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2012-2017年天津市百日咳鲍特菌耐药情况分析
目的 了解2012-2017年天津市百日咳鲍特菌菌株对抗生素敏感性的分布情况及耐药位点变异情况,为百日咳防治提供依据. 方法 以2012年2月至2017年7月天津市分离的18株百日咳鲍特菌菌株作为研究对象,采用纸片扩散法对培养的阳性菌株进行红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、左氧氟沙星及克林霉素敏感性进行检测,同时采用E-test法检测菌株对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、左氧氟沙星及复方新诺明的敏感性;对红霉素结合区域23S rRNA domain V基因片段进行扩增、序列测定及分析. 结果 纸片扩散法结果显示,18株菌株中仅1株对5种抗生素均敏感,其余17株对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素及克林霉素均耐药,红霉素耐药率高,达94.44％(17/18),18株菌对左氧氟沙星均敏感;E-test法结果显示,仅1株菌对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素的低抑制浓度(MIC)在敏感范围内,其余17株对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素的MIC均＞256 μg/ml,18株菌对左氧氟沙星的MIC为0.19～0.38 μg/ml,复方新诺明的MIC为0.047～1.500 μg/ml;23S rRNA扩增产物序列分析发现,17株菌发生A2047G位点突变. 结论 纸片扩散法和E-test法对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素和左氧氟沙星的耐药结果完全符合, 17株菌对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素同时耐药,耐药株23S rRNA序列均发生A2047G红霉素耐药位点改变.
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类志贺邻单胞菌实时荧光TaqMan PCR 快速检测体系的建立
目的 建立针对类志贺邻单胞菌的高灵敏、高特异的实时荧光TaqMan聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系.方法 根据类志贺邻单胞菌23S rRNA基因的一段特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度；用30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光TaqMan PCR快速检测体系对类志贺邻单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系；对类志贺邻单胞菌基因组的检测灵敏度为3 × 10-2pg/反应体系；该检测体系在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成.结论 本研究建立的实时荧光TaqMan PCR 检测体系可作为类志贺邻单胞菌灵敏、特异、快速的检测方法.
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阴道加德纳菌ITS-23S rRNA部分基因克隆及序列分析
目的 分析深圳地区阴道加德纳菌(G.vag)ITS(internal transcribed spacer)-23S rRNA部分基因序列.方法 设计特异性引物,建立检测G.vag的PCR方法,对临床病人阴道分泌物标本进行检测,并对分离出的4株PCR产物进行分子克隆和序列分析.结果 分离出的4株G.vagITS-23S rRNA基因的核苷酸同源性在99.5%以上,与Belkum报道株同源性在98%以上.结论 深圳地区G.vag与国外报道的菌株在ITS-23S rRNA基因区变异不大,可能属同一基因型.
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耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺的耐药机制及分子流行病学研究
目的 研究耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCoNS)临床分离株对利奈唑胺的耐药机制及分子流行病学.方法 2011年3-8月我院分离到17株对利奈唑胺耐药的MRCoNS,包括10株头状葡萄球菌、4株科氏葡萄球菌、2株溶血葡萄球菌和1株松鼠葡萄球菌.用E-test法测定抗生素对细菌的低抑菌浓度(MIC)；脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株之间的同源性；PCR扩增和序列分析研究细菌对利奈唑胺耐药的分子机制.结果 9株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的头状葡萄球菌为同一克隆株,MIC值为4μg/ml的另1株头状葡萄球菌为密切相关菌株.4株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的科氏葡萄球菌为同一克隆株.松鼠葡萄球菌利奈唑胺MIC值为64 μg/ml,2株溶血葡萄球菌分别为4 μg/ml和6μ/ml.对23S rRNA基因第5功能区和cfr基因进行PCR扩增和测序发现,9株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的头状葡萄球菌的23S rRNA基因第5功能区存在常见G2576T突变和一个未报道过的C2104T突变；松鼠葡萄球菌存在G2576T突变；除松鼠葡萄球菌外,其余16株菌株均携带cfr基因.结论 首次报道在国内分离到利奈唑胺耐药的葡萄球菌临床菌株.MRCoNS对利奈唑胺耐药与23S rRNA基因第5功能区碱基突变和携带cfr基因相关.利奈唑胺耐药MRCoNS在我院有克隆传播现象.
