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基于特异性聚合酶链式反应的西红花快速分子鉴别研究
目的 建立一种基于特异性聚合酶链式反应(PCR)及荧光染料检测快速鉴别西红花真伪品的方法.方法 通过对叶绿体基因片段测序和比对分析,找出西红花与其常见掺伪品序列差异,针对差异碱基设计特异性引物,构建并优化聚合酶链式反应扩增反应体系,使用荧光染料法检测聚合酶链式反应产物,实现西红花的快速鉴别.结果 建立了基于psb A-trnH序列的西红花鉴别体系,优化后的聚合酶链式反应反应条件为90℃预变性l min,90℃变性5 s,58℃延伸5 s,26个循环.在聚合酶链式反应反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ,西红花正品出现强烈绿色荧光,而伪品无荧光.结论 位点特异性聚合酶链式反应方法可以简单快速鉴别西红花及其掺伪品.
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中药材龟甲细胞色素b基因特异性鉴定研究
目的 建立一种实用、简便、准确的中药材龟甲DNA分子标记鉴定方法.方法 采用酚-三氯甲烷抽提法和盐析法提取龟甲mtDNA.从GenBank数据库中下载乌龟及常见伪品源动物mtDNA细胞色素b基因序列,经序列比较分析,设计特异性引物,并使用该引物对正品及其伪品mtDNA进行扩增并测序.结果 盐析法提取DNA的浓度高于酚-三氯甲烷抽提法,并且盐析法省时、经济.本实验所设计引物只能扩增正品龟甲mtDNA,测序结果与龟甲同源性100％.结论 盐析法是一套适合从龟甲中提取高质量DNA的方法,本实验所设计的引物具有高度特异性,可用于龟甲类药材的鉴定.
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乌梢蛇DNA检测试剂盒的研制与应用
目的 研制乌梢蛇DNA提取和检测试剂,对试剂盒的特异性、稳定性和重复性进行评价,并对市售乌梢蛇药材进行质量检测,终开发乌梢蛇DNA检测试剂盒.方法 应用现代的DNA指纹技术,对2015年版《中国药典》乌梢蛇DNA检测方法进行了优化和改良,研制了乌梢蛇DNA提取和检测试剂,开发了乌梢蛇PCR检测试剂盒,并对试剂盒检测参数进行评价.应用该试剂盒对随机抽取北京、天津、长春和吉林4个城市的18个乌梢蛇样品,进行检测,同时与药典DNA方法进行比对试验.结果 乌梢蛇DNA检测试剂盒经反复冻融5、10和20次后依然有效.18个市售乌梢蛇样品中14个样品为正品,4个样品为伪品.多次试验特异性、稳定性和重复性结果完全相同.试剂盒法与药典法检测结果一致.且试剂盒法可在普通实验室内完成DNA检测任务.结论 乌梢蛇DNA检测试剂盒对乌梢蛇药材鉴别简单方便、准确有效.适用于乌梢蛇DNA的快速检测.
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多重引物PCR测序方法分析河北青县乙肝HBsAg阳性者的S基因特点
目的 分析河北青县地区乙肝HBsAg阳性者的S基因特点.方法 乙肝血清标志物酶联免疫检测试剂检测乙肝五项血清标志物,乙肝荧光PCR核酸定量试剂检测HBV病毒载量,利用多重PCR的方法,扩增乙肝S基因,序列分析其基因型、血清型特点,并分析不同标志物组合中乙肝病毒载量变化.结果 在101份乙肝HBsAg阳性者中,主要有4种血清学模式:A(HBsAg+,HBeAg-,HBeAb-,HBcAb+)、B(HBsAg+,HBeAg-,HBeAb+,HBcAb+)、C(HBsAg+,HBeAg+,HBeAb-,HBcAb+)和D(HBsAg+,HBeAg+,HBeAb-,HBcAb-),比例分别为15.8％ (16/101)、50.5％(51/101)、28.7％ (29/101)和5.0％ (5/101).荧光定量PCR法HBV核酸阳性率为86％ (87/101),多重PCR方法的核酸阳性率为94％ (95/101),两者无显著统计学意义(x2=3.55,P＞0.05).A、B、C和D血清学模式的病毒载量分别为:1.6×104、8.5×102、1.8×10 7和1.5×108 IU·mL1.该地区以C基因型为主占91％ (86/95),B基因型仅9％(9/95);血清型以adr为主占80％ (76/95),adw血清型19％ (18/95),ay血清型1％ (1/95).不同血清学模式下乙肝的基因型和血清型分布没有显著差异,血清模式e抗原阳性人群的病毒载量显著高于e抗原阴性人群,e抗原阳性人群的年龄低于e抗原阴性人群(P＜0.01).结论 多重PCR方法与荧光定量PCR方法的灵敏度相当,可以用于乙肝的S基因序列分析,青县地区C基因型乙肝病毒占绝对优势,应引起重视.
