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鲍曼不动杆菌喹诺酮类耐药基因突变分析
目的 调查鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药情况,并对喹诺酮类耐药基因突变进行分析.方法 对中南大学湘雅附二医院2002～2008年间鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药情况进行统计.同时于2008年7～12月随机收集50株鲍曼不动杆菌,PCR扩增gyrA基因和parC基因,并对扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP),选取部分PCR扩增产物进行测序和分析.结果 鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药率呈逐年上升的趋势.50株鲍曼不动杆菌对环丙沙星耐药率为62%,对左氧氟沙星耐药率为46%.gyrA基因及parC基因扩增分别获得305 bp和400 bp的基因产物.PCR-RFLP结果显示,对gyrA基因,耐药株100%不能被Hinf Ⅰ酶切,敏感株53%能被Hinf Ⅰ酶切;对parC基因,耐药株29%能被Hinf Ⅰ酶切,敏感株有63%能被Hinf Ⅰ酶切.分析测序结果,耐药株中的gyrA基因和parC基因存在突变,未被酶切的敏感株也存在突变,使Hinf Ⅰ的识别序列GACTC变为GACTT,酶切位点GANTC消失.被酶切耐药株中发现parC基因新的突变点,第89碱基密码子GAA中的A突变成G,被酶切敏感株的parC基因出现多个位点的同义突变.结论 鲍曼不动杆菌临床分离株对喹诺酮类药物耐药情况严重,呈逐年上升的趋势.鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物产生耐药与gyrA基因突变和parC基因突变有关.
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大肠埃希菌尿液分离株中检出gyrA基因新变异株
目的 调查大肠埃希菌尿液分离株中喹诺酮类耐药相关基因的存在与变化状况.方法 收集宁波市第一医院2008年10月到2009年3月患者尿液标本中分离的大肠埃希菌共28株,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析1种染色体介导的喹诺酮类耐药相关基因(gyrA基因)和5种质粒介导的喹诺酮类耐药相关基因[qnrA、qnrB、qnrS、aac(6＇)-Ⅰb、qepA].结果 28株大肠埃希菌检测到1株aac(6＇)-Ⅰb-Cr基因阳性株(经测序比对证实),qnrA、qnrB、qnrS、qepA基因均未检出.gyrA基因83位密码子28株菌都有突变(100.0%),其突变方式为TCG-83→HTG,导致氨基酸从丝氨酸(S)-83→亮氨酸(L);87位密码子22株菌(78.6%)有突变,可分为两种突变方式:21株(75.0%)突变方式为GAC-87→AAC,导致氨基酸从天冬氨酸(D)-87→天冬酰胺(N);5号株gyrA基因(3.6%)为新亚型,其突变方式为GAC-87→TAC,导致氨基酸从天冬氨酸(D)-87→脯氨酸(Y),另6株菌87位密码子无突变.结论 本组大肠埃希菌gyrA基因突变率为100.0%,是喹诺酮类耐药的主要原因.其他耐药相关基因阳性率很低.
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gyrA和parE基因检测在脲原体基因分型中的应用
目的 研究gyrA和parE基因检测在脲原体基因分型中的作用.方法 脲原体培养与药敏分析用Mycoplasma IST检测试剂盒;在脲原体培养阳性者中选取对喹诺酬耐药标本60份,PCR扩增gyrA和parE基因,扩增产物经测序分析后与基因库中的脲原体各血清型进行比对.结果 gyrA扩增片段在血清型1、3、6、14之间核苷酸序列相似性为100%,在血清型2,4、5、7～13之间核苷酸序列相似性100%,两组之间核苷酸序列相似性91%.parE扩增片段在血清型1、3、6、14之间的核苷酸序列相似性为98%～99%;pare扩增片段在血清犁2、5、7、8、11之间核苷酸序列相似性100%,在血清型4、12、13之间核苷酸序列相似性100%,两组之间核苷酸序列相似性为90%.60份标本中微小脲原体(Ureaplasma parvum,Up)占68.3%(41/60),解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)占21.7%(13/60),两型混合感染占10%(6/60).在Up中,血清型3占48.8%(20/41).结论 gyrA检测可把脲原体分为微小脲原体和解脲脲原体两个基因型,parE检测可把微小脲原体分为4个亚型,分别与血清型1、3、6、14完全一致,其中血清型3感染常见.
