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多重连接依赖式探针扩增和变性高效液相色谱法检测Duchenne型肌营养不良症患者DMD基因的缺失/重复突变
目的 比较多重连接依赖式探针扩增法(MLPA)和变性高效液相色谱法(DHPLC)检测Duchenne型肌营养不良症(DMD)患者DMD基因缺失/重复突变的效果.方法 选择2004年10月～2005年10月在我院确诊的22位无关DMD男性患者,采用MLPA法对经DHPLC技术检测过的患者的DMD基因的缺失/重复突变进行突变筛查,同时对先证者的23位女性亲属进行基因的缺失/重复突变检测.结果 DHPLC技术和MLPA法均检测出11位先证者具有DMD基因缺失突变,3位先证者具有DMD重复突变;MLPA法除能更精确地检测出上述突变外,还检测出DHPLC法未检测出的两位患者的DMD基因存在缺失突变.16个家系中18位可能的女性携带者中,12位经检测为缺失/重复突变携带者.两种方法均未检测到6位先证者及其女性亲属DMD基因具有缺失/重复突变.结论 与DHPLC法和传统的多重PCR方法相比,MLPA法检测DMD基因的缺失/重复突变位置更为准确.MLPA法可用于检测先证者及家系中女性携带者DMD基因的缺失/重复突变.
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遗传性先天性白内障与αA-晶体蛋白基因相关性研究
目的分析遗传性先天性核性和绕核性白内障与定位于21q22.3的αA-晶体蛋白(CRYAA)基因之间的关系.同时对比单链构象多态性(SSCP)和变性高效液相色谱法(DHPLC)两种方法检测单核苷酸多态性(SNP).方法用PCR方法扩增CRYAA基因的3个外显子,分别用SSCP和DHPLC两种方法分析扩增产物,对异常者进行DNA测序,寻找基因变异情况.结果用SSCP分析15个样本,未见异常条带;同时用DHPLC检测15个样本,其中1个样本出现双峰,将该样本扩增产物测序鉴定,发现在5′端第6个核苷酸为G/A杂合,二者是同一氨基酸的2个密码子,该核苷酸为CRYAA基因的多态性位点.未发现该基因突变.结论实验中未发现15例先天性白内障患者与CRYAA基因之间有关联.应用SSCP与DHPLC同时分析,DHPLC检测出1个多态性位点.DHPLC对杂合子检出的敏感性要高于SSCP.
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变性高效液相色谱分析的技术特征及其应用
近年来建立并得以迅速发展的变性高效液相色谱分析(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失,已被证实确为一种高性价比的检测技术.现对其基本原理、方法特点及实际应用过程中的注意事项作一简述.
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肌萎缩侧索硬化症家系铜锌超氧化物歧化酶基因突变位点的检测
目的:检测一个具有特殊临床表型的肌萎缩侧索硬化症(ALS)家系的铜、锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变位点,同时比较单链构象多态性(SSCP)和变性高效液相色谱法(DHPLC)的实用价值.方法:采用SOD1基因的5对引物对部分家系成员基因组DNA进行PCR扩增,分别采用SSCP和DHPLC分析各外显子的多态性,异常样本进行DNA直接测序.结果:①两种方法均发现家系成员Ⅱ5、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ13、Ⅲ20、Ⅳ1、Ⅳ20的第2外显子和家系成员Ⅲ1、Ⅲ11、Ⅲ20第5外显子存在突变,直接测序证实第2外显子编码区和第5外显子非编码区均插入了一个碱基A.②DHPLC还发现家系成员Ⅲ1的第4外显子有杂合子色谱,直接测序证实其第4外显子存在杂合子,发生了GAA→GGA错义突变.结论:①该家系SOD1基因第2、4、5外显子均存在突变,第2外显子的突变可能是引起该家系发病的原因.②DHPLC技术与PCR-SSCP相比有更高的敏感性,可作为大样本筛查突变位点的一种便捷、可靠的手段.
