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肺癌患者血浆SHOX2基因甲基化微滴数字PCR检测临床意义
目的 应用微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术检测肺癌患者血浆中人矮小同源盒基因2(short stature homeobox2,SHOX2)基因甲基化水平,并探讨SHOX2基因甲基化、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、糖类抗原125 (carbohydrate antigen 125,CA125)和细胞角蛋白19片段(cytoker atin-19-fragment,CYFRA21-1)检测辅助诊断肺癌的临床价值.方法 收集2017 07 01-2017-12-30在郑州大学第一附属医院就诊的肺癌患者和健康体检者的标本,80例肺癌患者外周血标本作为肺癌组,其中30例肺癌患者癌组织标本为肺癌组织组.40名健康体检者外周血标本作为对照组.ddPCR检测SHOX2基因甲基化水平,电化学发光法检测血清中CEA、NSE、CA125和CYFRA21-1水平,并结合肺癌患者临床病理特征进行关联性分析.结果 80例肺癌患者血浆中SHOX2基因甲基化阳性率为71.25％(57/80),高于对照组的2.50％(1/40),差异有统计学意义,x2=50.473,P＜0.001.30例肺癌患者血浆与匹配的组织标本中SHOX2基因甲基化检测结果符合率为90.0％(27/30),x2=1.33,P=0.25.受试者工作特征(receiver operating characteristics curve,ROC)曲线分析显示,SHOX2基因甲基化、CEA、CA125、NSE和CYFRA21-1诊断肺癌曲线下面积(area under curve,AUC)值分别为0.906、0.767、0.642、0.693和0.845.CEA、CA125、NSE和CYFRA21-14项联合检测的敏感性为86.25％ (69/80),特异性为82.50％ (33/40),AUC值为0.922(95％CI为0.859～0.963);5项指标联合检测的敏感性为93.75％ (75/80),特异性为95.00％ (38/40),AUC值为0.959(95 ％CI为0.907～0.987).SHOX2基因甲基化与CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1水平相关系数分别为0.355、0.229、0.220和0.578,差异有统计学意义,均P＜0.05.SHOX2基因甲基化与肺癌患者性别、年龄、吸烟状况之间无关联,均P＞0.05.SHOX2基因甲基化与病理类型(P=0.042)和TNM分期(P=0.039)有关.腺癌中SHOX2基因甲基化阳性率(58.97％,23/39)低于鳞癌(77.27％,17/22)和小细胞肺癌(89.47％,17/19);Ⅲ和Ⅳ期肺癌患者SHOX2基因甲基化阳性率分别为77.42％(24/31)和85.71％(18/21),高于Ⅰ (40.00％,4/10)和Ⅱ期(61.11％,11/18).结论 ddPCR可检测肺癌患者血浆中SHOX2基因甲基化,与匹配组织中检测结果一致性较好.SHOX2基因高甲基化与肺癌发生发展有关,联合CEA、NSE、CA125和CYFRA21-1检测可提高诊断效能,提示SHOX2基因甲基化可作为一种非侵入性的肺癌肿瘤标志物.
关键词： 肺癌 SHOX2基因甲基化 肿瘤标志物 微滴数字PCR -
微滴数字聚合酶链反应检测婴儿唾液中变形链球菌和远缘链球菌的研究
目的 使用微滴数字PCR检测婴儿口腔内变形链球菌和远缘链球菌,评价其可行性.方法 以变形链球菌c型和远缘链球菌ATCC 27607标准菌株基因设计引物,对123名5~8个月婴儿唾液样本分别进行微滴数字PCR、巢氏PCR和常规PCR反应,检测婴儿唾液中变形链球菌和远缘链球菌.结果 微滴数字PCR定性、定量检测变形链球菌和远缘链球菌标准菌,1×10-4 ng/μl靶细菌的拷贝数达到4.8×104和3.6×104,灵敏度可达0.01%;巢氏PCR检测灵敏度为0.01%;常规PCR检测灵敏度为0.1%.用微滴数字PCR、巢氏PCR和常规PCR检测婴儿唾液中变形链球菌检出率分别为78.9%、33.3%和6.5%;远缘链球菌检出率分别为11.4%、4.1%和0,微滴数字PCR检出率明显高于常规PCR和巢氏PCR(P<0.05).结论 微滴数字PCR能早期检测婴儿口腔中变形链球菌和远缘链球菌,该方法具有较高的灵敏性和特异性,有广泛的临床应用前景.
