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3种PCR方法检测低密度恶性疟原虫血症的比较研究
目的 对多重PCR、巢式PCR、实时PCR检测结果进行比较,筛选适合低密度恶性疟原虫血症的检测方法.方法 实验室培养恶性疟原虫,同步化处理至环状体期占99％以上时涂制薄血膜,计数其原始密度.实验分3组,原虫血均按1∶40、1∶80、1∶160、……1∶40 960等11个梯度进行稀释,涂制厚血膜,并用显微镜检查确定低密度恶性疟原虫血症密度；再作倍比系列稀释,用3种PCR方法进行检测,确定各种检测方法的检测限,并进行比较. 结果 经显微镜检查确定配制的待测血样恶性疟原虫密度为21.92个/μl,多重PCR检测限为0.171 3个疟原虫/μl血,实时PCR为0.171 3个疟原虫/μl血,巢式PCR为0.085 6个疟原虫/μl血.检出率巢式PCR≥实时PCR＞多重PCR. 结论 3种PCR方法均可用于检测低密度恶性疟原虫血症.巢式PCR检出率和检测限均优于其他两种方法.
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空调隔尘网尘螨变应原基因检测
目的 检测空调污染隔尘网尘螨变应原的基因种类.方法 采集居民空调隔尘网灰尘样品20份,分别提取总基因组DNA,并以此为模板分别用粉尘螨和屋尘螨1、2、3类变应原基因(ProDer f 1、ProDer p 1、Der f 2、Derp 2、Der f3、Derp 3)特异性引物PCR扩增尘螨变应原基因,PCR产物纯化后连接pUCm-T载体,并转化E.coli DH 5α感受态细胞,涂LB板(Amp+),37℃过夜培养,随机挑取单克隆菌落进行PCR验证,阳性克隆测序并进行序列比对分析.结果 共20份样品,17份检测出螨性变应原基因,同时含有ProDer f 1、ProDer p 1、Der f 2和Der p 2变应原基因6份,其余阳性样品均含有粉尘螨和(或)屋尘螨1、2类变应原基因中的一种或多种.结论 芜湖市区居民空调隔尘网中含有可能引起过敏性疾病的粉尘螨和屋尘螨1、2类变应原.
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宫颈癌患者人巨细胞病毒临床分离株基因序列遗传变异分析
目的 通过对宫颈癌患者人巨细胞病毒(HCMV)临床分离株基因序列遗传变异分析,了解其与宫颈癌之间的相关性,从而为宫颈癌发病机制研究提供理论依据. 方法 从宫颈癌患者的细胞标本中分离HCMV,对其基因进行全长序列PCR扩增,并进行同源性比较. 结果 PCR扩增HCMV基因全长序列分别为568、347、1 472、466和732 bp;测序分析5个基因的突变均由碱基替换所引起,并且UL83基因第18、231位氨基酸的突变位点都是具有诱导CTL抗原决定簇反应能力的表位区,而UL32,UL44,UL137和UL145基因序列具有高度保守性,初步推测UL83基因CTL表位突变情况可能与宫颈癌患者HCMV感染有关联;同源性比较显示,HCMV基因与HCMV AD169株、Merlin株、Towne株同源性为97％～100％. 结论 UL83基因的突变可能是导致HCMV感染的主要原因,且其第18、231位氨基酸的突变位点都是具有诱导CTL抗原决定簇反应能力的表位区,因此认为UL83基因CTL表位突变可能与宫颈癌患者HCMV感染有关联.
