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2012-2017年天津市百日咳鲍特菌耐药情况分析
目的 了解2012-2017年天津市百日咳鲍特菌菌株对抗生素敏感性的分布情况及耐药位点变异情况,为百日咳防治提供依据. 方法 以2012年2月至2017年7月天津市分离的18株百日咳鲍特菌菌株作为研究对象,采用纸片扩散法对培养的阳性菌株进行红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、左氧氟沙星及克林霉素敏感性进行检测,同时采用E-test法检测菌株对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、左氧氟沙星及复方新诺明的敏感性;对红霉素结合区域23S rRNA domain V基因片段进行扩增、序列测定及分析. 结果 纸片扩散法结果显示,18株菌株中仅1株对5种抗生素均敏感,其余17株对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素及克林霉素均耐药,红霉素耐药率高,达94.44％(17/18),18株菌对左氧氟沙星均敏感;E-test法结果显示,仅1株菌对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素的低抑制浓度(MIC)在敏感范围内,其余17株对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素的MIC均＞256 μg/ml,18株菌对左氧氟沙星的MIC为0.19～0.38 μg/ml,复方新诺明的MIC为0.047～1.500 μg/ml;23S rRNA扩增产物序列分析发现,17株菌发生A2047G位点突变. 结论 纸片扩散法和E-test法对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素和左氧氟沙星的耐药结果完全符合, 17株菌对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素同时耐药,耐药株23S rRNA序列均发生A2047G红霉素耐药位点改变.
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陕西省西安市及周边地区百日咳鲍特菌抗原基因型别的研究
目的 了解西安市及周边地区百日咳鲍特菌(Bp)5种疫苗相关抗原基因(ptxA、ptxP、prn、fim3和fhaB)的型别分布.方法 对2012-2014年西安市儿童医院患儿350份鼻咽拭子(NPS)标本进行BP的IS481和Ptx-pr基因检测,对双基因阳性的NPS标本进行5种疫苗相关抗原基因的扩增和测序,并与分离菌株的测序结果进行验证;分析5种抗原基因扩增的敏感性和特异性.结果 从350份NPS的190份(54.3％)中成功扩增5种基因并测序;ptxA、ptxP、prn tim3 fhaB扩增成功率分别为56.0％、61.1％、63.1％、60.0％、57.4％,其敏感性分别为67.3％、73.5％、76.0％、72.2％、69.1％,特异性均为100％.ptxA和fhaB分别只有一种基因型,ptxA1和fhaB1;ptxP、prn 、fim3分别以ptxP1、prn1 、fim3-1为主.菌株测序结果与相应NPS的测序结果一致.结论 可以直接从Bp DNA阳性的NPS中进行主要Bp抗原基因型别分析,西安市及周边地区Bp基冈型组合以ptxA1/ptxP1/prn1tim3-1/fhaB1为主.
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百日咳鲍特菌双目标基因荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立及应用
目的 建立以百日咳鲍特菌重复插入序列(Insertion Sequences 481 and 1002,IS481,IS1002)双目标基因检测为特点的荧光定量聚合酶链反应(Polymease Chain Reaction,PCR),用于检测百日咳鲍特菌核酸,探讨在百日咳鲍特菌诊断中的应用意义.方法 针对百日咳鲍特菌的重复IS481及IS1002基因保守区域设计特异性引物、羧基荧光素与小沟结合基团(5-CarboxyFluorescein-Aminohexyl Amidite-Minor Groove Binder,TaqMan-MGB)荧光探针,做为双目标基因检测、筛选并优化荧光定量PCR反应体系与反应条件,并通过体外克隆技术建立百日咳鲍特菌双目标基因定量分析模型.结果 引物与探针的优化浓度分别为600毫摩尔/升(mmol/L)和200mmol/L,与其他呼吸道菌均无交叉反应,具有良好的特异性.应用重组质粒绘制的标准曲线循环阈值(Cycle Threshold,Ct)与模板浓度具有良好的线性关系,方法检测灵敏度为102拷贝/微升(Copies/μl),标准曲线线性范围为103～107 Copies/μl.用荧光定量PCR检测50例百日咳病例标本,阳性45例,包括PCR方法检测阴性5份.结论 建立的双目标基因实时荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,为百日咳鲍特菌的早期快速检测提供了技术支持.