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中国2型糖尿病人中CYP2C8、CYP2C9基因多态性
目的:查明CYP2C9、CYP2C8等抗糖尿病药物主要代谢酶的基因多态性在中国2型糖尿病(T2DM)人群中的分布频率和分布特征.方法:运用多聚酶链反应-限制性长度多态性(PCR-RFLP)方法和变性高效液相色谱法(DHPLC)对222名中国T2DM患者进行了有功能意义的CYP2C8~*3、CYP2C817404A和CYP2C9~*3,以及可能存在功能意义的CYP2C8IVS2(-5insert t)突变体等等位基因型检测,并计算了各等位基因的频率.结果:222名中国T2DM患者的CYP2C8基因中未检出CYP2C8~*3、P404A型,CYP2C8IVS2(-5insert t)和CYP2C9~*3等位基因的频率分别为43.0%、2.48%,二者突变等位基因在男、女性别分布中不存在差异(P＞0.05),同时为CYP2C8 IVS2(-5i-nsert t)和CYP2C9~*1~*3基因的频率为6.3%,该联合突变基因型的分布也不存在性别差异(P＞0.05).结论:中国T2DM患者中CYP2C9~*3的等位基因频率为2.48%;未检出CYP2C8~*3和P404A型,CYlY2C8IVS2(-5insert t)突变体发生频率为43.0%,其是否影响CYP2C8的代谢活力有待于进一步研究.
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应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性
目的 建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法.方法 抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23S rRNA区187 bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序.结果 56份克拉霉素耐药的Hp菌株DNA经DHPLC分析,有51份存在异源双链峰,测序证实均存在点突变,5份无异源双链峰,测序证实无点突变,故DHPLC对基因突变耐药菌株的敏感性和特异性为100％,而且56份组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致.结论 DHPLC可应用于Hp对克拉霉素耐药性的快速检测,具有广阔的临床应用前景.
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变性高效液相色谱在分子生物学中的应用
变性高效液相色谱法(DHPLC)是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法.它因使用的温度不同而有不同的应用价值:在非变性温度下进行双链DNA分离,在部分变性温度下进行基因突变、单核苷酸多态性和甲基化测定.在完全变性温度下对寡核苷酸进行质控和纯化等.由于该技术具有快速、经济、准确和自动化程度高等特点,目前已经成为分子生物学常用技术之一.
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PAX4基因多态性与胰岛自身抗体阴性酮症倾向糖尿病的关系
目的:探讨配对盒4(paired box 4,PAX4) 基因多态性与胰岛自身抗体阴性酮症倾向糖尿病(KPD)的关系.方法:应用变性高效液相色谱法(DHPLC)筛查141例谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD-Ab)和蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(IA-2Ab)阴性的KPD患者(KPD组)和112例非糖尿病对照者(NC组)的PAX4基因外显子3和9,对异常峰型者经测序证实其碱基改变.应用聚合酶链反应-限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)法对141例KPD患者和308例对照者的PAX4基因A1168C多态位点进行等位基因和基因型频率分析.结果:在本组人群中未发现PAX4基因外显子3有变异.外显子9中的单核苷酸多态性(SNP)位点A1168C,引起错义突变P321H(rs712701). A1168C位点的C等位基因和CC基因型频率在KPD组与NC组间差异无统计学意义;按性别分层后,KPD组C等位基因和CC基因型频率差异均有统计学意义(P=0.009,0.028);以年龄分层后,＜20岁组与≥20岁组比较C等位基因和CC基因型频率分布差异均有统计学意义(P=0.034,0.032); 在CC基因型的KPD患者中,空腹C肽(FCP)水平高于AA基因型者,差异有统计学意义(P=0.005).结论:本组中国南方汉族人群PAX4基因A1168C(P321H)多态性与胰岛自身抗体阴性KPD未见关联,但分层研究提示PAX4基因A1168C多态性对男性和＜20岁的KPD患者的发病可能有影响.
