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用昆虫-杆状病毒系统表达的HPV6型L1蛋白检测尖锐湿疣患者血清中抗体
用杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV6)主要衣壳蛋白(major capsid protein,L1)作为抗原,对尖锐湿疣(condyloma acuminata,CA)患者抗体进行检测.采用昆虫杆状病毒系统表达HPV6 L1蛋白,通过镍柱亲和层析法获得纯化抗原;以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测30例CA、20例献血员和10例儿童血清中的HPV6 L1 IgG抗体.感染重组杆状病毒的昆虫细胞经SDS-PAGE和Western blot检测,在大约55kD处有明显的外源蛋白表达条带.ELISA结果显示,CA组的血清阳性率为66.7%(20/30),献血员组的阳性率为15%(3/20),两组之间有显著性差异(P＜0.05).22例HPV6型感染的CA患者有15例血清阳性(68.2%),6例HPV11型CA患者4例阳性(66.7%),1例混合感染者为阳性,1例HPV16型患者为阴性.女性CA患者的血清抗体阳性率高于男性(P=0.0052).本研究建立的ELISA体系具有敏感性和针对低危型HPV感染的特异性.这不仅对于HPV血清流行病学研究是有价值的,而且对于临床诊断HPV感染可能具有一定的应用价值.
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负载HPV16L1抗原的DC疫苗的构建及免疫效果的研究
目的 构建负载HPV16L1抗原的树突状细胞疫苗DC-L1,研究DC-L1在小鼠体内诱导的特异性体液及细胞免疫应答.方法 使用重组细胞因子组合对树突状细胞的前体细胞进行体外分化及诱导成熟,利用表达HPV16L1抗原的重组腺病毒载体Ad5-HPV16L1感染成熟DC细胞获得树突状细胞疫苗DC-L1.使用DC-L1与Ad5-HPV1 6L1疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,在不同的时间点使用定量ELISA及ELISPOT对疫苗诱导的L1特异性体液及细胞免疫应答进行检测.结果 DC-L1细胞具有典型的树突状细胞的形态特征,Western blot可检测到HPV16L1抗原的表达;DC-L1及重组腺病毒疫苗均可在小鼠体内诱导L1特异性的细胞免疫应答,但二者动力学特征存在差异,重组腺病毒组单针接种后可快速诱导L1特异性细胞免疫应答,免疫后第3周反应达到峰值,之后缓慢下降,而DC-L1组呈缓慢上升的趋势,在免疫后第5周才逐渐超过重组腺病毒组的反应水平.体液免疫方面,DC-L1及重组腺病毒疫苗单针接种后均能在小鼠体内诱导L1特异性体液免疫应答,且具有相似的免疫动力学特征.结论 成功构建了树突状细胞疫苗DC-L1;DC-L1可在小鼠体内诱导高水平的HPV16L1特异性的细胞及体液免疫应答.
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人巨细胞病毒基因时序表达对感染结局的影响
目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)主要基因序列表达情况对其感染结局的影响. 方法采用不同滴度HCMV感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立HCMV梯度感染细胞模型.分别应用FQ-PCR法测定感染细胞内IE基因拷贝数、免疫组化法联合计算机病理图文分析系统检测p52蛋白表达水平以及RT-PCR法测定MCPmRNA转录水平,光镜观察致细胞病变作用(CPE)、电镜检查细胞超微结构改变. 结果 IE基因在病毒滴度低的A组细胞内负荷量低(P<0.05,P<0.01);p52蛋白在病毒滴度较高的B、C组表达水平明显高于A组(P<0.01),其表达定位于受染细胞核内;仅在B、C组内检测到MCP mRNA.A组未检出细胞病变,B、C组细胞检测到随感染时间延长而加重的CPE及超微结构改变. 结论 HCMV受染细胞内IE基因负荷量与病毒基因组表达启动密切相关,p52蛋白高效表达是病毒基因组完整表达的必要条件,MCP mRNA转录是活动性HCMV感染的标志.
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16型人乳头瘤病毒(HPV16)中和表位及型内变异分析
世界范围内,宫颈癌是妇女第二位高发肿瘤.高危型人乳头瘤病毒(human papilloma-virus,HPV)持续感染是引发宫颈癌的主要原因,在所有高危型HPV中,HPV16流行广泛.HPV主要衣壳蛋白(major capsid protein,L1)可以自组装成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),其形态及抗原性与天然病毒类似,可以刺激机体产生高效价保护性中和抗体.中和表位是HPV VLPs疫苗的结构基础,疫苗的效力主要取决于中和表位的完整性.目前基于中和单抗的HPV16表位研究取得了极大进展.随着免疫压力的增加,HPV16的型内变异株越来越多.1204条HPV16 L1氨基酸序列构建的进化树可以分为4个进化分支.同时,将其与114K参考序列相比,共挑选出8个"高频突变位点",6个"特有突变位点"和20个"表位相关位点".HPV诱导的中和抗体绝大多数都是型特异性的,但同一型别内的HPV所诱导的中和抗体对型别内的所有L1变异株是否都能保护尚无定论.剖析HPV16型的抗原表位及型内变异情况对设计高效价、高覆盖率的预防性疫苗至关重要.
