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改良Chelex-100快速提取白色念珠菌DNA作为PCR扩增模板方法
目的:旨在找到一种快速简便提取白色念珠菌DNA的方法.方法:用改良Chelex-100法和离心柱型酵母基因组DNA提取试剂盒分别提取白色念珠菌DNA,对提取结果进行了紫外分光光度比较及聚合酶链式反应的比较鉴定,且对两种方法提取的DNA保存1月、2月、4月后,经聚合酶链式反应比较稳定性有无差异.结果:用改良Chelex-100法提取的白色念珠菌基因组DNA纯度低于离心柱型酵母基因组DNA提取试剂盒法,差异有统计学意义(P=0.000),而两种方法提取DNA的浓度差异无统计学意义(P=0.241).经聚合酶链式反应鉴定,两种方法均可得到明亮、清晰的特异性扩增条带,且DNA经过1月、2月、4月保存后聚合酶链式反应无差异.结论:改良Chelex-100可满足白色念珠菌PCR特异性扩增的需要,具有灵敏、快速、简便、经济的优点,适合白色念珠菌的普查性检出.
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影响PCR-RFLP的相关因素
限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, PCR-RFLP)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又称无细胞分子克隆技术.它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增.扩增后,将PCR产物直接酶切、电泳、显色,即可对目的基因进行分类分型.现将我做PCR-RFLP的体会简要陈述如下.
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细胞色素P4501A1基因多态性与哈萨克族食管癌的易感性研究
目的:探讨细胞色素P4501A1(CYP1A1)基因多态性与哈萨克族食管癌易感性的关系.方法:选取新发哈萨克族食管癌患者64例及同地区非食管癌患者116例做对照,收集血样后,采用聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测CYP1A1基因多态性.结果:食管癌组与对照组无明显差异,χ2=1.31,p=0.52,没有统计学意义(P＞0.05).结论:CYP1A1基因多态性与哈萨克族食管癌的易感性无关.
关键词： 细胞色素P450 基因多态性 食管癌 聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性 -
急性脊髓损伤后胶质细胞源性神经营养因子的表达变化
胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)[1]是迄今为止所发现的对脊髓运动神经元营养活性强的神经营养因子.为进一步了解GDNF基因在急性脊髓损伤后的表达规律,笔者应用Allen坠击脊髓损伤模型,采用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、原位杂交等技术,观察GDNF在损伤脊髓中的分布,并半定量分析急性损伤期脊髓组织中GDNF表达水平的变化.
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沙眼衣原体的快速分型及其临床应用
为建立一种快速进行沙眼衣原体(CT)基因型分型方法,并将其用于证实母婴间存在CT垂直传播的研究,对73例孕妇及其新生儿采用聚合酶链式反应(PCR)结合限制性片段长度多态性(RFLP)分析方法进行CT的检测及分型.结果在较短时间便确定了CT的基因型,证实母婴间存在CT的垂直传播.提示PCR-RFLP分析法为一种敏感快速检测CT基因型的方法,并证明CT有较高的母婴垂直传播率
关键词： 沙眼衣原体 聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性 -
新生儿尿液快速聚合酶链式反应法性别鉴定
本文应用尿液聚合酶链式反应法(PCR)作新生儿快速性别鉴定.50例新生儿尿液PCR表明,男性(30例)均出现446bp的Y染色体特异性DNA扩增片段,女性(20例)则无.经电脑光盘检索,本研究尚属世界首报.
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人类K-ras基因突变质控品的建立
目的:建立人类K-ras基因突变质控品,用于K-ras基因突变检测试剂盒的注册检测工作.方法:根据人类K-ras基因序列设计引物,通过定点突变技术引入突变位点,将获得的PCR产物与克隆载体连接,转化感受态细菌后筛选阳性克隆,获得了包含不同突变位点的重组质粒,建立了人类K-ras基因突变质控品.结果:对人类K-ras基因突变质控品进行序列测定,并将测序结果进行BLAST比对,结果表明成功建立了人类K-ras基因突变质控品.结论:建立的K-ras基因突变体质控品包括常见的Kras基因12密码子突变类型,可以用于指导Kras基因突变检测试剂盒的注册检验工作.
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使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究
目的:建立药材DNA快速提取方法.方法:使用碱裂解缓冲液提取药材DNA,考察提取液配方组成和中和剂种类对药材DNA纯度、浓度的影响.利用优化提取液提取了144个中药材DNA,动物药使用CO Ⅰ、植物药使用psbA-trnH通用引物进行PCR扩增.结果:0.5 mol·L-1氢氧化钠、1％ PVP和1％ Triton×100具有佳的DNA提取效果.对144个中药材进行PCR扩增,利用琼脂糖凝胶电泳可检测到123个中药材DNA的PCR产物.碱裂解法可用于快速提取蛇类药材DNA,并成功用于乌梢蛇、金钱白花蛇的分子鉴定.结论:优化的碱裂解法可用于提取中药材基因组DNA,其提取时间可控制在10 min左右,且避免了酚、三氯甲烷等对人体有毒试剂的使用,对药材快速分子鉴定体系的建立将发挥重要作用.
