比较.
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器官移植中人白细胞抗原分型研究的进展
免疫排斥反应对临床器官移植的成功与否有至关重要的影响.组织相容性抗原--人白细胞抗原(HLA)的不同,可引起免疫排斥反应,它是导致移植物丧失功能的主要原因之一.器官移植HLA配型的方法现已由传统的血清学、细胞学方法,发展到运用聚合酶链式反应(PCR)技术进行基因配型.临床合理运用这些方法进行供受者的免疫学选配,是防止和减轻排斥反应的关键[1].
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套式聚合酶链式反应诊断三日疟原虫感染的临床应用
目的：应用套式聚合酶链式反应（PCR）扩增小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因诊断三日疟原虫感染，以减少三日疟的漏诊和误诊。方法分别提取可疑三日疟患者抗凝血 DNA和对照间日疟、恶性疟患者抗凝血 DNA，以此为模板，用疟原虫属特异性引物进行第一轮扩增；然后以第一轮扩增产物为模板，用4种疟疾的种特异性引物进行第二轮扩增，比较扩增出的18 SSU rRNA基因片段的大小，并对目的片段进行测序鉴定。结果经属特异性引物 PCR 扩增后，3个样本均出现大小约为1200bp 的条带。经种特异性引物 PCR 扩增后，间日疟及恶性疟确诊样本均扩增出相应的120bp 和205bp 特异性条带；可疑患者样本仅在用三日疟原虫种特异性作引物时扩增出144bp 特异条带，与理论值相符，与 Genbank 标准序列对比显示，扩增片段大小及测序结果均完全正确。证实患者感染三日疟原虫。结论利用小亚单位核糖体核糖核酸基因片段三日疟种特异引物进行扩增可以用于诊断三日疟原虫感染。
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套式聚合酶链式反应在疟原虫检测和分型中的应用研究
目的 比较疟疾病例样本套式PCR检测和传统镜检结果,探讨套式PCR在疟疾诊断中的应用价值.方法 采集疟疾患者血样,分别涂制厚、薄血膜用于常规镜检；抗凝血或滤纸血用于提取疟原虫DNA等.按要求设计属种等多套引物,应用套式PCR扩增感染人的4种疟原虫目的基因片段,将检测结果与镜检结果进行比较分析,并对目的片段进行测序鉴定等.结果 259份血样,套式PCR共检测出恶性疟187例、间日疟45例、卵形疟8例和三日疟1例,阴性10例.其中恶性疟阳性检出率高(75.10％),间日疟阳性检出率次之(18.07％),还检测到混合感染血样8份(3.21％).与GenBank标准序列对比显示,扩增片段大小及测序结果均完全正确,显示套式PCR在分型上比传统镜检更客观.套式PCR检测与传统镜检结果比较显示,前者阳性率(96.14％)明显高于后者(90.73％),并且差异具有统计学意义(x2=12.07,P＜0.05).结论 套式PCR法检测疟原虫具有较高敏感性和特异性,且适用于疟原虫混合感染,在疟疾病例诊断和分型方面均具有良好的应用前景.
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1341例疑似肺孢子菌肺炎非 HIV 阳性患者病原学诊断分析
目的：探讨六亚甲基四胺银（gomori’s methenamine silver, GMS）染色镜检法和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）法检测肺孢子菌肺炎（pneumocystis pneumonia, PCP）患者标本的阳性率，为临床提供更有利的实验室支持依据。方法采集1341例疑似 PCP 患者的深部诱导痰或支气管肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage fluid, BALF）标本， GMS 镜检法和 PCR 法相结合检测肺孢子菌，任何一种方法检测阳性，即判断为 PCP。结果共285例诊断为 PCP，其中114例为 GMS 染色镜检法阳性，282例为 PCR 法检测阳性，111例为2种检测方法双阳性，3例为 GMS 染色镜检法单独阳性（均为肾移植术后 BALF 样品），171例为 PCR 方法单独阳性。深部诱导痰标本中，GMS 染色镜检法和 PCR 法阳性检出率分别为5.1%和16.2%（P＜0.05）；而 BALF 标本二者的阳性检出率分别为23.3%和42.2%（P＜0.05）。未知原因发热合并肺炎患者和器官移植后接受免疫抑制剂治疗者有更高的阳性检出率。结论PCR 法检测 PCP 阳性率高于 GMS 染色镜检法，PCR 法检测与 GMS 染色镜检法结合诊断 PCP 对临床具有较高指导价值。
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胃癌患者TYMS、ERCC1基因型在外周血和肿瘤组织中的多态性
目的:检测胃癌(gastric cancer,GC)患者外周血和肿瘤组织中胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthase,TYMS)和切除修复交叉互补基因l(excision repair cross-complementing 1,ERCC1)的多态性,比较各基因型在外周血和肿瘤组织中是否一致.方法:收集43例GC患者术前抗凝外周血及肿瘤组织,将其分为外周血组与肿瘤组织组.应用PCR法和限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)法分别检测外周血与肿瘤组织中TYMS和结果:TYMS和RCC1基因各基因型与GC患者临床病理因素无显著相关(P＞0.05).外周血与肿瘤组织中TYMS基因3R/3R、(2R/2R、2R/3R)基因型检出率76.7％、23.3％,ERCC1基因C/C、(T/T、C/T)基因型检出率为81.3％、18.7％,差别有统计学意义(P＜0.01).结论:GC患者外周血和肿瘤组织中TYMS与ERCC1基因各基因型检出率一致,提示外周血标本可代替肿瘤组织标本对TYMS与ERCC1基因多态性进行检测.
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血管紧张素原基因T174M变异与肝硬化的相关性
目的:研究血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)基因T174M分子变异与肝硬化的关系.方法:提取正常人64例和肝硬化患者65例白细胞基因组DNA,通过PCR、限制性片段长度多态性和测序等技术,观察AGT基因型在肝硬化组和正常组分布的差异.结果:AGT基因T174M位点MT和TT基因型的频率在正常组和肝硬化组分别为82.8%、17.2%和84.6%、15.4%,两组之间不存在差异(x2=0.077,P＞0.05).结论:血管紧张素原基因T174M变异与肝硬化没有显著关系.