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多重耐药克雷伯菌gyrA和parC基因新变异型
目的 对多重耐药克雷伯菌属中喹诺酮类耐药相关基因的分布和变异情况进行分析.方法 连续收集2010年2月至2012年3月南京医科大学附属淮安第一医院住院患者中分离的多重耐药克雷伯菌共20株,用分子鉴定法鉴定菌种,再用聚合酶链反应(PCR)法分析喹诺酮类药物作用靶位基因gyrA与parC,以及可移动遗传元件介导的喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6 ′)-Ⅰ b-cr).结果 本组20株克雷伯菌中,19株为肺炎克雷伯菌,1株为变栖克雷伯菌.20株克雷伯菌均检测到gyrA和parC基因,其中gyrA基因突变率为55.0％ (11/20),parC基因突变率为55.0％(11/20)；aac(6′)-Ⅰ b-cr基因阳性率为50.0％(10/20),qnrA基因阳性率为5.0％(1/20),qnrB基因阳性率为15.0％(3/20).其中6号株与10号株的gyrA与parC基因均为新的变异型(美国GenBank 登录号分别为:JX123016、JX123017与JX144393、JX144394).结论 肺炎克雷伯菌中gyrA和parC基因同时为新的变异型属国内首次报道,该菌对喹诺酮类药物的耐药主要与喹诺酮类耐药决定区突变相关.
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肺移植患者泛耐药铜绿假单胞菌耐喹诺酮gyrA基因突变的研究
由于广谱抗菌药物的广泛应用和不合理使用,世界范围内铜绿假单胞菌的耐药率逐年上升,已呈多药耐药趋势,甚至出现泛耐药菌株,使医生无药可用.氟喹诺酮类对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,是对铜绿假单胞菌惟一有效的口服药物.它通过抑制DNA促旋酶或拓扑异构酶Ⅳ而抑制DNA的合成,从而发挥抑菌和杀菌的作用.因此,DNA促旋酶的基因突变被认为是铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类产生耐药的主要机制[1-2].本文对1株从肺移植患者痰液样本中分离到的泛耐药铜绿假单胞菌DNA促旋酶A亚单位(gyrA)基因的序列进行了分析.
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耐喹诺酮类大肠埃希菌耐药机制的研究
目的 探讨耐喹诺酮类大肠埃希菌的耐药机制.方法 收集天津市第一中心医院2004年3月-2005年10月临床分离的大肠埃希菌,并随机选取40株作为研究对象,通过K-B药片试纸法和微量稀释法测40株目的菌株的耐药性;PCR扩增耐药株的gyrA QRDR区和parC基因,进行PCR-SSCP分析;同时,PCR扩增marOR基因,在耐药株中随机选取进行测序,检测marOR基因突变情况.结果 37株对耐喹诺酮类菌株均出现了gyrA基因突变,除常见氨基酸改变外,还发现Asp87→Asn、Ala84→Pro;36株耐喹诺酮菌株发生了parC基因突变,只对萘啶酸耐药,对环丙沙星中介、氧氟沙星、加替沙星敏感的ECO24未出现parC基因突变;只对氟喹诺酮类耐药的ECO11未出现marOR区突变;存在多重耐药的ECO5 marOR区发现6处突变,且1 879 bp处的突变改变了marOR的终止密码子.结论 gyrA和parC基因突变引起大肠埃希菌产生耐药,gyrA基因突变是产生对氟喹诺酮类耐药的主要原因,parC 基因突变可引起菌株对氟喹诺酮类药物的高水平耐药,marOR的多位点突变在多重耐药机制中有一定的作用.
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变性高效液相色谱技术检测qnr阳性肺炎克雷伯菌染色体突变位点
目的 检测质粒介导喹诺酮耐药基因(quinolone resistance,qnr)阳性肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)染色体旋转酶GyrA和拓扑异构酶ParC的突变位点.方法 应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)对有异常峰型的菌株进行DNA测序.结果 qnr阳性Kpn GyrA亚基存在4种氨基酸突变类型,ParC亚基存在2种氨基酸突变类型.结论 喹诺酮作用靶位GyrA和ParC亚基是否存在氨基酸变异与临床qnr阳性菌株耐药水平的差异有关,其位点突变对高水平耐药起重要作用.DHPLC联合测序可用于高通量检测微生物小片段基因点突变.