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利用重组HPV16L1蛋白检测鲍温病和鲍温样丘疹病血清中的抗体
目的 用原核表达系统获得人乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白(L1),检测鲍温病和鲍温样丘疹痛血清中的HPV16L1 IgG抗体.方法 PCR方法检测鲍温病和鲍温样丘疹病局部皮损中的HPV DNA,限制性片段长度多肤性方法进行HPV分型;用原核表达载体pET32a表达HPV16L1蛋白,亲和层析法对表达产物进行纯化,获得了HPV16 L1蛋白抗原;ELISA法检测鲍温病和鲍温样丘疹病血清中的抗体.结果 用原核表达系统和镍柱亲和层析获得了较纯的HPV16 L1蛋白.鲍温样丘疹病血清中抗体的检测率为(20/50)40%,鲍温病血清中抗体的检测率为(8/30)26.7%,正常献血员组检测率为(2/50)4%.这两组分别与正常献血员组比较有统计学差异(P＜0.05).两组HPV16DNA PCR检测法与血清HPV16 L1抗体检测法有较好的一致性(P＜0.05).结论 利用原核表达系统获得纯化HPV16型L1蛋白,可用于鲍温样丘疹病和鲍温病血清中HPV16抗体的检出,为其临床上血清学诊断提供参考,进一步开发HPV相关皮肤恶性肿瘤高危人群的诊断试刺盒提供前沿基础研究.
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人类乳头状瘤病毒和子宫颈癌疫苗
一、HPV的有关研究1.HPV分子生物学和生命周期:HPV国际病毒分类协会把其归为乳头病毒属的一员.现已鉴定出120种基因型,至少有85种基因序列已完全测定.它是一类显示高度的宿主特异和亲和力的无包膜小型双链环状DNA病毒.由核心和蛋白衣壳组成,衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成.重要区域包括:早期区域(E),晚期区域(L)和长控制区域(LCR)也叫上游调节区(URR)或非编码区[1].早期区域的E6和E7是转录病毒的癌基因,所编码的E6、E7蛋白对于病毒的复制起关键性的作用.
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人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的纯化
目的:探讨人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的纯化方法.方法:分别利用亲和层析和离子交换层析对重组融合蛋白pET30a-6×His-L1进行了纯化.结果:以包涵体形式表达的重组蛋白在变性条件下经Ni-NTA Agarose、Q-Sepharose FF纯化,透析复性后均获得较高纯度,回收率分别为30%和29%.结论:亲和层析和离子交换层析都是纯化重组L1蛋白的适宜方法,二者纯化效率相当.
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鳜传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白基因的原核表达
根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)主要衣壳蛋白(Major Capsid protein, MCP)基因(mcp)序列设计引物,PCR扩增得到一长约1400bp的DNA片段, 将其克隆到pGEM-T Easy Vector.氨基酸亲水性分析表明,在150-250位氨基酸之间亲水性很高,可构成主要抗原决定簇及形成跨膜区.mcp基因经PCR改造后克隆至原核表达载体pBV220,构建表达MCP的大肠杆菌基因工程菌,该工程菌经42℃诱导,SDS-PAGE检测,在约50kDa处有一特异蛋白带,含量约为菌体总蛋白的23%.用纯化和复性后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,Western-blotting分析显示,重组MCP制备的抗血清能与ISKNV MCP特异结合,说明表达产物具有与ISKNV MCP相似的抗原特性.
关键词： 鳜鱼传染性脾肾坏死病毒 主要衣壳蛋白 原核表达 免疫印迹 -
活动性人巨细胞病毒感染的病毒基因表达特点
目的:探讨活动性人巨细胞病毒(HCMV)感染的病毒基因表达特点.方法:建立持续稳定感染(A组)及活动感染(B组)两种细胞感染状态,FQ-PCR和RT-PCR法监测HCMV DNA复制和MCP mRNA转录,免疫组化法联合计算机病理图文分析系统检测pUL44表达水平,光镜观察细胞病变、电镜检查细胞超微结构改变.结果:B组HCMV DNA负荷量(5.61～9.04 lgGE/106HEL)明显高于A组(4.32～5.91 lgGE/106HEL,P<0.05或P<0.01),pUL44也持续升高表达(area:339.6～1 431.9μm2,IA:56.4～319.8,P<0.01),MCP mRNA水平逐渐升高.A组pUL44少量、随机表达(area:219.2～296.7μm2,IA:31.0～58.3),未检到MCP mRNA,亦未发现细胞病变,B组出现进行性加重的细胞病变和细胞超微结构破坏.结论:HCMV DNA负荷量持续升高及MCP mRNA转录是活动性HCMV感染的重要标志.
