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用昆虫-杆状病毒系统表达的HPV6型L1蛋白检测尖锐湿疣患者血清中抗体
用杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV6)主要衣壳蛋白(major capsid protein,L1)作为抗原,对尖锐湿疣(condyloma acuminata,CA)患者抗体进行检测.采用昆虫杆状病毒系统表达HPV6 L1蛋白,通过镍柱亲和层析法获得纯化抗原;以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测30例CA、20例献血员和10例儿童血清中的HPV6 L1 IgG抗体.感染重组杆状病毒的昆虫细胞经SDS-PAGE和Western blot检测,在大约55kD处有明显的外源蛋白表达条带.ELISA结果显示,CA组的血清阳性率为66.7%(20/30),献血员组的阳性率为15%(3/20),两组之间有显著性差异(P＜0.05).22例HPV6型感染的CA患者有15例血清阳性(68.2%),6例HPV11型CA患者4例阳性(66.7%),1例混合感染者为阳性,1例HPV16型患者为阴性.女性CA患者的血清抗体阳性率高于男性(P=0.0052).本研究建立的ELISA体系具有敏感性和针对低危型HPV感染的特异性.这不仅对于HPV血清流行病学研究是有价值的,而且对于临床诊断HPV感染可能具有一定的应用价值.
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重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒诱导中和抗体
为研究重组病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)免疫血清的抗感染作用,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV-6)L1 VLP和HPV-6 L1+L2 VLP免疫BALB/c小鼠,获得抗血清,ELISA法测定抗体滴度,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用.VLP诱导了高滴度(＞1∶10 000)的血清抗体,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮组织的感染.重组HPV-6 VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用.提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗.
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尖锐湿疣病变的人乳头瘤病毒6型L1序列多态性分析
采用PCR方法从协和医院尖锐湿疣患者皮损中检测人乳头瘤病毒(HPV),并通过限制性片断长度多态性分析分型发现,HPV6型为主要感染型别,其次是HPV11型.根据临床特征选择主要致病型HPV6 8个分离株,扩增L1晚期基因,构建重组测序质粒,双脱氧法测序并分析L1区的核苷酸和氨基酸序列变异状况.结果表明,HPV6L1基因序列发生碱基替换的区域主要有四个区,包括SR1(5911～6104),SR2(6217～6273),SR3(6540～6661)和SR4(7062～7250).少数的碱基替换导致错义突变,推导的蛋白质一级结构中有0～3个氨基酸发生变异,但抗原性强弱与原型HPV6基本一致.
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按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高效表达
人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV6)是尖锐湿疣的主要病因,该病的发病率近年来持续上升,是仅次于淋病的第二位性病,并且其病情顽固,易复发,治疗困难.而尖锐湿疣与HPV6感染之间是单一的因果关系,这为用疫苗预防提供了可能.实际上HPV(如16、18、6、11等型别)L1的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗正在进行Ⅱ期临床试验,前景看好[1].但是现在普遍采用昆虫细胞培养系统,价格昂贵.为降低成本,同时尝试了真核表达系统甲醇营养型酵母(Pichiapastoris)和原核表达系统大肠杆菌(E.coli)两种表达系统.按照Pichia酵母的密码偏爱性重新合成HPV6-L1基因,结果在该系统仅有少量表达[2].但是发现该合成基因在E.coli中能够高效表达,而目前文献报道的HPV L1蛋白多以融合方式(与GST)在E.coli中少量表达[3].现将工作结果报道如下,并对影响蛋白表达的可能因素作简要探讨.
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重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒的免疫原性分析
目的研究重组人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6, HPV-6)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)的免疫原性. 方法重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的HPV-6 L1 VLP(L1-VLP)和HPV-6 L1+L2 VLP(L1+2-VLP)经鉴定后,用于免疫BALB/c小鼠,对诱导的体液免疫和细胞免疫反应进行了检测. 结果电镜观察显示L1-VLP和L1+2-VLP二者形态上无明显差异,为圆形颗粒,直径约50nm,SDS-PAGE和Western blot分析表明,L1+2-VLP中L1和L2蛋白摩尔比例为4∶1.用ELISA法测定免疫小鼠血清抗体滴度,加佐剂L1-VLP免疫组和加佐剂L1+2-VLP免疫组血清针对HPV-6 L1 VLP的滴度在1∶10000以上,高于未加佐剂组免疫血清滴度(1∶2000),L1+2-VLP免疫诱导出了特异于L2抗原的抗体.血清抗体主要识别HPV-6构象依赖性抗原表位,与HPV-11抗原显示出一定的交叉反应,而与HPV-16无明显交叉反应.免疫小鼠脾淋巴细胞体外经HPV-6 L1 VLP再激活后出现了特异性增殖反应,3H-TdR掺入值与未免疫组之间差异有显著性(P＜0.01),L1-VLP和L1+2-VLP两组间差异无显著性(P＞0.05),L1-VLP和L1+2-VLP免疫组刺激指数(SI)分别为6.4和6.2,阴性对照组SI为1.1.HPV-6 L1 VLP再刺激特异地诱导免疫组脾淋巴细胞IL-2和IL-10分泌显著增加,与未免疫组之间差异有显著性(P＜0.01),但未检测到IFN-γ分泌的明显增加. 结论制备的HPV-6 VLP具有良好的免疫原性,在免疫小鼠体内同时诱导了细胞免疫和体液免疫反应,可以用于研制HPV预防性疫苗.