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两种PCR技术在GDNF基因克隆中的应用
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)自1985年问世以来在分子生物学领域得到了极其广泛的应用,包括从基因组中大量地扩增单拷贝基因[1,2],扩增mRNA的RT-PCR[3],PCR测序,PCR标记探针,定量PCR[4],反向PCR及临床基因诊断等许多方面.本文报道在GDNF基因克隆过程中2种新的PCR技术在直接基因克隆和重组体方向鉴定方面的应用.
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高血压病人载脂蛋白B基因多态性研究
高血压病人常有脂代谢的异常,为研究ApoB基因XbaⅠ酶切位点的变化对血压及血脂代谢的影响,我们用聚合酶链式反应/限制性酶切法(polymerase chain reaction/restrictive enzyme, PCR/RE)研究了高血压病人apoB基因的多态性.
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PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化测定及临床意义
目的 检测PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化状态,并分析其临床意义.方法 应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术检测PCDH10基因在3株前列腺癌细胞系、1株前列腺上皮细胞、13例前列腺增生组织和40例前列腺癌组织样本中的甲基化情况,同时分析40例前列腺癌患者的临床资料.结果3株前列腺癌细胞系中有2株检出PCDH10基因甲基化;40例前列腺癌样本中24例(60％)检出PCDH10基因甲基化,13例前列腺增生组织中未检出PCDH10基因甲基化.PCDH10基因出现甲基化患者与未出现甲基化患者相比,在年龄、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)和临床分期等指标的差异无统计学意义(P＞0.05),但在Gleason评分的差异存在统计学意义(P＜0.05).结论 PCDH10基因在前列腺癌组织中甲基化程度较高,高Gleason评分的前列腺癌可能具有更高的PCDH10基因甲基化率,提示PCDH10基因甲基化可能与前列腺癌的发生发展有关.
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应用单细胞cDNA扩增技术鉴定循环肿瘤细胞
目的 建立单细胞cDNA扩增技术,实现在分子水平鉴定循环肿瘤细胞.方法 建立结肠癌循环肿瘤细胞模型,通过免疫荧光染色和显微切割技术分离出单个血细胞和肿瘤细胞;裂解细胞后利用碱基修饰的P1(dT)24引物反转录出cDNA第一链,并给第一链cDNA加上PolyA尾后利用碱基修饰的P2(dT)24引物合成第二链cDNA,然后利用P1(dT)24和P2(dT)24引物扩增分别得到血细胞和肿瘤细胞的全长cDNA;后通过PCR检测细胞特异的标记物CD45、EpCAM和CK19.结果 改良后的单细胞cDNA扩增方法能够获得高质量的全长cDNA,并能显著增加PCR检测效率;利用扩增得到的cDNA通过PCR检测细胞表面标记物CD45、EpCAM和CK19的表达,能有效鉴定出外周血中混杂的肿瘤细胞.结论 通过单细胞cDNA扩增技术在基因水平识别肿瘤细胞,建立了一种新的循环肿瘤细胞的鉴定方法.
关键词： 单细胞cDNA扩增技术 循环肿瘤细胞 激光捕获显微切割 聚合酶链式反应 -
汉族人endoglin基因多态性与颅内动脉瘤发病的关系
目的研究汉族人中endoglin基因第7内含子的插入多态性与颅内动脉瘤发病率的关系.方法利用聚合酶链式反应(PCR),琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及PCR产物直接测序等方法比较94例颅内动脉瘤患者与116例正常对照者endoglin基因第7内含子内插入型基因的构成.结果颅内动脉瘤组与对照组中endoglin基因第7内含子内插入型基因的构成差异有统计学意义,前者(36.2%)明显高于后者(12.1%)(χ2＝8.553,P＝0.005).动脉瘤组中插入型基因的等位基因频率为24.5%(46/188),而正常对照组为6.03%(14/232),经χ2检验,二者的差异有统计学意义(χ2＝14.409,P＝0.000).结论汉族人的endoglin基因异质性可能与颅内动脉瘤的发生相关.