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从耐药产气肠杆菌中首次发现DNA旋转酶A亚单位基因gyrA新的变异型
目的 全面了解2株耐药产气肠杆菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类的耐药机制.方法 2株耐药产气肠杆菌:zjm001株和zjm002株,分离自2012年3月一家三级甲等医院住院患者送检的血液标本,做gyrA和parC基因扩增、测序、GenBank比对确认菌种,再用PCR法分析39种β-内酰胺类药物获得性耐药基因、14种氨基糖苷类药物获得性耐药基因、7种喹诺酮类耐药相关基因、11种可移动遗传元件标记.结果 zjm001株的β-内酰胺类耐药基因检出CTX-M-3,氨基糖苷类耐药基因检出ant(3”)-Ⅰ,喹诺酮类耐药基因检出gyrA突变,可移动遗传元件检出int Ⅰ 1、ISEcp1、IS26、IS903；zjm002株的β-内酰胺类耐药基因检出ACT-1、CMY-2,喹诺酮类耐药基因检出gyrA突变.2株耐药产气肠杆菌的gyrA基因序列均为新变异型,GenBank登录号分别为:JX268598,JX273641.结论 2株耐药产气肠杆菌的耐药基因与耐药表型相符.在耐药产气肠杆菌中发现DNA旋转酶A亚单位基因gyrA新变异型是国内首次报道.
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皖北地区MRSA耐药基因研究
目的 了解皖北地区临床分离的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)所携带5类药物的7种耐药基因状况,并探讨其耐药特性.方法 应用PCR方法检测64株MRSA中mecA、gyrA、qacA/B/C、qacA、ermA/B/C、ermB、tetM耐药基因.结果 64株MRSA中,mecA基因携带率为100%,tetM、gyrA、qacA/B/C、qacA、ermA/B/C、ermB基因携带率分别为95.3%、81.3%、34.4%、15.6%、39.1%、28.1%;基因组合以mecA+tetM+gyrA模式多,为26.5%.MRSA对万古霉素无耐药,对氯霉素、磷霉素、利福平的耐药性较低,对多种药物表现出较高的耐药性.结论 皖北地区MRSA中,mecA、tetM、gyrA基因携带率较高,而qacA/B/C、qacA、ermA/B/C、ermB基因携带率相对较低.
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鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制研究
目的 探讨鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制.方法 收集我院2006年5月-2007年2月不同患者痰培养标本中分离的鲍曼不动杆菌80株,剔除重复菌株用肉汤稀释法测定菌株在环丙沙星、含有不同浓度羟基氰氯苯胺(CCCP)的环丙沙星、亚胺培南-西司他丁的MIC.PCR扩增gyrA基因和parC基因并进行酶切分析,选取部分PCR扩增产物进行测序鉴定.荧光定量PCR方法检测环丙沙星敏感株与耐药株的adeB mRNA表达的相对定量.结果 鲍曼不动杆菌对环丙沙星的敏感率为15%,随加入CCCP的浓度增高而增加,并接近亚胺培南的敏感率.PCR限制性片段长度多态性(RFLP)分析显示,58株耐药菌中39株gyrA基因不能被Hinf I酶切,23株praC基因不能被Hinf I酶切,敏感株均能被Hinf I酶切,耐药株中的gyrA和parC基因存在突变.环丙沙星耐药菌株的adeB mRNA表达量明显高于敏感菌株.结论 鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物耐药除了与gyrA、praC基因突变有关外,还与主动外排泵基因adeB mRNA过表达有关.
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大肠埃希菌临床菌株对氟喹诺酮类的耐药机制
NA旋转酶编码基因(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶编码基因(parC和parE)的染色体突变、多重药物外排泵AcrAB表达水平升高以及存在质粒介导acc(6′)-Ib-cr和各种qnr基因等耐药机制均可导致氟喹诺酮类药物对大肠埃希菌的MIC升高.