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变性高效液相色谱在检测肝豆状核变性基因突变中的作用
目的建立变性高效液相色谱(denaturing high Performance liquid chromatography,DHPLC)技术检测肝豆状核变性(WD)基因第8外显予突变.方法利用聚合酶链式反应(PCR)扩增WD基因第8外显子片段,扩增产物直接进行DHPL(分析;对峰型有改变的样品经测序分析确认突变.结果在51例WD先证者中共发现两种错义突变(Arg778Leu和Arg778Gln)、一种插入突变(Ins2302C)和一种多态性位点(C2310G).其中12例先证者带有Arg778Leu杂合错义突变,3例为Arg778Leu纯合错义突变,1例为Arg778Gln杂合错义突变,1例为杂合2302C插入突变.多态位点C2310G与Arg778Leu突变完全连锁.结论 WD基因第8外显子阳性检出率为33.3%(17/51),说明DHPLC技术是一种可用于临床WD基因诊断的高效、灵敏和操作简便的方法.
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变性高效液相色谱法在FALS突变位点检测中的应用
目的检测一个肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)家系的铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn su-peroxide dismutase,SOD1)基因的突变位点,同时观察变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)的实用价值.方法对PCR-SSCP检测阴性的外显子,应用DHPLC法及DNA直接测序技术,再次进行SOD1基因的突变位点检测.结果经DHPLC检测,家系成员Ⅲ1SOD1基因的第4外显子有突变峰,DNA直接测序证实存在杂合子,发生了GAA→GGA错义突变,使编码的氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸.结论DHPLC技术与PCR-SSCP相比有更高的敏感性,可作为大样本筛查突变位点的一种便捷可靠手段.
关键词： 家族性肌萎缩侧索硬化症 铜、锌超氧化物歧化酶 变性高效液相色谱法 突变 -
Marfan综合征两种原纤维蛋白1基因突变
目的 对14例Marfan综合征(Marfan syndrome, MFS)患者的原纤维蛋白1(fibrillin 1, FBN1)基因和转化生长因子β受体2(transforming growth factor beta receptor type Ⅱ,TGFBR2)基因进行突变筛查.方法 应用变性高效液相色谱法对MFS患者FBN1的65个外显子和TGFBR2基因的7个外显子进行突变筛查,对变性高效液相色谱图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位点及性质,并用限制性片段长度多态性方法进一步证实突变.结果 在MFS患者FBN1基因中发现两种突变.两种基因突变是新的FBN1置换突变(Intron29 +4A＞T)和再发的FBN1无义突变(8080C＞T).结论 FBN1的Intron29 +4A＞T和8080C＞T可能是MFS患者的发病原因.
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用温度调控高效液相色谱探索基因组单核苷酸多态性的方法研究
目的 优化并评估一种新的探索基因组单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)的温度调控高效液相色谱技术.方法 从洗脱方式、洗脱温度、检测器流通池规格、适应片段大小、检测灵敏度等方面,探讨适合探索基因组SNP的温度调控高效液相色谱技术参数及实用价值.结果 找到在普通高效液相色谱仪上检测SNP的具有普遍意义的色谱条件.dNTP、PCR引物峰与被检测PCR产物峰完全分离,纯合子和杂合子样本能有效区分.建立起在普通高效液相色谱仪上进行快速筛选突变型DNA的温度调控高效液相色谱法.结论 温度调控高效液相色谱法是一种高效、灵敏、操作简便、对较大片段具有普遍适用意义的探索基因组SNP方法.
关键词： 温度调控高效液相色谱法 变性高效液相色谱法 单核苷酸多态性 -
温度调控高效液相色谱探索人类基因组变异的进展
温度调控高效液相色谱法是探索人类基因组DNA序列变异的新手段.温度调控高效液相色谱法通过比较异源双链与同源双链,而非逐个样本直接测序,可以敏感而准确地发现DNA变异,唯发现的变异需进一步测序鉴定.对于旨在发现新突变或新多态性的课题,该方法可以明显减少测序工作量,而对于检出稀少的变异型,可明显降低所需成本.通过自动化操作, 更能显著加快获取数据的速度.本文介绍温度调控高效液相色谱法的原理与命名、技术的主要优点及应用进展.
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变性高效液相色谱法及其在基因变异检测中的研究进展
变性高效液相色谱法是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法.由于该技术具有快速、经济、准确和自动化程度高等特点,广泛用于单核苷多态的筛检中.本文简述了变性高效液相色谱法的基本原理,并将它与各种SNP筛检技术进行系统比较,综述了DHPLC在这一领域的新研究进展.