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与克拉霉素耐药相关的幽门螺杆菌基因23S rRNA序列分析
幽门螺杆菌是寄生于人体胃部的革兰阴性杆菌,是胃溃疡、十二指肠球部溃疡和胃癌的主要致病因素之一,与胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤关系密切.随着大环内酯类抗生素广泛应用于治疗幽门螺杆菌感染,幽门螺杆菌的耐药现象日益严重.现已证实,幽门螺杆菌对克拉霉素耐药主要与其23S rRNA基因的点突变有关.为此,本研究通过对江苏苏中沿海地区分离培养的幽门螺杆菌菌株的23S rRNA部分基因片段进行序列分析,希望了解本地区幽门螺杆菌耐药菌株的基因突变和耐药的关系.
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凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺耐药机制的初步研究
目的 探讨凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺的耐药机制.方法 收集临床分离的1株凝固酶阴性葡萄球菌,菌株来源的患者进行血液细菌培养前未经利奈唑胺治疗,但曾服用罗红霉素.本研究采用PCR和DNA测序法扩增其23S rRNA基因V区序列,与基因库中对利奈唑胺敏感的标准菌株基因序列进行对比分析.结果 利奈唑胺对实验菌株的小抑菌浓度(MIC)为≥ 256 mg/L,此外该菌株对氯霉素、红霉素和克林霉素均耐药,对链阳菌素敏感,克林霉素诱导实验阴性.与GenBank中S.epidermidis RP62A(Accession No:CR000029)进行比对分析,结果发现实验菌株6个拷贝的23S rRNA V区出现C2390T、G2431C、G2436A和C2453T纯合突变.结论 初步判断该株凝固酶阴性葡萄球菌23S rRNA保守区V区C2390T、G2431C、G2436A和C2453T多位点变异可能导致其对红霉素、林可霉素、氯霉素及利奈唑胺的多重耐药,进一步阐明罗红霉素是否可诱导葡萄球菌23S rRNA的V区保守区碱基突变,从而产生对利奈唑胺的交叉耐药,对阐明利奈唑胺耐药机制以及恶唑烷酮新药的开发具有重要的意义.
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百日咳鲍特菌23S rRNA位点变异AS-PCR检测方法建立
目的 根据allele-specific PCR(AS-PCR)原理,建立具有良好敏感性与特异性的百日咳鲍特菌23S rRNA位点变异检测方法.方法 基于百日咳鲍特菌23S rRNA A2047G位点突变与其对红霉素耐药的相关性,设计包含特异变异位点的引物进行两阶段PCR反应,根据电泳有无特异大小目的片段的出现,确定百日咳鲍特菌23S rRNAA2047G位点是否有变异.结果 以基因序列测定法为金标准的评价结果显示,AS-PCR法检测突变型菌株的灵敏度为96 ％(144/150),特异度为100 ％(100/100),kappa=0.95(P＜0.01);检测野生型菌株的灵敏度为100 ％(18/18),特异度为100 ％(100/100),kappa=1(P＜0.01).结论 AS-PCR方法检测百日咳鲍特菌23S rRNA A2047G位点变异具有较高灵敏度和特异度,适用于普通微生物实验室开展百日咳鲍特菌对红霉素耐药性的快速检测.
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幽门螺杆菌23s rRNA基因突变与克拉霉素耐药性关系的研究
目的:通过对幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,HP)23s rRNA基因突变位点分析,观察23s rRNA各突变点与克拉霉素耐药的关系.方法:分离培养HP、提取DNA、扩增其23s rRNA基因片段及测序；运用Clustalw软件进行序列比对找出突变点.选用GenBank中已全基因组测序的35株HP,根据其mutY、ppa、efp和ureI4个管家基因建立Neighbour-joining树,根据进化树结果将35株HP分为欧非和东亚菌群；观察各突变点与菌群分布的关系.结果:与耐药有关的A2143G突变率为32.8％,T2182C突变率为90.6％但与耐药无关,其碱基分布具有菌群差异:东亚菌群以c碱基为主,欧非菌群以T为主(P＜0.05),其他可能与耐药有关的各位点分别为A2223G(6.25％)、T2190C(1.6％)、C2195T(1.6％).结论:青岛地区HP克拉霉素耐药率为32.8％并表现为23s rRNA基因A2143G突变,而2182位点突变是由于菌群分布差异导致的与克拉霉素耐药无关.