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中药DNA分子鉴别标准研究方法
在中药DNA分子鉴别标准复核时发现一些标准研究的重点放在了标准的方法学验证,而对一些足以影响标准科学性的因素在起草说明中却缺乏必要的阐述,包括中药物种名称与范围、样品采集、引物设计,以及标准的内容等.本文对物种多样性以及中药DNA分子鉴别标准研究方法与内容进行了探讨,提出了中药基原物种、近缘种以及伪品的特定DNA序列的比较研究才是中药DNA分子鉴别标准是否科学的关键,通过规范的实验设计,避免假阴性或假阳性的检验结果.希望通过标准研究的规范性和在实践中的不断完善,为我国开展中药DNA分子鉴别标准研究提供参考和借鉴.
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大鼠脊髓损伤后白细胞介素-10、肿瘤坏死因子-α基因表达的变化
目的探讨大鼠脊髓损伤后白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达的时序变化规律.方法 SD大鼠42只,随机分为7组,采用改良Allen's脊髓损伤打击模型,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定伤段脊髓组织中IL-10、TNF-α mRNA的表达情况.结果 正常脊髓组织内存在IL-10、TNF-αmRNA的表达;脊髓损伤后IL-10mRNA表达逐渐上调,伤后72小时明显上调,168小时达到高峰;TNF-αmRNA伤后1小时表达明显上调并达峰值,高表达持续至损伤后24小时.结论脊髓继发性损伤过程中抗炎性细胞因子与前炎性细胞因子共同存在;脊髓继发性损伤的抗炎治疗应早期进行.
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全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的应用
目的：探讨全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的临床应用。方法：选择2235例住院及门诊收治的肝功能异常病例，分别用化学发光方法检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，用实时荧光聚合酶链式反应(FQ-PCR)方法检测乙肝病毒基因(HBV-DNA)含量，并对结果进行分析。每位患者检测HBsAg与HBV-DNA均采用同一份标本。结果：全部受检标本中，化学发光方法检测HBsAg阳性率为61.34%，显著高于FQ-PCR方法检测阳性率(48.59%)，差异有统计学意义(x2=73.41，P＜0.01)。将化学发光检测HBsAg的结果分成强阳性、弱阳性和阴性3组，不同组间FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性率显著不同，差异有统计学意义(x2=1863.60，P＜0.01)，强阳性组HBV-DNA阳性率为97.31%，显著高于弱阳性组，差异有统计学意义(x2=966.90，P＜0.01)。结论：全自动化学发光分析仪所采用的化学发光方法对筛查乙肝病毒感染效果较好，而扩增仪所采用的FQ-PCR方法对检测乙肝病毒复制及疗效的监测效果更好，二者联合检测可提高乙肝患者的检出率并可对乙肝患者的病情及疗效作出准确判断。
关键词： 全自动化学发光仪 聚合酶链式反应 扩增仪 乙肝表面抗原 乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸 -
多重等位基因PCR技术对中国人5种常见β-地中海贫血突变的快速产前诊断
目的 对中国人常见的CD71-72、CD41-42、CD17→0、IVS-Ⅱ-654C→T和-28A→G等5种β-地中海贫血突变类型进行多重等位基因特异性PCR(MASPCR)技术检测,以证实该方法的可靠性和准确性.方法 利用针对野生型及突变性β-珠蛋白等位基因的特异引物,应用单管MASPCR技术对我国常见的5种β-地中海贫血点突变类型进行产前分子检测.结果 在被检测的8个家庭共24例受试者中,有17例表现为携带至少一种突变类型的杂合子.其中胎儿有1例为β-地中海贫血双重杂合子,5例为杂合子,2例正常.经分娩或流产后基因分析验证,所有结果均与产前诊断一致.结论 MASPCR技术适合于检测β-地中海贫血已知点突变类型,是一种简便、可靠、经济的产前基因诊断方法,具有广阔的优生科学应用前景.
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猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用
目的 建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测.方法 根据已发表的FHV-1 TK基因序列设计合成引物,并以此建立FHV-1的PCR检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证.用建立的方法对15份猫临床样品进行检测.结果 建立的FHV-1PCR检测方法与单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猫细小病毒(FPV)均无交叉反应;可检测病毒小滴度为7 lg TCID50/ml,相应的DNA模板浓度为1.46×102拷贝/ml;FHV 1 DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带.应用该方法从15份猫临床样本中检测出10份FHV-1核酸阳性.结论 建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的感染检测.
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蛙病毒属PCR检测方法的建立及其在甲鱼"红脖子"病病原鉴定中的应用
在GenBank中搜寻EHNV相关序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)的检测方法,扩增蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)410 bp的DNA片段.用该方法从患"红脖子"的甲鱼中分离的病毒毒株(9701株)中扩增出特异性的片段.对扩增产物进行基因克隆、序列测定和序列分析,结果表明该片段和蛙病毒属其他病毒MCP的编码基因同源性都在96%以上,和牛蛙虹彩病毒的基因序列相似性为100%,因此初步判定9701株属于蛙病毒属.