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MRSA的SCCmec分型研究及耐药性分析
目的 采用两种方法研究医院临床分离的耐甲氧西林金黄葡萄球菌(MRSA)盒染色体(SCCmec基因型)分布特点及耐药状况. 方法 应用两种多重聚合酶链式反应(PCR)技术对临床分离的65株MRSA进行SCCmec基因分型;普通PCR对MRSA进行5种耐药基因扩增;应用K-B纸片扩散法进行药敏试验. 结果 方法1 SCCmec分型显示,58株MRSA为SCCmecⅢ型,5株为Ⅱ型,另外2株不能分型;方法2 SCCmec分型显示,60株MRSA为SCCmecⅢ型,4株为SCCmecⅣa型,1株未分型.两种方法的分型结果差异无统计学意义(P＞0.05),但各有优缺点.65株MRSA对多种抗生素均耐药,5种耐药基因的阳性率分别为aac(6’)/aph(2'') 93.85％,aph(3’)Ⅲ为52.31％,tetM基因为92.31％,ant(4’)为9.23％,未扩增出TEM基因. 结论 医院分离株MRSA SCCmec基因型以Ⅲ型为主,且具有多重耐药的特征,氨基糖苷类、四环素类耐药基因携带率较高.多重PCR法可以用于大批量临床分离株MRSA的SCCmec分型,但应结合实际选择合适的分型方法.
关键词： 耐甲氧西林金黄葡萄球菌 耐药性 葡萄球菌盒染色体 聚合酶链式反应 -
变性梯度凝胶电泳检测阴道菌群实验方法的建立及优化
目的 建立并优化应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测阴道菌群的技术路线. 方法 2011年5～6月在北京大学肿瘤医院妇科门诊就诊的16名成年女性,其中6名女性取阴道穹隆分泌物,10名女性分别取阴道中段和阴道穹窿部分泌物,提取阴道菌群总DNA,采用巢式聚合酶链式反应扩增细菌16S rRNA基因的V2-V3可变区,DNA扩增产物分别在30％～60％和40％～70％浓度梯度变性凝胶下进行DGGE. 结果 DGGE图像分析显示阴道中段和阴道穹窿分泌物阴道菌群构成相同,平均条带数为2.5,差异无统计学意义(P＞0.05).变性凝胶浓度梯度为30％～60％时,阴道菌群的DGGE图像中各条带较分散,易于条带识别和分析,但有部分条带电泳出凝胶范围;变性凝胶浓度梯度为40％～70％时,阴道菌群的DGGE条带密集但均较清晰. 结论 巢式聚合酶链式反应与DGGE相结合具有高效、快速、精确的特点,可用于阴道菌群检测.
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用PCR检测隐孢子虫
隐孢子虫(Cryptosporidium)是Tyzzer于1907年首先在实验小鼠胃肠道内发现的一种能广泛感染脊椎动物的寄生原虫。该虫已被公认为人和动物腹泻的重要病原体，是引起三大肠道病病原体之一，已受到国内外学者的重视。在发达国家与发展中国家腹泻病人中，隐孢子虫感染率分别为0.6%～7.3%与3%～13%。国内1986年陈义民等在兰州犊牛中首次发现隐孢子虫，次年韩范等在南京首次发现人体病例［1］。此后许多地区均报道有隐孢子虫感染。该病多发于免疫抑制的患者，而免疫功能正常虽无临床症状者但也能够排出卵囊，污染环境。更要注意的是隐孢子虫卵囊在自来水中存活率很高，在1993年正是隐孢子虫污染了饮用水，造成美国的Milnoukee暴发400 000人的大流行［2］。1995年报道小剂量(50%感染剂量ID50为132个卵囊)的卵囊足以引起血清呈阴性的健康自愿受试者感染［3］。由于隐孢子虫形体小，对恶劣环境有较强的抵抗力，无特异性染色，光镜下缺乏明显特征，少量卵囊足以使人感染，因而建立一种敏感性高、特异性强的的检测方法是当前隐孢子虫病防治和流行病学调查研究工作迫切需要解决的问题之一。近年来发展起来的聚合酶链式反应(PCR)技术，有快速、简便、准确、高度敏感与高度特异等优点。Laxer等［4］和Webster等［5］先后将该技术成功地应用于隐孢子虫检测，为建立敏感性高、特异性强的隐孢子虫检测方法开辟新途径。本文就当前在检测隐孢子虫中所使用的PCR方法综述如下。
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呼吸道感染腺病毒基因分型研究
目的 人腺病毒是引起急性呼吸道感染的常见病原体,采用PCR法对人腺病毒进行分型鉴别可为人腺病毒感染的防治提供可靠依据.方法 采集急性呼吸道感染患者咽拭子标本,提取DNA,采用PCR法对其进行基因分型分析.结果 以500 bp作为DNA分子质量标准对待测标本PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳,46份标本中21份鉴定为腺病毒通用型(扩增片段300 bp),1、2、3、4、7、21型分别有3、8、1、15、2、2份(扩增片段分别为396、393、316、305、305和507 bp).结论 本院急性呼吸道感染患者感染的腺病毒以通用基因型、基因4型和基因2型为主.及时检测流行腺病毒型别及其发展规律,可为呼吸道感染类疾病的临床治疗以及防控提供指导.
