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乌头霜霉病病原物分子检测方法的建立
目的:建立乌头霜霉病病原菌快速分子检测方法,为乌头种苗检疫及栽培环境土壤安全性评价提供依据.方法:使用真菌DNA提取试剂盒提取病原菌DNA,采用真菌核糖体内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS4,对病原菌的rDNA-ITS区间序列进行扩增,将聚合酶链式反应(PCR)产物回收纯化并进行序列测定,并将测得的ITS序列同GeneBank中搜索到的相关ITS序列进行比较,运用DNAMAN比对出特异序列片段,利用特异序列片段通过Primer Premier 5.0设计并筛选特异性引物,建立乌头霜霉病病原菌快速PCR检测方法.结果:从Primer Premier 5.0设计的8对引物中筛选出了灵敏度高、特异性强的引物对L1 A/L1B,该引物能够从乌头霜霉病病原菌DNA扩增出670 bp的具有检测价值的明亮条带,利用该引物也能够检测出乌头种苗、成株以及栽培土壤是否存在乌头霜霉病原菌.结论:筛选出的引物对L1 A/L1B能够快速、简便、有效地检测出乌头霜霉病病原菌,建立的方法能用于对乌头种苗霜霉病的提前检测或检疫.
关键词： 乌头 霜霉病 分子检测 真菌核糖体内转录间隔区 聚合酶链式反应 -
哈蟆油药材基因组DNA提取方法的比较
目的:建立一种适合于哈蟆油药材基因组DNA的提取方法,为该药材的后续分子鉴定奠定基础.方法:采用十二烷基硫酸钠(SDS)法,改良SDS法,Chelex-100法,异硫酸氰胍(GuSCN)法,试剂盒法及改良试剂盒法提取哈蟆油基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法及细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)序列的引物聚合酶链式反应(PCR)扩增对DNA产量及质量进行检测.结果:Chelex-100法,改良SDS法,GuSCN法及改良试剂盒法均能从哈蟆油药材中提取得到基因组DNA,SDS法和试剂盒法提取不到.其中改良SDS法得到的DNA质量良好,得率高,但操作繁琐;改良试剂盒方法得到的DNA质量较好,但得率低,成本高;Chelex-100法操作简单快速、得率高,但得到的DNA质量较差;GuSCN法提取的DNA含有较多杂质,会抑制PCR反应.结论:Chelex-100法、改良SDS法及改良试剂盒法均可得到满足PCR扩增要求的DNA,实践中可根据条件选择适宜方法来提取哈蟆油基因组DNA.
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乌头汤加半夏不同炮制品对大鼠CYP3A的影响
目的:以乌头汤为载体,研究加入半夏不同炮制品后对大鼠细胞色素P450酶系(CYP) 3A1/2的影响,为阐述“十八反”中半夏反乌头的反性内涵提供实验依据.方法:CYP3A酶活性采用体外温孵法和体内探针法进行检测,酶蛋白和mRNA表达采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)和荧光定量聚合酶链式反应技术进行检测.结果:与乌头汤加生半夏组相比,乌头汤加法半夏各剂量组6β-羟基睾酮(6β-OH-Tes)生成速率未发生显著性变化,CYP3A蛋白表达显著增加(P ＜0.01,P ＜0.05),CYP3A1 mRNA的表达仅在0.60 g·kg-1剂量组显著降低(P＜0.01);乌头汤加姜半夏在1.20 g·kg-1剂量组时6β-OH-Tes生成速率极显著降低(P＜0.01),CYP3A蛋白表达仅在0.60 g·kg-1剂量组明显增加(P＜0.05),CYP3A1 mRNA的表达在0.60,1.20 g·kg-1剂量组有显著降低(P＜0.01);在体内探针法试验中乌头汤加法/姜半夏组6'-羟基丁螺环酮(6'-OH-BP)和丁螺环酮(BP)的药时曲线下面积(AUC0.t)比值(6'-OH-BP/BP),1-(2-嘧啶基)哌嗪(1-PP)与BP的AUCo-t比值(1-PP/BP)均未发生明显变化.结论:不同半夏炮制品增强乌头汤对CYP3A的抑制作用的程度不同,这将会导致乌头汤中的双酯型生物碱类成分(如乌头碱)代谢减慢,从而引起药理作用的增强或毒性的增加.