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日本和牛肉真实性鉴别技术研究
建立了鉴别日本神户牛肉真实性的分子生物学检测技术。通过对来源于10个品种的牛的样品的分析,发现了牛生长激素基因第五外显子的品种间多态性位点,并通过比较分析,确定了日本和牛在这些多态性位点的特异核苷酸组合,建立起了日本神户牛肉的分子生物学识别技术。采取了47份市售牛肉对方法进行了验证,证明该方法在应用于国内市场的神户牛肉的真实性鉴别上,具有很好的特异性,可以用于区分日本神户牛肉和国产牛肉以及国内生产的所谓日本黑牛肉。
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急性髓性白血病Fas配体基因的表达及意义
目的:探讨Fas配体(FasL)基因在急性髓性白血病中的表达及意义.方法:应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测54例AML患者骨髓和健康志愿者骨髓中FasL基因的表达.结果:初发组FasL相对基因表达水平为0.334 3±0.032 4,复发组为0.324 1±0.054 3,均显著高于(P＜0.01)正常对照组(0.071 6±0.009 5);初发组与复发组比较差异无显著性(P＞0.05).AML患者治疗后有效者FasL水平显著下降,无效者仍保持较高水平,完全缓解组与正常对照组比较无显著性差异.结论:FasL水平的变化可作为监测治疗反应的一种手段.
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利用IdentifilerTM体系中D21S11基因座对唐氏综合征的预测分析
目的:利用IdentifilerTM体系中D21S11基因座对唐氏综合征进行预测分析.方法:采用法医学DNA亲权鉴定常用的IdentifilerTM试剂盒对5例唐氏综合征病例及4个疑似唐氏综合征病例家庭11个样本进行PCR扩增,扩增产物用ABI 3130 DNA全自动测序仪分型判断.通过计算待测家庭的累积亲权指数确认亲缘关系后,对三体基因座的峰数及峰值面积比进行分析.当STR基因座出现3个等位基因荧光峰,峰值面积比值为1∶1∶1时;或出现两个等位基因荧光峰,峰值面积比为2∶1或1∶2;或出现峰值面积比未达到2∶1/1∶2,但＜0.65或者＞1.8时,预测患有唐氏综合征.结果:D21S11基因座具有高度的多态信息.确诊的5名唐氏患儿的检测结果与染色体结果一致,待测的4个家庭1 1个样本中10个样本检测结果与染色体结果一致,1个样本出现假阴性结果.结论:IdentifilerTM试剂盒中D21S11基因座对唐氏综合征的检测有简便、快速、直接的特点,检验效果较好,但存在假阴性结果,今后研究将扩大样本检测量及21号染色体上检测基因座数量,提高检测准确率.
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温州汉族人群D12S391、D18S865基因座遗传多态性研究
目的研究短串联重复序列D12S391、D18S865的遗传多态性及法医学应用价值.方法应用聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染显带技术对温州地区汉族454名无关个体的D12S391、D18S865位点进行分型.结果D12S391观察到11个等位基因,50种基因型;D18S865观察到7个等位基因,21种基因型.基因型频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡,两个基因座的观测杂合度(H)分别为0.7974、0.7379;个体识别能力(DP)分别为0.9566、0.9077;多态信息含量(PIC)分别为0.8260、0.727 9.结论两个STR基因座具有较高杂合度,等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.5),在法医学应用和群体遗传学研究中较高的价值.
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法医学中的性别鉴定
对用形态学、细胞学、性激素检测、 DNA重组技术和聚合酶链式反应（ PCR）等方法进行性别鉴定进行了概述，显示骨骼的性别鉴定以形态学方法为好；对能获得足够量基因组 DNA的人体组织，好用 PCR检测牙釉基因。而检测性染色质因阳性率较低，检测性激素仅适用于血痕检材， DNA分子杂交技术需要复杂的仪器及放射性同位素标记的探针，这些方法目前已较少应用。
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两种扩增仪对联合毛细管电泳技术的聚合酶链式反应的影响
目的 使用两种扩增仪进行常规扩增和毛细管电泳,观察两种扩增仪对结果的影响以及有何不同.方法 运用PowerPlex试剂盒对DNA在Applied Biosystems 9700和Hema 9700两种扩增仪上进行扩增,扩增包括对血卡进行直接扩增和对提取后的DNA进行扩增,然后在Applied Biosystems 3130XL上进行毛细管电泳检测;使用同一DNA进行5次重复试验进行扩增仪的稳定性检测;使用7种非人样本DNA进行种属特异性检测;运用不同稀释度的2800阳性标准品进行灵敏度检测;对使用两种扩增仪扩增检测后的所有结果进行分析、讨论和评价.结果 使用两种扩增仪进行扩增检测后,其分型结果在两种扩增仪之间没有明显差别,其分型结果均稳定准确且在两种扩增仪上呈现一致性,种属特异性检测结果一致,灵敏度检测结果一致.结论两种扩增仪在进行常规扩增检测时,其结果在两种扩增仪之间没有明显差别,其结果呈现出一致性,两种扩增仪均可应用于常规扩增.