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感染性心内膜炎链球菌耐药基因检测与分析
目的 通过分析感染性心内膜炎链球菌的耐药基因,以便有效控制链球菌耐药性的进一步发展,从而为感染性心内膜炎的治疗提供依据. 方法 从感染性心内膜炎患者血培养标本中分离链球菌,提取DNA,采用PCR方法检测耐药基因,并作测序分析. 结果 PCR检测链球菌9种耐药基因,其中gyrA、parC、tetM基因扩增均阳性,且同源性较高.所有菌株的tetM基因同源性均为100％.有3株发生突变,突变位点分别为81位、87位和79位,且突变株均对氟喹诺酮类抗菌药物耐药.链球菌耐药基因编码氨基酸序列比对图显示,gyrA第81位由丝氨酸(Ser)突变为精氨酸(Arg),parC第87位由精氨酸(Arg)变异为亮氨酸(Leu),parC第79位由丝氨酸(Ser)突变为苯丙氨酸(Phe),因而可能导致耐药性的产生. 结论 分离自感染性心内膜炎患者的链球菌含有gyrA、parC、tetM基因,这3种基因可能与链球菌的耐药性有关.
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中国-哈萨克斯坦边境阿拉山口口岸鼠体蚤及游离蜱感染巴尔通体调查
目的 对中国-哈萨克斯坦(中哈)边境阿拉山口口岸地区捕获的野生鼠类体表寄生蚤与游离蜱进行巴尔通体核酸检测,为该地区鼠传疾病提供风险预警和依据.方法 于2016年1-9月采集鼠类体表蚤及游离蜱,进行形态学鉴定,提取蚤类全基因组,采用PCR扩增巴尔通体gltA、ITS和ribC基因,阳性产物进行Blast分析,利用Mega 6.0软件构建分子遗传进化树.结果 共采集蚤2 139匹,隶属于6属7种,其中臀突客蚤为优势蚤种;采集游离蜱243只,均为亚洲璃眼蜱.其中臀突客蚤、叶状切唇蚤突高亚种和后弯怪蚤均检测到巴尔通体DNA片段,蜱中未检测到巴尔通体阳性片段.通过测序得到3株不同基因的巴尔通体序列,gltA、ITS和ribC的DNAman同源性分别为93.61％、52.54％和86.72％.Blast比对和进化树分析结果与Bartonella sp.AL01、02、04相同.结论 中哈边境阿拉山口口岸地区3种鼠体寄生蚤均携带巴尔通体.
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PCR方法快速检测炭疽芽孢杆菌
目的:快速检测炭疽芽孢杆菌.方法:质粒提取及PCR扩增.结果:用两对引物扩增,阳性样本可分别扩出两条877 bp和1 089 bp左右的条带,阴性样本未扩增出.结论:所采用的方法可快速检测出环境中的炭疽芽孢杆菌,并可对其致病性进行评价.