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4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌的23S rRNA基因突变分析
目的 研究临床分离的4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌的耐药机制.方法 采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统对临床分离的4株粪肠球菌进行鉴定和体外药物敏感性试验,利奈唑胺的低抑菌浓度(MIC)采用E-test法进行复核.采用聚合酶链反应(PCR)扩增其氯霉素-氟甲砜霉素耐药(cfr)基因、23S rRNAV区和基因组23S rRNA 4个拷贝基因,经测序确定突变情况.结果4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌均未扩增出cfr基因,23S rRNA V区扩增片段连接T载体随机挑选6克隆测序,未发现利奈唑胺耐药常见的G2576U突变.进一步分别扩增23S rRNA 4个拷贝基因并测序,仅1株菌存在1拷贝G2576U突变,4株菌均存在U2826C突变,另外还分别存在G2389A、U2363C和A2881G突变.U2826C位于23S rRNA可变区边缘,进一步扩增同期临床分离的利奈唑胺敏感粪肠球菌,测序结果显示均存在U2826C突变.结论 临床分离的4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌的23S rRNA存在散发突变,是其耐药的主要分子机制.
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武汉市丙酸杆菌对红霉素耐药与23S rRNA点突变和携带erm基因相关
目的 探讨武汉市耐红霉素丙酸杆菌23S rRNA有无点突变以及携带ermX基因的Tn5432转座子是否转入了丙酸杆菌.方法 从痤疮患者皮损中分离丙酸杆菌,E-test法检测分离株对红霉素和克林霉素的MIC值.PCR扩增耐药株23S rRNA、ermX、ermX(cj)、IS1249a、IS1249b并测序,并在基因库中比较.结果 19株痤疮丙酸杆菌(P.acnes)和10株卵白丙酸杆菌(P.avidum)对红霉素均表现为高度耐药(MIC均＞256 μg/ml).19株P.acnes中,16株对克林霉素高度耐药(MIC＞ 256 μg/ml),3株敏感;10株P.avidum对克林霉素高度耐药(MIC＞ 256 μg/ml).19株P.acnes耐药株中,7株在相当于E.coli 23S rRNA 2058位点发现由A→G点突变,均对红霉素和克林霉素高度耐药;4株在相当于E.coli 23SrRNA 2059位点发现由A→G点突变,其中1株对克林霉素耐药,3株敏感;另外8株P.acnes扩增ermX阳性,其序列与基因库中P.acnes ermX基因100％同源.10株P.avidum中,2株ermX扩增阳性,其序列与P.acnes ermX基因100％同源;另外8株扩增ermX(cj)得到预期片段PCR产物,与基因库中Corynebactedum jeikeium ermX(cj)序列99％同源,而与P.acnes ermX基因仅有94％的同源性.10株扩增ermX基因阳性的菌株扩增IS1249a和IS1249b均阳性,而其余菌株均阴性.结论武汉市耐红霉素丙酸杆菌分别由相当于E.coli 23S rRNA 2058、2059由A→G点突变、携带ermX的Tn5432传入以及ermX(cj)传入丙酸杆菌引起.
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幽门螺杆菌对两种抗生素的耐药性及相关基因突变分析
目的 分析浙江地区26株幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性,探讨H.pylori对克拉霉素、左氧氟沙星的耐药性,及其与23S rRNA基因、gyrA基因突变的关系.方法 采用E-test法测定H.pylori对克拉霉素和左氧氟沙星的低抑菌浓度(MIC),提取H.pylori基因组DNA,采用PCR法扩增23S rRNA和gyrA基因片段,并对扩增产物进行测序、分析.结果 药敏实验结果显示26例临床分离株中,6例对克拉霉素耐药,6例对左氧氟沙星耐药,8例对克拉霉素和左氧氟沙星双重耐药.所有克拉霉素耐药菌株23S rRNA基因都存在A2143G突变;左氧氟沙星耐药菌株gyrA基因中的喹诺酮类耐药决定区(quinolone-resistance-determining region,QRDR)存在突变,主要在第87和91位氨基酸.结论 23S rRNA基因的A2143G突变是导致H.pylori对克拉霉素耐药的主要原因;gyrA基因的87和91位氨基酸突变是导致H.pylori对左氧氟沙星耐药的主要原因.