关键词： endoglin基因 聚合酶链式反应 基因多态性 颅内动脉瘤 -
重组PCR快速基因定点突变的技术方法
聚合酶链式反应(PCR)是由Mullis等联合研制的一种在体外快速对特定DNA序列扩增的技术[1].本研究通过重组PCR技术对growth associated protein43-(GAP-43)基因Ser41(丝氨酸)AGC定点突变为Ala41(甘氨酸)GCC,此方法比传统的体外基因突变技术更简单、快速而且经济.
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结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR检测体系的建立和应用
目的 建立结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测体系,并用于不同类型临床样本的检测.方法 常规提取13株结核分枝杆菌和14株非结核分枝杆菌临床分离株DNA,9例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和4例其他肺部疾病患者痰DNA,12例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和7例健康者血浆DNA.设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针,建立ddPCR检测体系.应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数,进行统计学分析.结果 建立了能同时检测IS6110和IS1081的ddPCR体系,该体系检测2个靶标的线性范围分别为0.5～8 733和0.2～2 893拷贝/μl反应体系.该体系具有较好的重复性(r＞0.95),以非结核分枝杆菌为对照检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100％.在痰和血浆DNA样本检测中,2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组.结论 结核分枝杆菌特异性核酸的ddPCR体系,可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测,对提高结核病病原学诊断能力有重要意义.
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人类白细胞Ⅱ类抗原与颅内囊性动脉瘤发病关系的研究
目的探讨汉族人群中人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类抗原基因与颅内动脉瘤发病率的关系.方法利用PCR、琼脂糖胶电泳检测PCR产物等方法,比较49例颅内动脉瘤组与58例对照组中HLA-Ⅱ类抗原基因的DR及DQ位点的等位基因频率.结果汉族颅内动脉瘤患者的HLA-Ⅱ类抗原基因的DR及DQ等位基因频率与正常对照组无显著性差异(P＞0.05).结论汉族人的HLA-Ⅱ类抗原与颅内动脉瘤的发生可能无相关关系.
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巢式RT-PCR法检测HIV-1阳性者中庚型肝炎病毒感染的研究
目的 调查HIV流行地区庚型肝炎病毒(HGV)在HIV阳性人群中的感染率,并探讨其对HIV病程的影响.方法 根据已知并公认的HGV序列,设计特异巢式引物,建立HGVRNA的巢式RT-PCR方法,对100例HIV-1阳性感染者进行检测,同时进行CD4+T细胞计数和HIV病毒载量的测定.结果 100例HIV-1阳性者中检测出HGVRNA阳性感染者22例(22%);合并感染HGV的HIV感染人群体内可见有较高CD4细胞数.结论 HIV阳性感染者有较高的HGV重叠感染率,可能与其具有共同的传播途径有关,合并感染HGV似乎能延缓HIV感染者的病程.
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猫细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用
目的 建立猫细小病毒PCR检测方法,应用于猫临床样本中FPV的快速检测.方法 根据已发表的FPVVP2基因序列设计合成引物,并以此建立FPV的PCR检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证.用建立的方法对33份猫临床样品进行检测.结果 建立的FPV PCR检测方法与猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、猫冠状病毒(FeCV)、猫合胞体病毒(FeSFV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)均无交叉反应;可检测病毒小滴度为5lgTCID50/mL,相应的DNA模板浓度为4.9×102拷贝/μL;FPV DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带.应用该方法从33份猫临床样本中检测出21份FPV核酸阳性.结论 建立的FPV PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FPV的感染检测.
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牛疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及在牛源样本检测中的应用
目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)PCR检测方法,用于临床牛样本中BHV-1的检测.方法 根据已发表的BHV-1 gB基因保守区域设计合成引物,建立BHV-1 PCR方法,对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价,并用建立的PCR方法检测64份牛临床样本.结果 建立的BHV-1 PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、均无交叉反应;可检测病毒小滴度为5lg TCID50/mL,对应的DNA模板浓度为5.26×102拷贝/μL;BHV-1 DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带.应用建立的方法检测145份牛源组织样本,BHV-1核酸阳性率为15.2％.结论 建立的BHV-1PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,适合于临床牛样本BHV-1的感染的检测.