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湖北省随州市2016年3例布鲁氏菌病流行病学调查及菌株鉴定
目的 对湖北省随州市就诊的3例疑似布鲁氏菌病(布病)患者进行个案调查,并对分离的3株疑似布鲁氏菌鉴定分型.方法 应用布病流行病学调查表进行现场调查,采用布鲁氏菌常规鉴定分型方法和噬菌体裂解试验进行检测,并比较BCSP31-PCR法(以布鲁氏菌属特异基因BCSP31为靶基因的检测方法)、AMOS-PCR(根据电泳条带鉴别布鲁氏菌牛种1、2、4型、羊种布鲁氏菌、猪种l型、绵羊附睾种)及实时荧光定量PCR 3种分子分型种型鉴定方法.结果 3例患者均由密切接触病畜及其肉制品感染,常规检测方法鉴定为羊种布鲁氏菌3型,多种PCR方法检测获得同样结果.结论 经常规和PCR鉴定分型研究确定,随州市布病病例分离株为羊种布鲁氏菌3型.
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汉坦病毒76-118株与R22株基因重排的实验研究
目的:研究汉坦病毒汉滩型与汉城型之间能否发生基因重排,以及发生重排的频率和特点.方法: 用汉坦病毒汉滩型(HTNV)76-118株与汉城型(SEOV)R22株混合感染Vero-E6细胞,空斑形成实验挑取子代克隆株24株,传代培养后用PCR方法鉴定.结果:发现24株子代病毒(70.83%)的基因组来自76-118株或R22 株;1株(4.17%)HTNV型与SEOV型引物扩增均为阳性;1株(4.17%)两型病毒引物扩增均为阴性;4株 (16.67%)发生了基因片段重排.结论:证实了汉坦病毒HtTNV与SEOV之间可以发生重排.
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中国-哈萨克斯坦边境阿拉山口口岸地区凶小库蚊中首次检测到沃尔巴克氏体
目的 调查中国-哈萨克斯坦(中哈)边境阿拉山口口岸地区优势蚊种凶小库蚊携带沃尔巴克氏体情况及其基因型,为防控蚊媒传播疾病提供依据.方法 2015年4-10月,在中哈边境一区、二区、阿拉山口艾比湖湿地自然保护区,利用诱蚊灯和挥网法采集蚊虫,PCR扩增沃尔巴克氏体wsp基因,测序后进行Blast分析,利用Mega 6.0软件构建分子遗传进化树.结果 凶小库蚊感染沃尔巴克氏体的阳性率为3.33％(2/60);wsp基因遗传进化树显示,沃尔巴克氏体wsp基因序列属于A(wAlbA)和B(wAlbB)2个超级基因组.结论 中哈边境阿拉山口口岸地区首次检测到凶小库蚊携带沃尔巴克氏体,其基因型为wAlbA和wAlbB型,为应用沃尔巴克氏体通过种群替换阻断蚊媒疾病的传播等防控技术提供了基础资料.
关键词： 沃尔巴克氏体 凶小库蚊 聚合酶链式反应 中国-哈萨克斯坦边境 -
中国-哈萨克斯坦边境阿拉山口地区小兽携带汉坦病毒调查
目的 了解中国-哈萨克斯坦(中哈)边境阿拉山口口岸地区捕获小兽携带汉坦病毒(HV)情况,为该地区对HV感染流行的防控提供依据.方法 2016年1-11月采用夹捕法和弓形夹法在中哈边境铁路沿线区域捕获小兽,随机选取95份小兽肺组织提取RNA并反转录为cDNA.采用HV特异性引物进行PCR检测,阳性产物进行测序、分析并利用MEGA 6.0软件构建分子遗传进化树.结果 95份小兽样本经PCR检测及测序发现阳性样本24份(其中大沙鼠11份,红尾沙鼠、子午沙鼠和柽柳沙鼠各4份,灰仓鼠1份),阳性率为25.26％.经DNAman比对分析发现5个不同HV基因型,同源性为98.41％;BLAST序列分析均与GenBank数据库中已登录的汉城型汉坦病毒(SEOV)的同源性达98.09％～98.33％.遗传进化树显示,与汉城型DPRK08聚为一支.结论 中哈边境阿拉山口铁路沿线区域首次在大沙鼠、红尾沙鼠、子午沙鼠、柽柳沙鼠和灰仓鼠中检测出SEOV,证实该地区有5种鼠类携带感染HV.