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结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR检测体系的建立和应用
目的 建立结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测体系,并用于不同类型临床样本的检测.方法 常规提取13株结核分枝杆菌和14株非结核分枝杆菌临床分离株DNA,9例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和4例其他肺部疾病患者痰DNA,12例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和7例健康者血浆DNA.设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针,建立ddPCR检测体系.应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数,进行统计学分析.结果 建立了能同时检测IS6110和IS1081的ddPCR体系,该体系检测2个靶标的线性范围分别为0.5～8 733和0.2～2 893拷贝/μl反应体系.该体系具有较好的重复性(r＞0.95),以非结核分枝杆菌为对照检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100％.在痰和血浆DNA样本检测中,2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组.结论 结核分枝杆菌特异性核酸的ddPCR体系,可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测,对提高结核病病原学诊断能力有重要意义.
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利用微滴数字PCR进行CpG岛甲基化表型结直肠癌分子分型
目的:利用微滴数字PCR(droplet digital PCR,DD-PCR)技术进行CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype,CIMP)结直肠癌分型,并探讨以血浆游离DNA进行CIMP分型的可行性.方法:收集2008到2012年在长海医院行结直肠癌手术的患者216例,抽提肿瘤组织DNA和血浆游离DNA,重亚硫酸盐处理后,利用DD-PCR进行CIMP分型.CIMP分型选用CA CNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3、SOCS1五个基因的甲基化位点,利用免疫组织化学技术(IHC)检测P53突变情况,以巢式PCR测序方法检测K-RAS和BRAF突变.结果:216例肿瘤中17例(7.9％)存在BRAF突变,96例(44.4％)存在K-RAS突变和112例(51.9％) P53-IHC(+).31.5％(68/216)的结直肠癌为CIMP(+)(5个基因位点中高甲基化位点数目≥3),82.3％ (14/17)的BRAF突变属于CIMP(+),而只有9.4％ (9/96)的K-RAS突变和7.1％ (8/112)的P53突变属于CIMP(+).除了K-RAS,BRAF和P53突变外,同CIMP(-)结直肠癌相比,CIMP(+)肿瘤还具有独特的临床病理特征:肿瘤更易发生在结直肠的近端位置,黏液性癌比例偏高,分化程度较高,CIMP(+)患者生存时间显著短于CIMP(-)患者.利用血浆游离DNA进行分型和利用肿瘤组织进行分型的一致性为93.4％、灵敏度为87.2％、特异性为100％.结论:CIMP(+)结直肠癌具有独特的临床病理特征,且预后较差;在缺乏肿瘤组织的情况下,利用DD-PCR对血浆游离DNA进行CIMP分型是可行的.
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微滴数字PCR定量检测全血样品中结核分枝杆菌特异CFP10基因
目的 采用微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)检测全血中结核分枝杆菌特异性CFP10(10-kDa culture filtrate protein,CFP10)基因的拷贝数含量.方法 收集10例活动性肺结核患者(active tuberculosis,aTB)、10例肺外结核患者(extrapulmonary tuberculosis,EPTB)和5例健康对照者(healthy donars,HDs)全血并提取DNA,优化引物佳扩增条件并制定重组质粒标准曲线,对样本中CFP10基因的拷贝数含量分别用ddPCR与实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)进行检测和比较.结果 对重组质粒的灵敏度检测显示ddPCR技术明显优于qPCR技术.对样本的检测显示qPCR技术检测aTB、EPTB患者与健康人的全血中CFP10含量之间无统计学意义;但是ddPCR技术检测aTB、EPTB患者与健康人之间有显著统计学意义(P＜0.0001);ddPCR检测aTB和EPTB患者(共20例)CFP10基因绝对定量的浓度约为3.4 ～ 94.0 copies/μL.结论 本研究首次报道采用ddPCR技术能灵敏地用于TB患者全血的诊断.