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阜阳地区120例发热呼吸道症候群住院患者的细菌病原谱分析
目的 了解阜阳地区发热呼吸道症候群住院患者的细菌病原谱构成,为临床医生的经验性用药提供理论依据.方法 对阜阳市第二人民医院自2014年10月-2015年9月符合发热呼吸道症候群定义的120例住院患者行痰培养、血培养、聚合酶链式反应(PCR)、尿抗原检测进行病原学检测,检测病原菌包括肺炎链球菌(SP)、金黄色葡萄球菌(SA)、肺炎克雷伯菌(KP)、流感嗜血杆菌(HI)、铜绿假单胞菌(PA)、A组乙型链球菌(β-HA)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CT)、嗜肺军团菌(LP).结果 120份病例的阳性率为43.3％,其中各病原菌比例SP为15.8％ (19/120)、SA为0.8％ (1/120)、KP为5.0％(6/120)、HI为9.2％(11/120)、PA为7.5％(9/120)、MP为9.2％(11/120)、未检测到β-HA、CT、LP,混合感染率为4.2％ (5/120).120例患者均诊断为社区获得性肺炎,其中单纯社区获得性肺炎75例,病原菌感染的阳性率为38.7％(29/75),混合感染2例,混合感染率为2.7％.有基础肺病慢性阻塞性肺病病史的病例45例,病原菌感染的阳性率为48.9％(23/45),混合感染3例,混合感染率为6.7％ 结论 阜阳市发热呼吸道症候群住院患者的前3位致病菌为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和肺炎支原体,混合感染较常见二发热呼吸道症候群的主要疾病为社区获得性肺炎.单纯社区获得性肺炎患者和有慢性阻塞性肺病病史的社区获得性肺炎患者的细菌病原谱存在差异.
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外生殖器异常患儿SRY基因分析
目的 对6例外生殖器异常的患儿进行SRY基因检测,为临床诊断提供参考,并对性发育异常机制进行初步探讨.方法 应用PCR扩增及PCR产物直接测序进行SRY基因分析.结果 1例45,X0男性患儿,SRY基因阳性,1例46,XX男性,SRY阴性;1例46,XY女性,SRY基因阳性.对其SRY基因保守区测序结果表明该区无突变.3例46,XY男性外生殖器异常患儿,SRY基因均为阳性.结论 45,XO男性患儿是由于SRY基因易位所致.女性性反转非SRY基因保守区突变所致.男性性反转可能由于常染色体上与性别决定有关的基因突变所致.
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BCR-ABL融合基因检测方法的进展
BCR-ABL融合基因可编码产生BCR-ABL融合蛋白,是慢性粒细胞白血病的特征性标志,对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗具有重要意义.目前临床有多种方法可对其进行检测,主要有细胞遗传学、荧光原位杂交、聚合酶链式反应、Western Blot印迹法、流式免疫磁珠(CBA)等检测方法.这些检测方法有的费时费力,有的需要专门的实验设备等,故在临床应用中受限.随着对BCR-ABL融合基因检测技术的发展,CBA法对BCR-ABL融合蛋白的检测具有其特有的优越性而得到越来越多的应用.
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牙龈卟啉菌与伴放线放线杆菌不同基因的临床症状108例
本文采用PCR方法检测了Pg16SrDNA基因、胶原酶基因(prtC)和菌毛基因(fimA),以及Aa 16SrDNA基因、白细胞毒素基因(IktA)和菌毛相关蛋白基因(fap),并初步探讨了上述基因的检出与患者临床症状间的关系.
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实验动物病原PCR检测方法系列团体标准的编制
实验动物质量检测是实验动物质量管理的重要手段,标准的制定和更新是促进我国实验动物质量提升的主要方法.近年来,实验动物新的疾病病原不断出现,新的检测技术不断更新,仅靠国家标准的制定和更新已不能满足我国实验动物的质量管理的需求.利用团体标准搞创新的优势,结合实际需求,制定了一批实验动物病原PCR检测方法团体标准.这些团体标准是国家标准的有力补充,对促进我国实验动物质量提升具有重要作用.