关键词： 百日咳鲍特菌 双目标基因 荧光定量聚合酶链反应 -
百日咳鲍特菌红霉素耐药性及耐药相关分子特征分析
目的 分析百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis,Bp)红霉素耐药性并对其耐药相关分子特征进行检测.方法 对分离自西安市2014年百日咳报告病例中的Bp通过E-Test检测其红霉素耐药性,通过聚合酶链反应(PCR)和PCR-测序方法分别检测可能出现的耐药基因及耐药相关位点改变.结果 10株Bp临床株分布于西安市6个区县,对红霉素的小抑菌浓度(MIC)均＞256μg/ml,所有菌株都出现23S rRNA基因的A2047G突变,未见其他耐药基因及位点改变.结论 西安市的红霉素耐药Bp已较为普遍,23S rRNA基因的A2047G突变可能是其主要的耐药机制.应在百日咳监测的同时加强病原的抗生素耐药性监测及耐药相关分子的检测.
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中国百日咳鲍特菌血清型及其相关基因分析
目的 了解我国1955-2005年临床分离百日咳鲍特菌及疫苗株的血清型及其相关基因特征.方法 应用抗菌毛蛋白2(fim2)和3(fim3)单克隆抗体凝集反应分析我国不同时期分离的80株百日咳鲍特菌株和3株疫苗株的血清型,并与相应的多克隆抗体方法进行比较分析;同时应用PCR方法扩增这些菌株fim2和fimd基因,并对这些PCR产物进行DNA测序分析.结果 研究表明,与多克隆抗体分析结果相比较,单克隆抗体玻片凝集方法和微量凝集反应除一株临床分离株的血清型分析结果不同,其余菌株的结果均一致.研究菌株的血清型分析结果显示17株临床分离菌株和CS与P3S10疫苗株的血清型为fim2&3型、48株菌为fim2型、15株分离菌株与18530疫苗株为fim3型.在我国扩大免疫规划前分离菌株的血清型以fim2型和fim2&3型为主,随着大范围的百日咳疫苗接种,临床分离菌株中fimd型血清型细菌所占的比例逐渐增多.分析菌株中fim2和fimd的基因型以fim2-1(92.5%)和fim3-A(95.0%)亚型为主;18530疫苗株基因型为fim2-2和fim3-A,而其他两株疫苗株的基因型均为fim2-1和fim3-A.在2000年以后,分离出现含有fim3-B和fim3-D亚型菌株,这些结果表明随着我国大范围百日咳疫苗免疫接种,百日咳分离菌株表达的血清型及其基因序列也出现适应性变异.结论 本研究证实了抗fim2和fim3单克隆抗体在百日咳血清型分析的特异性和实用性.对我国不同时期分离菌株和疫苗株的血清型分析,为我国百日咳疫苗株的检定、流行病学和细菌进化的研究奠定了基础.
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百日咳鲍特菌外膜蛋白体外促肥大细胞脱颗粒的作用
目的了解百日咳鲍特菌Ⅰ相菌株外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP)生物学活性与IgE 介导哮喘的关系.方法采用去垢剂处理、DEAE-52和Sephadex G-150层析法制备百日咳鲍特菌Ⅰ相菌株OMP及其组分,以SDS-PAGE估计OMP组分的相对分子质量(Mr).采用ELISA检测百日咳全菌死疫苗诱导动物产生的总IgE和卵白蛋白(ovalbumin,OVA)特异的IgE量.采用肥大细胞脱颗粒试验观察OMP及其组分促进脱颗粒的作用、ELISA检测培养物上清中组胺水平.采用组胺敏感试验检测OMP及其组分增加小鼠对组胺致死敏感性的作用.结果从百日咳鲍特菌OMP中分离获得Mr为(30、32、38和69)×103的4个组分.1～100μg/ml OMP及其组分均未显示凝集鲎变形细胞溶解物的活性.OVA和百日咳鲍特菌联合免疫豚鼠的血清总IgE和OVA特异性IgE较单用OVA免疫有明显增加(t=2.75～6.59;P<0.05～0.01).OMP及其Mr 30×103、Mr 32×103组分有明显的促豚鼠肥大细胞脱颗粒的作用(t=4.914～9.137,P<0.01),但Mr 38×103、Mr 69×103组分无此活性.OMP及其Mr 30×103、Mr 32×103组分处理的上清中组胺水平明显高于阴性对照组(t=5.672～9.304,P<0.01),但Mr 38×103、Mr 69×103组分无此活性.结论百日咳鲍特菌有较强的IgE佐剂活性,某些OMP组分具有促进肥大细胞脱颗粒、组胺释放及增加小鼠对组胺致死敏感性的作用,提示百日咳鲍特菌感染或疫苗接种与IgE介导的哮喘有密切关系.