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微滴数字PCR检测血清miR-21和miR-4429在肝癌诊断中的应用
目的 应用微滴数字PCR检测血清中miR-21和miR-4429的水平,并探讨联合AFP检测在诊断肝细胞肝癌中的临床价值.方法 收集69例肝癌、47例慢性活动性乙肝以及40例健康体检者血清标本,应用微滴数字PCR检测血清miR-21和miR-4429水平,化学发光法检测血清中AFP水平,并用ROC曲线和Spearman相关进行分析.结果 肝癌组患者miR-21水平明显高于健康对照组和慢性活动性乙肝组(均P＜0.05),miR-4429水平高于健康对照组(P＜0.05).ROC曲线分析显示:miR-21、miR-4429和AFP 3者联合检测的灵敏度(95.0％)、特异度(92.5％)和准确度(92.7％),较单独检测或两项联合检测有较大提升.miR-21、miR-4429表达与患者年龄、性别、有无HBsAg感染或肝硬化、PLT或AFP水平、TNM分期和疾病状态均无相关性(均P＞0.05).结论 血清miR-21和miR-4429对肝癌的诊断具有良好的灵敏度和特异度,联合AFP检测可以提高诊断的效能.
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微滴数字PCR探测慢性扁桃体炎感染幽门螺旋杆菌的疗效分析及意义
目的:评估微滴数字PCR(dd-PCR)探测慢性扁桃体炎感染幽门螺旋杆菌(H.pylori)的疗效,并探讨慢性扁桃体炎与H.pylori感染的关系.方法:选取病理确诊为慢性扁桃体炎的48例患者,采用酶联免疫吸附法测定标本中人幽门螺杆菌抗体(HPIG-Ab)在血浆中的表达水平,采用RT-PCR和dd-PCR检测H.pylori特异性病毒因子——细胞毒素基因A(CagA)、细胞空泡毒素(VacA)的表达,并用35例健康体检者的血浆及30例单纯扁桃体增生组织(OSAHS患者)做对照,检测其H.pylori的感染情况并作分析.结果:血浆HPIG-Ab水平慢性扁桃体炎患者为(10.12±3.23) ng/ml,OSAHS患者为(9.87土2.43)ng/ml,健康对照组为(9.34±3.38) ng/ml,组间数据差异无统计学意义.RT-PCR结果示:H.pylori的主要病毒基因慢性扁桃体炎患者是VacA(2 7.1％)、CagA(16.7％)、VacA加CagA(16.7％);OSAHS患者主要是VacA(23.3％)、CagA (20.0％)、VacA加CagA(16.7％).dd-PCR结果显示:H.pylori的主要病毒基因慢性扁桃体炎患者分别是VacA(72.9％)、CagA(52.1％)、VacA加CagA(39.6％);OSAHS患者主要是VacA(33.3％)、CagA(23.3％)、VacA加CagA(16.7％).结论:H.pylori是慢性扁桃体炎的危险因素之一,dd-PCR相比H.pylori血清学检测及RT-PCR,能更好地检测H.pylori,其特异性良好,对H.pylori阳性的慢性扁桃体炎患者可行抗H.pylori治疗.
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微滴数字化PCR检测肝癌基因组MSH2基因的一个新的无义突变
目的 探讨微滴数字化PCR(droplet digital PCR,ddPCR)验证原发性肝细胞肝癌患者癌基因组MSH2基因中发生的一个新的无义突变的分析方法.方法 对已经通过全外显子组测序鉴定到的一个新的MSH2的体细胞突变进行ddPCR验证;分别对该患者肝细胞肝癌组织和癌旁硬化组织的基因组DNA分析.结果 ddPCR验证了该无义突变(rs63751009,g.chr2:47630358 C＞T,c.28 C＞T,p.Q10*)只发生在肝癌组织而不存在于癌旁硬化组织中,定量检测发现该无义突变在肝癌组织中的等位基因分数为0.4,与外显子测序的结果类似.结论 ddPCR是一种快速和准确的基因突变分析的新方法,灵敏度和特异性高,在基因突变的分析中具有极大的潜力.
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微滴数字PCR技术检测先天性心脏病患儿染色体22q11.2区段微缺失
目的 探索一种检测22q11.2微缺失综合征的新方法.方法 针对22q11.2微缺失综合征特异缺失区内的TBX1基因和内参基因RPP30设计引物和探针,采用微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的方法计算TBX1/RPP30的比值,检测22q11.2区段微缺失.结果 通过数字PCR方法计算TBX1/RPP30的比值检测22q11.2微缺失综合征,检出3例微阵列比较基因组杂交检测结果为22q11.2微缺失综合征阳性的样本.在14例临床诊断为先天性心脏病的患儿中检测出2例22q11.2微缺失阳性样本.结论 微滴数字PCR可以准确检测出22q11.2区段微缺失,可提供一种快速、经济的检测先天性心脏病相关染色体22q11.2微缺失综合征的方法.
关键词： 22q11.2微缺失综合征 微滴数字PCR 先天性心脏病