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威灵仙一种新伪品的生药学和分子生药学鉴别
目的:运用生药学和分子生药学研究思路和方法,对市场上一种威灵仙新伪品进行鉴别,为保障威灵仙药材的安全使用提供实验依据.方法:对威灵仙及其伪品进行性状、显微等生药学研究,描述威灵仙及其伪品的生药学鉴别特征.对威灵仙及其伪品的分子生药学研究,通过试剂盒提取样品的DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增及双向测序获得其内转录间隔区(ITS)序列,根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中已收录的ITS序列进行相似度分析及DNA条形码溯源.结果:威灵仙及伪品的生药学鉴别特征主要有外皮颜色以及有无茎节等;横切面显微特征区别主要为有无髓.分子生药学研究表明,该伪品的基原植物为紫金牛科紫金牛Ardisia japonica.结论:该威灵仙伪品为綮金牛的茎及根茎,该伪品与威灵仙在成分、功能主治方面差别较大,在临床应用上应严格区分.
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雷公藤TwCYP88A1基因全长cDNA克隆与表达分析
目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆TwCYP88A1基因.方法:采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤TwCYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱.结果:TwCYP88A1 cDNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 kDa,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点.植物组织表达分析表明TwCYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量高,根中低.结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到TwCYP88A1基因全长cDNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础.
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应用5S rRNA基因间隔鉴定川西獐芽菜和同属混淆品种
目的:采用5S rRNA间隔序列分析区分川西獐芽菜和常见同属植物混淆品种抱茎獐芽菜,华北獐芽菜及印度獐牙菜.方法:提取獐芽菜属被测样品的DNA,使用PCR扩增5S rRNA基因间隔片段,测定及比较各品种的序列.结果:川西獐芽菜和其余3种混淆品獐牙菜属植物之间DNA的5s rRNA基因间隔序列不同,差异范围为30.6%～65.0%.结论:5s rRNA基因间隔序列可以作为分子鉴定标记区别川西獐芽菜和同属其他常见混淆品种.该方法为獐芽菜属植物的鉴定提供可靠,简便的参考依据.
关键词： 川西獐芽菜 獐牙菜属 5S rRNA基因间隔 聚合酶链式反应 -
基因芯片技术研究清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠基因表达谱的影响
目的 研究清胰汤(Qingyi Decoction,QYD)对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠胰腺组织基因表达谱的影响.方法 60只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、SAP组和QYD组,每组20只.4％牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射复制SAP模型,QYD组3次灌胃治疗(0.75 mL/100g).Illumina全基因组表达谱芯片分析胰腺表达谱变化,实时定量PCR和Western blot验证芯片部分基因热休克蛋白a8 (heat shock proteins a8,Hs pa8)、热休克蛋白b1 (heat shock proteins b1,Hspb1)及其蛋白表达.结果 与SAP组比较,QYD组筛选出575个差异基因,其中上调92个,下调483个.基因本体论(Gene Ontology,GO)分析涉及到转录调节因子活性负调节、氧化还原酶类活性、酶抑制剂活性等.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库分析其主要涉及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、NOD样受体(NOD like receptors,NLR)信号通路、细胞周期、代谢通路、氧化还原酶类活性等.PCR和Western blot验证芯片中Hspa8和Hspb1相对mRNA表达分别升高(13.24±1.22)倍和(7.55±1.09)倍(P＜0.01).结论 QYD有效治疗实验性SAP机制涉及到MAPK信号通路、NLR信号通路、细胞周期、代谢通路、氧化还原酶类活性等.
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一株具有急性致瘤特性的马立克氏病病毒的分离与鉴定
应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从免疫过CVI988/Rispens疫苗株患马立克氏病(MD)的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV)(命名为YL040920株).从该分离株蚀斑克隆获得的9个克隆在蚀斑形成时间及其形态大小上均无明显差别,表明它较为单一;应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,发现其序列具有MDV-1强毒株的特征;用基于抗MDV-1 MEQ蛋白的单克隆抗体3G12E6的免疫荧光试验(FA)对毒株的DEF培养物进行检测,发现有特异性的荧光定位于细胞核内;应用毒株感染霞烟鸡,早在接种后(PI)21d即可诱发明显的内脏器官,在各器官肿瘤中以心脏、肝脏和皮肤的肿瘤发生率高;用禽肿瘤病三重PCR鉴别诊断技术对毒株的DEF培养物以及感染鸡的内脏器官组织进行检测,均能扩增到MDV-1强毒株的特异性带,而网状内皮增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)的检测则均为阴性.研究的结果表明,分离株YL040920为单一的MDV-1强毒株,无REV、ALV以及疫苗株CVI988/Rispens的混杂,并具有以心脏、肝脏和皮肤肿瘤为主的急性致瘤特性.