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72例住院小婴儿咳嗽患者鼻咽部菌群组成研究
目的 探索小婴儿咳嗽患者鼻咽部菌群状况,以及百日咳鲍特菌感染等临床特征与菌群组成的关系.方法 以2015-2017年北京儿童医院新生儿中心收治的患有咳嗽的小婴儿为研究对象,包括百日咳鲍特菌培养确诊百日咳患者24例,以及按1∶2比例选择同期收治的有咳嗽症状但百日咳鲍特菌培养阴性著48例.收集患儿性别、年龄、分娩方式、喂养方式等临床资料,并对其进行呼吸道合胞病毒(RSV)及百日咳鲍特菌检测.提取患儿鼻咽拭子中基因组DNA,扩增16S rDNA的V3 ～ V4区并测序.结果 72例小婴儿咳嗽患者共鉴定出5种菌群分布谱型(C1 ～ C5).24例百日咳鲍特菌培养阳性病例标本有22例检到鲍特菌属的16S rDNA片段.48例鲍特菌培养阴性的病例标本有34例检出鲍特菌片段,丰度为0.003％ ～0.280％.百日咳鲍特菌培养阳性组鲍特菌属平均相对丰度(28.38％)明显高于阴性组(0.03％).RSV阳性组鼻咽部标本中葡萄球菌属和鲍特菌属平均相对丰度显著低于RSV阴性组.结论 除以鲍特菌属为优势的谱型外,本组小婴儿咳嗽患者鼻咽部菌群分布的其他4种型与已知小婴儿期菌群构成相似.有些百日咳患儿可能因鲍特菌属丰度极低,培养方法难以发现.是否RSV感染与小婴儿咳嗽患者鼻咽部菌群组成特征明显相关.
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百日咳鲍特菌23S rRNA位点变异AS-PCR检测方法建立
目的 根据allele-specific PCR(AS-PCR)原理,建立具有良好敏感性与特异性的百日咳鲍特菌23S rRNA位点变异检测方法.方法 基于百日咳鲍特菌23S rRNA A2047G位点突变与其对红霉素耐药的相关性,设计包含特异变异位点的引物进行两阶段PCR反应,根据电泳有无特异大小目的片段的出现,确定百日咳鲍特菌23S rRNAA2047G位点是否有变异.结果 以基因序列测定法为金标准的评价结果显示,AS-PCR法检测突变型菌株的灵敏度为96 ％(144/150),特异度为100 ％(100/100),kappa=0.95(P＜0.01);检测野生型菌株的灵敏度为100 ％(18/18),特异度为100 ％(100/100),kappa=1(P＜0.01).结论 AS-PCR方法检测百日咳鲍特菌23S rRNA A2047G位点变异具有较高灵敏度和特异度,适用于普通微生物实验室开展百日咳鲍特菌对红霉素耐药性的快速检测.
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一株减毒百日咳鲍特菌的构建及生物学特性分析
百日咳是传染性强、感染率高的急性呼吸道传染病,主要感染婴幼儿,是婴儿死亡的主要原因之一.百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)是引起百日咳的主要病原菌.近年来世界各地多次出现百日咳暴发,迫切需研制更加有效的新型百日咳疫苗.本研究构建了一株减毒百日咳活疫苗BPTM1,利用同源重组方法敲除编码百日咳鲍特菌主要毒力因子百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)和皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin,DNT)的基因,并用大肠埃希菌的同源基因置换了负责气管细胞毒素(tracheal cytotoxin,TCT)转运的基因 ampG.通过聚合酶链反应验证毒素及相关基因的敲除和置换,蛋白免疫印迹法检测表明PTX的S1亚基未表达.体外生长曲线和体内定植曲线均表明,相比于野生型百日咳鲍特菌BPMM,减毒BPTM1的生长和定植能力未受影响,其所致肺部病理效应减轻,而所诱导的百日咳鲍特菌特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体保持高水平.本研究表明,减毒百日咳鲍特菌BPTM1有可能成为百日咳候选疫苗.
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百日咳鲍特菌BP283基因的实时荧光定量PCR检测方法的建立
目的 探讨检测百日咳鲍特菌BP283基因片段的有效方法.方法 以百日咳鲍特菌BP283序列为目的基因,设计探针和引物,构建质粒标准品；建立FQ-PCR体系,优化反应条件,并进行方法学评价.结果 成功构建了重组质粒pCR2.1-BP283；建立了检测BP283基因片段的FQ-PCR方法:标准曲线相关系数为0.998,低检测浓度为102 copies/μL,对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线,批内及批间变异系数均＜4％.结论 FQ-PCR方法可成功检测百日咳鲍特菌BP283基因,该方法具有敏感性好、特异性高及重复性好等优点.
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在临床实践中再认识百日咳
近年来百日咳受到了越来越多的关注.国内报告病例数可能没有反映百日咳的真实流行情况.既往执行的疫情监测中使用的诊断标准对临床实践的指导意义有限.现分析当前临床实践中百日咳诊断方面存在的问题,鼓励临床医师积极开展广泛深入的研究,对可疑患者及时进行实验室检测以明确诊断,在临床实践中全面认清百日咳.