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应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性
目的 建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法.方法 抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23S rRNA区187 bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序.结果 56份克拉霉素耐药的Hp菌株DNA经DHPLC分析,有51份存在异源双链峰,测序证实均存在点突变,5份无异源双链峰,测序证实无点突变,故DHPLC对基因突变耐药菌株的敏感性和特异性为100％,而且56份组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致.结论 DHPLC可应用于Hp对克拉霉素耐药性的快速检测,具有广阔的临床应用前景.
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解脲脲原体对大环内酯类抗生素耐药机制的研究
目的 探索解脲脲原体对大环内酯类抗生素的耐药机制.方法 自行设计引物,对已知药敏结果 的解脲脲原体进行编码核糖体蛋白L4/L22的基因以及23S rRNA的II区和V区的扩增并测序,比对分析其碱基和氨基酸的改变.结果 在耐药株X01核糖体蛋白L4上,出现第67位谷氨酰胺→赖氨酸和71位甘氨酸→丝氨酸的改变;敏感株Y292经阿奇霉素诱导耐药后,L22核糖体蛋白上出现9个氨基酸的改变;耐药株Y187 23S rRNA V区出现第2566位碱基T→C、第2569位缺失碱基G和第2621位碱基A→T的变化.结论 核糖体蛋白L4、L22以及23S rRNA上相应区域碱基、氨基酸的改变,可能是导致解脲脲原体对大环内酯类抗生素出现耐药的机制之一.
关键词： 解脲脲原体 核糖体蛋白L4/L22 23S rRNA 大环内酯类抗生素 -
检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR
目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)方法.方法根据贝氏柯克斯体特异的23S rRNA插入基因序列设计引物和探针,以克隆的23S rRNA插入基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900型)上建立实时荧光定量检测方法.结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍.用荧光定量PCR检测其它相关立克次体,检出结果均为0.用荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体感染的小鼠脾脏标本,脾脏中贝氏柯克斯体的感染量与感染过程具有相关性.结论本研究建立的检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合样本中微量贝氏柯克斯体DNA的检测,其定量检测可用于动物实验中的贝氏柯克斯体感染程度的分析.
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肺炎支原体大环内酯类药物耐药机制研究
目的 了解本地区儿童肺炎支原体(MP)的感染及大环内酯类耐药基因(23S rRNA)突变与耐药的相关性.方法 收集614例肺炎患儿呼吸道样本,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测MP感染及23S rRNA基因2063和/或2064 A→G点突变情况,对MP阳性样本进行药敏试验,分析23S rRNA基因2063和/或2064 A→G点突变与大环内酯类药物耐药相关性.结果 614例样本,MP阳性77例,阳性率为12.5％,其中59例23S rRNA存在2063和/或2064A→G点突变,突变发生率为76.6％.所有突变株对对5种大环内酯类药物均不敏感,所有未突变株5种大环内酯类药物均敏感.结论 肺炎支原体对大环内酯类药物耐药严重,耐药机制是23S rRNA基因2063和/或2064 A→G点突变,RT-PCR检测MP感染及23S rRNA基因点突变能为肺炎患儿临床MP感染的诊断和治疗提供一定的参考依据.
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幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性与23S rRNA基因突变相关性分析
[目的]研究本地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)的克拉霉素耐药与23S rRNA基因位点突变的关系,为临床根除HP治疗提供依据.[方法]入选消化性溃疡患者180例,在胃窦小弯侧距幽门2～3cm范围内取1块胃黏膜组织行常规病理检查,在胃窦小弯侧、十二指肠球部、胃体大弯侧各取1块黏膜行HP培养,对HP阳性分离菌株进行药敏实验.选取其中克拉霉素耐药菌株35例及敏感菌株30例,对23S rRNA基因PCR扩增后进行全基因测序对比分析.[结果] 180例中HP阳性率占76.11％,活检组织培养HP阳性率占73.89％.药敏检查结果克拉霉素耐药率为33.08％.HP23S rRNA测序结果显示存在多位点突变,耐药组及非耐药组中T2182C普遍存在,A2143G、A2142G和A2097G在耐药组中多见,A2097C、A2097T仅在敏感组中发现,差异有统计学意义.[结论]本地区HP对克拉霉素耐药率高,克拉霉素耐药菌株A2143G、A2142G和A2097G位点突变高于敏感组,建议根据药敏试验指导根除HP方案.