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尖锐湿疣病变的人乳头瘤病毒6型L1序列多态性分析
采用PCR方法从协和医院尖锐湿疣患者皮损中检测人乳头瘤病毒(HPV),并通过限制性片断长度多态性分析分型发现,HPV6型为主要感染型别,其次是HPV11型.根据临床特征选择主要致病型HPV6 8个分离株,扩增L1晚期基因,构建重组测序质粒,双脱氧法测序并分析L1区的核苷酸和氨基酸序列变异状况.结果表明,HPV6L1基因序列发生碱基替换的区域主要有四个区,包括SR1(5911～6104),SR2(6217～6273),SR3(6540～6661)和SR4(7062～7250).少数的碱基替换导致错义突变,推导的蛋白质一级结构中有0～3个氨基酸发生变异,但抗原性强弱与原型HPV6基本一致.
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鹅细小病毒主要免疫原性蛋白基因的克隆与序列分析
利用PCR技术,从纯化鹅细小病毒SYG99-5毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒主要免疫原性蛋白基因.将该PCR扩增片段克隆入pGEMR-T质粒载体的HincⅡ和SacⅠ位点之间,酶切分析筛选并进一步通过Southern杂交验证后,获得含1.6kb基因片段的重组质粒GpG3.序列测定结果表明,该片段与国外已报道的GPV B株苷酸序列有96%的同源性,氨基酸序列有97%的同源性.
关键词： 鹅细小病毒 聚合酶链式反应 VP3基因 Southern杂交 重组质粒 -
检测中国对虾非包涵体型杆状病毒的PCR方法的建立
中国对虾非包涵体型杆状病毒(PcNOBV)是中国大陆养殖的中国对虾(Penaeus chinensis)暴发性流行病--白斑综合征的主要病原,与台湾流行的PmNOBⅢ、泰国的PmNOBⅡ及日本的RV-PJ(＝PRDV)有相似的致病特征、形态学及组织病理学特征.为了解PcNOBV与PmNOBⅢ两种地域分布邻近的毒株基因水平的关系,并建立早期、敏感、特异的检测技术,利用氯化铯密度梯度超速离心技术分离纯化了PcNOBV核衣壳,根据台湾地区分离的PmNOBⅢ的基因序列设计一对引物,从纯化的PcNOBV DNA及自然发病的中国对虾、日本对虾和斑节对虾组织DNA中成功地扩增出长为355bp的目的片段,可检测出3.4pg的PcNOBV DNA.从健康对虾组织提取的DNA未能扩增出目的片段.扩增片段序列与PmNOBⅢ相应的基因序列相同.该结果从分子水平证实PcNOBV与PmNOBⅢ存在基因同源性,同时表明聚合酶链式反应(PCR)可以作为检测PcNOBV的一种敏感、特异、早期、快速的诊断手段.
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睫状神经营养因子的cDNA克隆、表达、纯化及其生物活性鉴定
反转录PCR扩增人睫状神经营养因子(human ciliary neurotrophic factor,hCNTF)cDNA后,克隆进pBV220,在大肠杆菌中实现原核高效表达,SDS-PAGE观察到分子量约为24kD的预期表达产物,薄层扫描确定其表达量为26%,制备电泳和凝胶过滤纯化后纯度达到98%,生物活性分析表明,表达产物能刺激10日龄鸡胚背根神经节细胞的生长,促进CFU-GM的增殖.
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应用聚合酶链式反应鉴定实验细胞的来源种属
目的 应用聚合酶链式反应(PCR)鉴定常见细胞的种属来源,以判断培养细胞是否存在种间的交叉污染.方法 根据文献报道和NCBI数据库我们得到了32对种属特异性引物,并分别针对10种常见的细胞种属,对这些引物进行特异性和敏感性的筛选;以待检测细胞的基因组DNA为模板进行PCR及后续的琼脂糖凝胶电泳;以不同种属来源细胞的DNA混合物作为阳性对照模板,以水作为阴性对照模板.结果 针对上述10种常见细胞来源的种属分别得到了1对特异性和敏感性均较好的引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后可以准确鉴定待检测细胞的种属来源,并判断该细胞是否存在种间污染.结论 应用聚合酶链式反应可以简便、快速地鉴定实验细胞的种属,并判断该细胞是否存在种间的交叉污染.