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抗HPV L1小鼠单克隆抗体及兔多克隆抗体的制备
目的 用人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白(HPV L1)C-末端保守序列多肽制备抗HPV L1单克隆及多克隆抗体,并对所制备的抗体的检测能力进行鉴定,同时比较其与购买的单克隆抗体的检测能力.方法 将HPV L1 C-末端一段30个氨基酸长度的保守序列多肽与载体蛋白KLH偶联,免疫小鼠及兔,制备抗多肽单克隆及多克隆抗体.分别采用ELISA、Western blot、免疫组织化学等方法检测所制备的多肽抗体多种型别HPV L1的反应性,并与市售的多价抗HPV L1单克隆抗体进行比较,以确定多肽抗体的检测能力.结果 免疫小鼠及兔后得到的鼠单克隆抗体及兔多克隆抗体,其效价分别在1∶320 000以上及1∶64 000以上;用ELISA方法检测3种抗体对HPV阳性细胞提取蛋白及L1重组蛋白的反应性,均有阳性反应;用Western blot方法检测抗体对HPV阳性细胞提取蛋白及L1重组蛋白的反应性,均出现明显条带,但我们制备的鼠单克隆抗体与细胞提取蛋白未见明显条带;用免疫组织化学方法检测HPV阳性细胞,3种抗体均呈现阳性反应.结论 HPV L1 C-末端保守序列可以诱导产生抗HPV L1单克隆或多克隆抗体,可以检测出多型别的HPV L1,其检测能力与市售的多价抗HPV L1单克隆抗体基本相当.
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HPV16 L1基因的原核表达及免疫反应性鉴定
目的:在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV 16)主要衣壳蛋白L1, 并鉴定其免疫反应性.方法: 将HPV-16 L1基因克隆入原核表达载体pThioHisC中, 构建重组表达载体.以重组载体分别转化大肠杆菌Top10和DH5α, 在IPTG诱导下表达外源基因, 用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果: 构建了HPV-16 L1基因的原核表达质粒pThioHisC/HPV-16 L1, 并在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)约为70 800的蛋白.表达的蛋白能与抗HPV-16 L1抗体发生特异性反应.结论: 在原核细胞中成功地表达HPV-16 L1基因, 为HPV-16 L1疫苗的研制提供了必要的基础.
关键词： 人乳头状瘤病毒16型 主要衣壳蛋白 原核表达 免疫反应性 -
大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及抗血清制备
目的 表达大鲵虹彩病毒(CGSIV)主要衣壳蛋白(MCP)主要抗原表位区蛋白,并制备兔抗血清.方法 以大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY)基因组为模板,PCR扩增MCP基因,然后克隆到pET-21a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法检测重组蛋白的表达和免疫活性,用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白.以纯化的重组蛋白为免疫原免疫兔制备抗血清,采用Western blot法和ELISA检测抗血清的免疫特异性并测定效价,利用间接免疫荧光法检测鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞CGSIV.结果 表达了相对分子质量(Mr)为29 000的重组蛋白.制备的兔抗MCP血清具有良好的特异性和高滴度,间接免疫荧光法检测结果显示制备的多抗血清能识别EPC细胞中的CGSIV.结论 成功表达了大鲵虹彩病毒MCP主要抗原表位区蛋白,并制备高滴度和良好特异性的兔抗血清.
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一种真鲷虹彩病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立
真鲷虹彩病毒一直被世界动物卫生组织列入必报疫病病原目录,该病毒与传染性脾肾坏死病毒在基因序列上没有区别。为了快速检测病原,本文根据传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白序列中一段基因保守区设计引物和TaqMan探针,建立了真鲷虹彩病毒特异性实时荧光定量PCR检测方法,并利用PCR反应扩增出的衣壳蛋白基因制备了pGEM-T/真鲷虹彩病毒重组质粒作为标准阳性对照。经试验,反应在模板量102-106拷贝浓度范围内有较好的线性关系,检测限低可达100拷贝数,而且与流行性造血器官坏死病毒、甲鱼虹彩病毒等6种水生动物病毒无交叉反应。结果证明该方法具有简便、快速、敏感、特异等特点,它的建立为该病诊断与病原检测提供了一个重要手段。