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广东省1株百日咳鲍特菌分离株的全基因组测序分析
目的 了解2017年广东省1株百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)分离株的基因特征.方法 对2017年广东省百日咳杆菌分离株(BP_GD2017)进行全基因组测序,分析这株菌的ptxS1、prn、fim2 、fim3等主要抗原基因,并与我国的百日咳杆菌疫苗生产株CS株的抗原基因序列以及GenBank中收录的百日咳基因序列进行比较分析,同时应用wg-SNPs方法与NCBI上获取的31株国内外百日咳杆菌的基因组进行遗传进化分析.结果 广东分离株BP_GD2017的基因组大小为3.64 MB,G+C含量67.74％,rRNA操纵子3个,分别是5S、16S和23S,46个tRNA,基因组结构和特征与我国疫苗生产株CS株以及其他地区和时间分离的百日咳杆菌基因组相似.分离株的ptxS1基因为A型、prn基因为2型,均与我国疫苗生产株CS株不同,fim2和fim3基因的氨基酸序列与我国疫苗生产株CS株同源性为100％.wg-SNPs基因进化显示与我国疫苗生产株CS株在不同的进化分支,而与近年来流行的其他地区(美国、英国、荷兰和挪威等地)分离株处于同一进化分支.结论 广东省这株百日咳分离株与我国疫苗生产株CS株的主要抗原基因序列存在一定变异,遗传进化分支选择也出现了改变,通过比较分析不同国家或地区的分离株,可以从基因组水平上更加准确地分析基因重组、突变和进化,可以为制定百日咳疫苗免疫策略以及新型无细胞百日咳疫苗的研发提供支撑.
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环介导恒温扩增技术在百日咳鲍特菌检测中应用研究进展
核酸扩增技术是病原微生物检测的重要武器,其中聚合酶链反应(PCR)技术已经在临床检验中广泛应用.与PCR 相比,环介导恒温扩增(LAMP)技术具有操作简便,快速灵敏,对仪器和样本质量要求低等优点,尤其适合病原微生物的即时检验.
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新型百日咳疫苗研究进展
百日咳(whooping cough)是一种由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)感染所引起的急性呼吸道传染病,严重时可导致婴幼儿死亡.近年来百日咳的复发流行表明,百日咳的防控效果不理想,现有疫苗的保护力衰减是其重要的原因,亟需研发新型百日咳疫苗.现从不同研发角度对加强免疫、提高产能和优化工艺以及对全细胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccine,wP)、无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,aP)的改进,新抗原来源形式、应用新运送系统、新佐剂的新型百日咳疫苗作一概述.
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百日咳呼吸道感染模型的研究进展
百日咳呼吸道感染模型是研究百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)致病机制及百日咳疫苗评价的重要手段.人是百日咳鲍特菌的唯一自然宿主,由于受伦理学限制及志愿者重症感染等风险,使人百日咳呼吸道感染模型研究受限.近年来,百日咳呼吸道感染动物模型取得了明显进展.目前,应用于百日咳研究的动物模型主要包括小鼠、小型猪和狒狒等.现就百日咳呼吸道感染模型在百日咳疫苗临床前研究及有效性评价的进展作一概述.
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百日咳鲍特菌脂寡糖的制备及寡糖结合物在小鼠体内免疫原性研究
目的 提取纯化百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)脂寡糖(lipo-oligosaccharides,LOS),制备百日咳杆菌多糖蛋白结合物,并分析其理化性质及免疫原性.方法 通过改良热酚水法提取百日咳杆菌的LOS,采用酶解法纯化LOS,通过1％冰醋酸水解获得寡糖(oligosaccharides,OS),产物经Tricine-SDS-PAGE及核磁共振氢谱(1 H NMR)鉴定.OS的羟基经1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化后,与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)共价结合,制备多糖蛋白结合物,经Sephacryl S-300层析柱纯化后收集结合物原液,并对结合物的理化性质、抗原性进行分析,采用两种剂量(2.5μg/剂和5.0μg/剂)免疫BALB/c小鼠,分析其免疫原性.结果 纯化后LOS纯度>90％,核磁共振结果表明OS结构正确,功能基团得到保留.制备的结合物抗原性未发生改变,经3针免疫后,两种剂量下结合物均有剂次加强效应(P<0.05),且两者差异无统计学意义(P>0.05).结论 将百日咳杆菌OS与TTAH结合是制备百日咳杆菌多糖蛋白结合疫苗的可行途径,并且结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答.