关键词： 小兽 汉坦病毒 聚合酶链式反应 阿拉山口口岸 中国-哈萨克斯坦边境 -
东北地区蜱传斑点热群立克次体的分子流行病学研究
目的 调查东北地区蜱感染斑点热群立克次体(SFGR)情况及其种型分布.方法 2012-2014年5-6月,采用人工布旗法在东北3省9个市(县)和黑瞎子岛不同生境采集游离蜱以及家畜(牛、羊)体表寄生吸血蜱并鉴定;采用PCR方法对蜱种进行检测,对检出的阳性样本进行测序和序列分析,并建立分子系统进化树.结果 蜱的SFGR阳性率为11.43％,不同地区SFGR阳性率差异无统计学意义(χ2=7.683,P=0.566);不同蜱种SFGR感染率差异亦无统计学意义(χ2=6.354,P=0.174).5份嗜群血蜱标本及1份日本血蜱标本、1份森林革蜱标本与Rickettsia heilongjiangensis 054株(AF179362.2)和HL-93株(AF179364.1)聚为一支,同源性为99.30％～100％;3份长角血蜱标本与Candidatus R.hebeiii(QHD-3.HQ651817.1、TS-1.HQ651818.1、QHD-1.HQ651815.1)聚为一支,同源性为99.83％～100％;4份森林革蜱标本与R.sp.DnS14(AF009130.2)和吉林株R.sp.JL-02(AY093696.1)聚为一支,同源性为98.79％～100％.结论 东北地区蜱类SFGR感染普遍,存在感染SFGR蜱种的多样性和SFGR基因型多样性特点,提示该地区人群应重视对蜱传斑点热的防护,同时应加强患者症状的鉴别与诊断能力.
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基于分子生物学技术的吸血节肢动物 血餐宿主鉴定方法研究概述
吸血节肢动物作为虫媒传染病的重要传播媒介,其宿主的确定对理解虫媒传染病生态学及采取进一步的防控措施具有重要意义.血餐鉴定策略是识别节肢动物宿主的有效方法,随着分子生物学技术的发展,DNA检测方法提高了吸血节肢动物血餐鉴定的特异性和敏感性,常用的分子生物学方法有PCR、DNA序列测定、异源双链分析、限制性片段长度多态性分析、反向线点杂交技术和DNA指纹图谱等.通过对分子生物学技术在节肢动物血餐宿主研究中的原理及优缺点进行综述,以期为相关虫媒疾病防控提供参考.
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微芯片电泳及毛细管电泳在筛查急性髓系白血病FLT3-ITD基因突变中的应用研究
本研究旨在比较微芯片电泳及毛细管电泳在急性髓系白血病(AML)FLT3-ITD基因突变检测中的可靠性.应用PCR-微芯片电泳和PCR-毛细管电泳法同时检测214例初治AML患者DNA样本FLT3-ITD基因突变,并通过直接测序法进行序列分析.PCR-微芯片电泳结果显示,FLT3-ITD突变阴性151例,阳性58例(58/214,27.1％),可疑阳性5例(5/214,2.3％);PCR-毛细管电泳结果显示,FLT3-ITD突变阴性147例,阳性67例(67/214,31.3％).在毛细管电泳结果为阳性的67例样本中,其中4例微芯片电泳结果为阴性,5例为可疑阳性,用直接测序法进行检测,结果均为突变阳性.这一结果揭示,PCR-毛细管电泳法用于检测FLT3-ITD突变更为准确,虽然微芯片电泳组与毛细管电泳组FLT3-ITD突变检测阳性率并无显著差异(卡方检验,P＞0.05).结论:PCR-微芯片电泳与PCR-毛细管电泳均可作为简便的FLT3-ITD基因突变筛查方法,但作为新的检测手段,PCR-毛细管电泳法准确度与测序法一致、可用,而PCR-微芯片电泳法作为诊断检测的方法,其准确度有待于改进.