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人乳头瘤病毒6型基因组晚期区序列分析
目的初步分析我国尖锐湿疣患者病变组织分离的乳头瘤病毒6型(HPV-6)基因组晚期区编码序列变异情况.方法采用重叠PCR设计,分别从HpV-6阳性尖锐湿疣患者病变组织扩增出主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2基因片段,插入质粒载体克隆,经测序、拼接获得HPV-6基因组晚期区序列.结果得到的两条长2 869 bp的HPV-6晚期区序列(GenBank序列索取号AY015006,AY015008)均具有完整的L1和L2开放阅读框(ORF),与原型序列比较,在L1和L2 ORF中共有9个核苷酸变异,其中错义突变4个(有3个发生在L2 ORF,1个在L1ORF).分子进化分析表明,克隆的晚期区序列属于HPV-6b亚型.结论 HPV-6基因组晚期区编码序列非常保守(核苷酸变异率小于0.28%),并且L1 ORF比L2 ORF更为保守,其中位于L1 ORF中7 081位的A→G和7 099位的G→A两处共有突变在我国HPV-6分离物中具有代表性.本研究首次从我国尖锐湿疣组织标本克隆了HPV-6基因组晚期区全长编码序列.
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人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达
目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化.方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6 E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化.结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白.结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础.
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生殖器上皮组织人乳头瘤病毒6型E7蛋白在感染初期和复发组织中的转归
目的 检测尖锐湿疣(CA)感染组织中人乳头瘤病毒(HPV)6型E7蛋白的表达情况及病毒复发转归的意义.方法 152例的CA患者组织采用聚合酶链反应荧光法及S-P免疫法对初发和复发CA患者的活检组织和健康对照组织进行检测,HPV6型E7早期蛋白主要位于细胞核内呈棕黄色伴少许胞质着色为阳性,阳性率大于或等于15%者为阳性组织.结果 152例CA患者中有91例HPV6型感染,感染率为59.9%.其中56例为初发患者,35例为复发患者;18～38岁53例,38～48岁26例,48～60岁12例;男52例,女39例.56例初发患者HPV6型E7蛋白阳性表达率为69.5%,35例复发患者的活检组织HPV6型E7蛋白阳性表达率为71.4%.27例正常宫颈上皮组织中HPV6型E7蛋白阳性率为0%,HPV6型E7蛋白在初发CA组织与正常宫颈组织比较以及复发CA组织与正常宫颈组织比较差异有统计学意义(P＜0.001).初发与复发CA组织相比较率差异无统计学意义(P＞0.05).HPV6型E7蛋白在不同年龄段阳性表达率分别为:53例18～38岁患者的阳性率为71.7%,26例38～48岁患者的阳性率为69.2%,12例48～60岁患者的阳性率为66.7%,不同年龄段阳性率差异无统计学意义(P＜0.05);52例男性患者中阳性率为75.0%,39例女性患者中为64.1%,阳性表达与性别无关(P＞0.05).结论 HPV6型是CA的主要致病因素之一,HPV6型早期蛋白E7在HPV6型感染的CA初发和复发组织中的表达和在正常生殖上皮组织中的表达差异有统计学意义,和年龄、性别无关;HPV6型早期蛋白E7的含量与其病情有着必然联系.
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HPV6型E6与结核杆菌HSP70融合基因的构建及原核表达
目的构建HPV6型E6抗原与结核杆菌HSP70的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化.方法利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序正确后,再通过PCR方法扩增HPV6型E6基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E6与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E6-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α,进行诱导表达和分离纯化.结果成功地构建了pGEX-E6-HSP70原核表达质粒,诱导表达产物与抗GST抗体在113 kD处有很强的交叉反应;大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS-PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白;经GST融合蛋白表达系统纯化,得到了E6与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白.结论成功获得HPV6型E6与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究HPV6型E6与结核杆菌HSP70融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用提供了材料.