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上海市一区级医院老年患者尿路致病性大肠埃希菌分子分型和耐药性分析
目的：了解上海市普陀区老年患者分离的尿路致病性大肠埃希菌（UPEC）的分子流行病学特征和耐药特征。方法收集上海中医药大学附属普陀医院2013年1月至2015年3月自泌尿道感染住院老年患者分离的72株 UPEC ，进行多位点序列分型（MLST ），检测β‐内酰胺酶基因和质粒介导的喹诺酮耐药基因（PMQR），检测 gyrA 和 parC 基因喹诺酮耐药决定区（QRDR）基因突变，并进行体外药物敏感试验。均数比较采用 t 检验，率的比较采用χ2检验或 Fisher 确切概率法。结果UPEC 对环丙沙星、头孢噻肟、复方磺胺甲口恶唑的耐药率分别为76．4％、73．6％、65．3％，而对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、哌拉西林‐他唑巴坦仍保持高度敏感。72株 UPEC 中，55株（76．4％）为超广谱β‐内酰胺酶（ESBL）阳性菌株，其中49株（68．1％）携带 blaCTX‐M 基因。在55株对环丙沙星耐药的菌株中，51株（92．7％）UPEC gyrA 和 parC 基因 QRDR 均有3～4个位点的错义突变，突变热点为 gyrA的83位、87位氨基酸和 parC 的80位、84位氨基酸。72株 UPEC 中常见 ST 型为 ST131（18／72，25．0％）、ST1193（7／72，9．7％）、ST405（7／72，9．7％）、ST38（5／72，6．9％）和 ST648（3／72，4．2％）。ST131为导致社区获得性泌尿道感染的优势 ST 型。 ST131、ST405、ST38和 ST648表现出多重耐药特性，大多数为产 CTX‐M 型 ESBL 。结论本研究的社区老年患者携带的 UPEC 中存在以 ST131克隆为代表的多重耐药菌株流行，需要加强监测，预防其广泛流行。
关键词： 尿路致病性大肠埃希菌 老年患者 多位点序列分型 耐药性 gyrA parC 超广谱 β-内酰胺酶 ST131 -
沙眼衣原体对喹诺酮类药物的体外敏感性及gyrA喹诺酮耐药决定区RFLP分析
随着喹诺酮类抗菌药在临床的广泛应用,沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)感染治疗失败与耐药的报道日渐增多.对喹诺酮类药物耐药的产生主要与gyrA的喹诺酮耐药决定区(quinolone-resistance determining region)点突变有关[1].为了监测近年天津地区Ct对喹诺酮类抗菌药的敏感性,我们检测了52株临床分离株的体外敏感性,并且采用限制性片段长度多态性(RFLP)研究喹诺酮耐药决定区点突变.
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用变性高压液相色谱检测结核分枝杆菌耐药株
目的 利用变性高压液相色谱(DHPLC)技术快速检测结核分枝杆菌gyrA基因的突变,对结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物做出初步判断.方法 提取试验菌株基因组DNA,扩增gyrA基因的氟喹诺酮药物耐受决定区(QRDR)核酸片段;分别与H37Rv标准株(或者含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准)的相应PCR产物混合、杂交后,用WAVE核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行DHPLC检测;序列测定结果与相应的DHPLC检测结果进行比较以验证DHPLC检测的准确性.用2 mg/L的药物浓度进行氧氟沙星(OFLX)药物敏感性试验,确定101株结核分枝杆菌临床分离株对OFLX的敏感性,通过比较药物敏感性和DHPLC检测结果,建立两者之间的对应关系.结果 用DHPLC检测QRDR突变与序列测定具有同样的检出率(100%),两者都能够很好地检测QRDR突变.用单纯含有Ser284突变的临床分离株代替H37Rv作为标准进行DHPLC检测,可以检测出除与耐药性无关的Ser284突变点外所有的点突变形式.在101株结核分枝杆菌临床分离株中,有49株对2 mg/LOFLX敏感,52株耐受.52株耐药菌株中,有27株能够通过序列测定和DHPLC法得到准确判定.结论 DHPLC法是快速检测出结核分枝杆菌gyrA基因碱基突变的好方法,但是碱基突变与结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物存在复杂的关系,造成检测准确性无预期中的高,因此该方法应用于临床检测尚需进一步验证.
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健康人群肠道大肠埃希菌对氟喹诺酮药物的耐药性及耐药机制研究
目的研究健康人群(2周内未使用过抗菌药物)肠道分离的110株大肠埃希菌对4种氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性及耐药机制.方法用琼脂稀释法测定4种氟喹诺酮类抗菌药物对110株大肠埃希菌的低抑菌浓度(MIC).用聚合酶链反应扩增gyrA、parc基因,序列分析明确其突变情况,并与28株2周内使用过抗菌药物病人肠道分离的菌株进行比较.结果大肠埃希菌对4种氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率未用药组为12.7%～15.5%,用药组为20.8%～25.0%.测序发现60号敏感菌株没有任何氨基酸突变.11株耐药菌中,gyrA基因编码的氨基酸均存在83位突变,即Ser83→Leu;其中8株存在双突变,即同时Asp87→Asn;6株存在3个突变,还包括Clu214→Gly.parC基因编码的氨基酸中,有8株存在Ser80→Ile突变,另有2株存在Glu84→Gly突变.结论健康人群肠道大肠埃希菌对4种氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率为12.7%～15.5%,主要由gyrA基因和parC基因位点突变造成,以gyrA基因为主.