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PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在肠杆菌科食源性感染致病菌鉴定中的应用
目的探讨运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌快速鉴定方法的可行性.方法选取肠杆菌科食源性感染14种常见致病菌的23 S rRNA基因作为鉴别靶基因,采用通用引物PCR(UP-PCR)进行扩增,并对PCR产物的酶切片段进行限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP).结果针对23S rRNA基因片段的Hpa Ⅱ酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现出相似的RFLP图谱.SSCP分析显示,14种肠杆菌科常见致病菌SSCP图谱变异性很大,有利于进行细菌鉴定.结论运用PCR-SSCP技术可进行肠杆菌科食源性感染致病菌的快速鉴定.
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界膜组织细菌16S rRNA和23S rRNA对假体周围感染的诊意义
目的 对界膜组织中细菌16S rRNA、23S rRNA进行PCR检测,分析比较两者单独以为及联合应用于假体周围感染诊断的效率.方法 应用诊断标准对本机构67例髋关节翻修患者是否患有假体周围感染(PJI)作出诊断;用PCR技术检测各界膜组织中细菌16S rRNA和23S rRNA基因片段的表达,同样对PJI作出诊断.分别将16S rRNA、23S rRNA、16S rRNA/23S rRNA(即16S rRNA或23S rRNA检测一项为阳性结果即可)以及16S rRNA+23S rRNA 4种策略的诊断结果与诊断标准的结果比较,分析4种策略的敏感性、特异性、阳性及阴性预测值、准确性的差异.结果 应用16S rRNA/23S rRNA诊断的敏感性和阴性预测值均高于16S rRNA+23S rRNA(95.7％vs52.2％,P＜0.01;97.6％vs79.6％,P=0.01).4种诊断策略的特异性、阳性预测值以及准确性无显著性差异,单独应用16S rRNA或23S rRNA的诊断效率相当.结论 单独应用16S rRNA或23S rRNA进行诊断的效率明显差异,16S rRNA/23S rRNA较16S rRNA+23S rRNA更为敏感,且阴性结果可信度更高.
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舟山群岛渔民幽门螺杆菌克拉霉素耐药菌株23S rRNA全基因生物信息学研究
目的:通过对舟山群岛渔民胃镜检查患者分离胃黏膜幽门螺杆菌(Hp),对Hp克拉霉素的耐药情况和耐药基因进行研究,指导合理使用克拉霉素治疗却.方法:取188份胃镜活检标本,却培养后对188株Hp临床分离株采用E-test法行克拉霉素药敏试验.对17株克拉霉素耐药和3株敏感的Hp23S rRNA全基因序列和3株标准序列进行比对和生物信息学分析.结果:胃炎患者Hp培养阳性率为26.5%(27/102),溃疡患者培养阳性率为48.7%(38/78),胃癌患者培养阳性率为25.0%(2/8),溃疡患者Hp培养阳性率明显高于胃炎患者和胃癌患者.67例Hp菌株克拉霉素耐药23株.占34.3%(23/67),敏感株44株,占65.7%(44/67).胃炎患者、溃疡患者和胃癌患者克拉霉素耐药率分别为29.6%(8/27)、36.8%(14/38)和50.0%(1/2).17株克拉霉素耐药Hp菌株2143位点A＞G突变率为29.4%,2182位点C＞T突变率为11.8%:新的突变点C588U在6株耐药株中出现,而且该6株茵未见其他已知突变.结论:舟山群岛渔民溃疡患者Hp培养阳性率和克拉霉素耐药率明显高于胃炎患者.本地区分离的克拉霉素耐药Hp菌株C588U变异点可能是克拉霉素耐药新的突变位点.
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肺炎支原体对红霉素体外耐药性与耐药基因相关性研究
目的：探讨肺炎支原体（Mp）对红霉素耐药与耐药基因之间的关系。方法通过对46株红霉素耐药 Mp 临床分离株的23S rRNA Ⅴ区进行聚合酶链反应（PCR）扩增，并将扩增产物进行基因测序，确定其基因型。结果46株红霉素耐药 Mp 临床分离株中有44株（95．65％）发生 A2063G 突变，2株（4．35％）A2064G 突变，未见 A2063C 和 C2617G／A 位点突变。结论 Mp临床分离株对红霉素耐药与23S rRNA Ⅴ区基因2063、2064位点 A→G 突变有密切关系，其中主要的突变是 A2063G 突变。快速、准确识别 Mp 的23S rRNA Ⅴ区基因突变可在诊断的同时给出耐药信息，有效指导临床合理用药。