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北京市密云县野栖鼠感染田鼠巴贝西虫的检测
针对2012年6月于北京市密云县辖区捕获的15只野栖鼠,检测其巴贝西虫感染状况.通过制备薄血涂片及采集心、肺组织样本提取基因组,结合镜检及聚合酶链式反应确定感染阳性样本,对巴贝西虫核糖体小亚基编码基因虫种特异片段进行扩增并测序,通过序列对比及进化树构建对野栖鼠感染的巴贝西虫进行同源性分析及虫种鉴别.本次检测的野栖鼠中1份社鼠Niviventer confucianus血液镜检阳性,对应的心、肺组织样本检测到巴贝西虫虫种特异DNA片段,同源进化分析表明,该虫株与我国浙江、福建、台湾地区的田鼠巴贝西虫分离株具有高度同源性,属于田鼠巴贝西虫Babesia microti.北京市密云县野栖鼠首次被证实存在感染田鼠巴贝西虫的情况.
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分子工具在寄生虫学研究中的应用
现代分子技术对寄生虫的基础研究和应用研究都有着重要的影响,尤其是PCR相关技术有着更广泛的应用,因为PCR反应能够极其敏感的从少量的寄生虫材料中扩增到所需的DNA片段,另外高分辨率的电泳技术和基因组方法应用也越来越多.本文对核酸技术如聚合酶链式反应、突变扫描技术、指纹技术的发展和应用进行了综述,并着重强调了这些核酸技术在寄生虫方面的用途和潜力.
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大鼠大脑组织中谷氨酸脱羧酶GAD67基因的克隆和序列测定
目的克隆大鼠脑组织中谷氨酸脱羧酶GAD67基因.方法采用RT-PCR方法,大鼠脑组织中的mRNA逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,扩增谷氨酸脱羧酶GAD67基因片段,克隆入T载体,并经序列测定.结果 RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度1795bp相符,T载体克隆测序与大鼠谷氨酸脱羧酶GAD67 100%同源.结论采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的谷氨酸脱羧酶GAD67基因克隆,为该基因的体外表达打下基础.
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绝经妇女骨质疏松症与降钙素受体基因多态性的相关性的初步探讨
目的探讨绝经妇女骨质疏松症与降钙素受体基因多态性的关系.方法用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术检测了45例绝经后骨质疏松症和34例同龄绝经后无骨质疏松症的妇女的降钙素受体基因多态性.结果骨质疏松组降钙素受体基因型CC型为0.822,CT型为0.156,TT型为0.022,对照组CC型为0.824,CT型为0.147,TT型为0.029,两组无差异(p>0.05).结论妇女骨质疏松症与降钙素受体基因型无明显相关性.
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广东汉族绝经后妇女维生素D受体基因的多态性
目的研究广东汉族绝经后妇女维生素D受体基因的多态性分布特点,并与其它地区人群进行比较.方法用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法对62例广东汉族健康绝经后妇女进行维生素D受体基因检测.结果广东汉族绝经后妇女维生素D受体基因频率分布为:B 37.1%,b 62.9%,基因型频率为:B/B 14.5%(n=9), B/b 45.2%(n=28), b/b 40.3%(n=25).结论广东汉族绝经后妇女维生素D受体基因多态性分布与其它地区人群的分布不同.
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石蜡包埋组织DNA快速提取法在分子病理检测中的应用
随着分子生物学的飞速发展,分子生物学技术已在分子靶向治疗、HPV分型检测、淋巴瘤的诊断等方面发挥了极为重要的作用.分子病理检测的首要步骤就是从石蜡包埋组织中提取DNA,常用的DNA提取方法主要有酚-氯仿法、离心柱法等.酚-氯仿法操作复杂,DNA损失较多,并且对人体有害,不适宜用于临床;离心柱法操作较为简便、能够得到较高质量的DNA,是目前临床分子病理DNA提取的主要手段,但其采用蛋白酶K进行组织消化,耗时过长,常需消化过夜.
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恶性疟原虫HRP-Ⅲ基因的克隆及序列分析
目的克隆并测定恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株HRP-I基因序列,比较FCC1/HN株与国外分离株HRP-I基因序列的差异.方法根据HRP-Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增HRP-I基因.通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP-I.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用分子生物学软件进行不同分离株HRP-Ⅲ基因序列的同源性比较.结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株HRP-I基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP-Ⅲ重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因全长802 bp,包含一个内含子,编码224个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的Itg2、FC27及IMTM22株HRP-Ⅲ基因序列有较高的同源性.结论成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因.序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的HRP-Ⅲ基因序列有高度的同源性.