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幽门螺杆菌对两种抗生素的耐药性及相关基因突变分析
目的 分析浙江地区26株幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性,探讨H.pylori对克拉霉素、左氧氟沙星的耐药性,及其与23S rRNA基因、gyrA基因突变的关系.方法 采用E-test法测定H.pylori对克拉霉素和左氧氟沙星的低抑菌浓度(MIC),提取H.pylori基因组DNA,采用PCR法扩增23S rRNA和gyrA基因片段,并对扩增产物进行测序、分析.结果 药敏实验结果显示26例临床分离株中,6例对克拉霉素耐药,6例对左氧氟沙星耐药,8例对克拉霉素和左氧氟沙星双重耐药.所有克拉霉素耐药菌株23S rRNA基因都存在A2143G突变;左氧氟沙星耐药菌株gyrA基因中的喹诺酮类耐药决定区(quinolone-resistance-determining region,QRDR)存在突变,主要在第87和91位氨基酸.结论 23S rRNA基因的A2143G突变是导致H.pylori对克拉霉素耐药的主要原因;gyrA基因的87和91位氨基酸突变是导致H.pylori对左氧氟沙星耐药的主要原因.
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PCR 检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌耐药基因
目的:了解安徽省宿州地区临床分离的耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)所携带的7种耐药基因状况.方法:使用聚合酶链反应方法检测133株MRCNS中mecA、gyrA、qacA/B/C、qacA、ermA/B/C、ermB、TetM耐药基因.结果:133株MRCNS中,mecA基因携带率为100.0%,gyrA、qacA/B/C、qacA、TetM、ermA/B/C、ermB基因携带率依次为47.4%、51.9%、45.1%、25.6%、24.8%、12.0%.结论:安徽省宿州地区MRCNS中mecA、qacA/B/C、qacA基因携带情况常见,gyrA、TetM基因携带率较高,而ermA/B/C、ermB较低.
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粪肠球菌gyrA基因突变与氟喹诺酮类耐药性关系的研究
目的探讨粪肠球菌DNA促旋酶A亚单位(gyrA)基因突变与氟喹诺酮类耐药的关系.方法琼脂稀释法测定粪肠球菌对各种氟喹诺酮类药物的耐药情况;聚合酶链反应(PCR)结合单链构象多态性(SSCP)分析检测gyrA中氟喹诺酮类耐药决定区(QRDR)突变情况.结果粪肠球菌对诺氟沙星耐药率为78.1%(50/64),加替沙星为54.7%(35/64).41株耐药菌的第87位氨基酸编码碱基发生突变(GAA→GGA).结论加替沙星的耐药率较低,优于其他氟喹诺酮类药物;gyrA基因突变是粪肠球菌对氟喹诺酮类耐药的重要原因.
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泛耐药鲍氏不动杆菌喹诺酮类耐药相关基因研究
目的:调查泛耐药鲍氏不动杆菌喹诺酮类耐药相关基因的存在情况.方法:收集2008年1月- 2008年12月住院患者标本中分离的泛耐药鲍氏不动杆菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR)的方法分析6种喹诺酮类耐药相关基因.结果:20株泛耐药鲍氏不动杆菌均存在gyrA基因第83位TCA→TTA突变,其它5种基因均未检出.结论:本组20株泛耐药鲍氏不动杆菌耐喹诺酮类药物与gyrA突变和AdeABC外排泵相关.
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青岛地区幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药性及gyrA基因突变分析
目的 分析青岛地区幽门螺杆菌(H.pylori)对左氧氟沙星的耐药现状,探讨H.pylori对左氧氟沙星耐药性与gyrA基因突变之间的关系.方法 收集胃癌及胃炎患者的胃窦部黏膜标本,分离培养H.pylori,采用E-test法测定H.pylori对左氧氟沙星的低抑菌浓度(MIC),提取H.pylori基因组DNA,PCR法扩增gyrA基因片段并对扩增产物测序、分析.结果 从患者胃黏膜中成功分离出65例H.pylori菌株,23例对左氧氟沙星耐药(MIC＞1μg/ml),占总菌株的35.4％,所有耐药菌株gyrA基因中的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)都存在突变位点,且以第87位点的氨基酸发生突变为主,而敏感菌株中未发现基因突变位点.结论 青岛地区H.pylori对左氧氟沙星的耐药率高于国内其他地区,表明gyrA基因突变是导致H.pylori对左氧氟沙星耐药的主要原因.