关键词： 急性髓系白血病 FLT3-ITD基因突变 聚合酶链式反应 微芯片电泳 毛细管电泳 -
人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建
本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3 Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制.方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5'侧翼区约2242 bp及下游5'非翻译区212 bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829 bp和784 bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnVEcom对获得的2个pCEMT重组载体及pGL3 Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4 DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性茼落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3 Basic荧光素酶报道重组子;经Kpnl/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459 bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400 bp左右设计了5对3'端平齐、5'端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112 bp、1 703 bp、1 290 bp、784 bp和496 bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T栽体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT 重组载体及pet3 Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4 DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定.结论:成功克隆了长度为2.5 kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pCt3-Basic荧光素酶报道重组子.
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人源细胞系中6种主要病毒的检测
目的 检测人源细胞系中EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)、人乳头瘤病毒(Human pappilomavirus,HPV)、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)、人T淋巴细胞白血病病毒(Human T-cell leukemia virus,HTLV)的感染情况.方法 对中心库藏常用的135株人源细胞系分别提取细胞DNA及RNA,采用PCR方法对细胞中的EBV、HBV、HPV、HIV、HTLV进行检测;采用RT-PCR方法对细胞中的HCV进行检测;利用透射电镜观察细胞中是否有病毒颗粒;对经PCR检测HPV核酸片段阳性的细胞系,再利用特异性引物采用PCR方法检测5种高危型HPV(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45).结果 经PCR检测,135株细胞系中,有4株细胞系(Daudi、Raji、EB-3、NCI-BL2009)中检测到EBV核酸片段;2株细胞系(Hep3B、PLC/PRF/5)中检测到HBV核酸片段;7株细胞系(HeLa、HeLa229、H1HeLa、HeLaS3、SiHa、Ca Ski、CNE-2Z)中检测到HPV核酸片段,其中2株(SiHa、Ca Ski)基因型为HPV16,5株(HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3、CNE-2Z)基因型为HPV18;1株细胞系(HUT 102)中检测到HTLV核酸片段;没有细胞系中检测到HIV核酸片段;经RT-PCR检测,没有细胞系携带HCV核酸片段.透射电镜下,病毒核酸阳性的细胞系中未观察到病毒颗粒,部分细胞系内可见病毒包涵体类似物.结论 PCR或RT-PCR可以用于检测细胞系中病毒核酸的携带情况;细胞系中病毒核酸以基因组整合的形式存在.
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不同浓度乙型肝炎病毒全基因组高通量测序方法的建立及其应用
目的 建立一种适用于不同浓度乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)的全基因组高通量测序方法.方法 分别采用HBV病毒核酸直接建库方法及巢式PCR扩增建库方法,对含高、中、低HBV拷贝的3个血浆样本进行文库构建.通过Illumina Miseq平台对HBV全基因组进行高通量测序.结果 基于两种不同建库方法获得数据产量差异巨大.HBV病毒核酸直接建库方法只有很少数据可以匹配到HBV基因组.巢式PCR扩增能够成功扩增出HBV全基因组,文库经高通量测序后,HBV基因组匹配率接近80％,且样本覆盖度和深度不受HBV浓度影响.3个不同浓度HBV样本共发现27个宿主内单核苷酸突变(intra-host single nucleotide variations,iSNVs),其中13个是低频突变.逆转录(reverse transcription,RT)区域的突变出现在低拷贝数和中等拷贝数样品中,而在高拷贝数样品中没有发现.结论 本研究建立的巢式PCR扩增结合高通量测序对HBV全基因组测序的方法,不仅可以快速准确的检测HBV感染,还可以发现低拷贝样品中整个HBV基因组的突变.
