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表达HPV16 L1抗原的1型重组AAV载体免疫效果的研究
为研究1型重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus type 1,AAV1)载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建含密码子优化型HPV16L1基因(mod.HPV16L1)的1型重组AAV载体rAAV1-mod.HPV16L1,将纯化的rAAV1-mod.HPV16L1以肌注和滴鼻途径分别免疫C57BL/6小鼠,使用体外中和实验检测血清中的特异性中和抗体.结果显示,rAAV1-mod.HPV16L1单针肌注及滴鼻免疫均可诱导特异性血清中和抗体,但二组抗体动态变化趋势不同,肌注组血清中和抗体滴度显著高于滴鼻组.rAAV1-mod.HPV16L1单针肌注免疫可诱导强而持久的血清中和抗体,是理想的候选HPV16预防性疫苗.
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含密码子优化型HPV16 L1基因重组腺病毒的构建及其免疫效果的研究
目的 构建含密码子优化型HPV16L1基因的重组腺病毒,对其经不同接种途径所诱导的系统性及黏膜免疫效果进行研究.方法 使用Admax系统包装重组腺病毒,纯化的腺病毒以不同方式免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA及体外中和实验检测免疫小鼠血清及阴道分泌物中的特异性抗体.结果 重组腺病毒滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应,重组腺病毒肌注免疫仅能诱导系统性免疫反应,而阴道黏膜接种不能有效诱导系统性及黏膜免疫反应.结论 成功构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,重组腺病毒肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应.
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含HPV16L1基因重组腺病毒和1型重组AAV载体联合免疫效果的研究
目的 对表达HPV16L1抗原的重组腺病毒及1型重组AAV载体联合免疫效果进行研究.方法 分别构建含密码子优化型HPVl6LI基因重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1及1型重组从V载体rAAV1-mod-HPV 16L1,将纯化的重组AAV病毒载体以肌注及滴鼻途径单独及联合免疫C57BL/6小鼠,使用体外中和实验检测各组小鼠血清中特异性中和抗体.结果 rAAV1-med-HPV16L1单独及与rAd-mod-HPV16L1联合肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,在初免后第16周抗体滴度显著高于其他免疫组,联合肌注组诱导的抗体滴度高于单独肌注组;重组病毒联合滴鼻虽能产生一定的免疫加强作用,但抗体滴度仍显著低于rAAV1-mod-HPV16L1单独及联合肌注组.结论 型重组从V载体联合重组腺病毒以初免.加强模式肌注可诱导更高滴度的血清中和抗体.
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用甲醇酵母表达经基因优化的HPV 6型L1蛋白
目的利用甲醇酵母系统Pichia pastoris高效表达HPV 6型L1蛋白.方法按照Pichia pastoris偏爱密码子合成L1全长基因,构建pPIC3.5K- HPV6- L1表达载体,转化KM71,经组氨酸缺陷的MD培养基和G418筛选,PCR 确认L1基因整合,使用BMGY/BMMY培养/诱导目的基因的表达.结果筛选到3株阳性表达克隆,Western blot显示表达产物有部分糖基化现象,使用能识别完整VLP的单抗进行间接免疫荧光检测提示L1蛋白在Pichia细胞内以空间构象形式存在.通过离子交换和亲和层析两步纯化从1L发酵液中得到125 μg纯的L1蛋白.结论通过基因优化在甲醇酵母中表达HPV6- L1蛋白,这将为结构与功能研究以及疫苗开发提供条件.
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成功救治造血干细胞移植后肺部真菌感染
肺部真菌感染是异基因造血干细胞移植患者常见的并发症,由于缺乏特异性的临床表现和敏感的检测方法,早期诊断困难,病死率高.我院成功救治1例亲属间单倍体造血干细胞移植合并肺部真菌感染病例,现报告如下.
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优化密码对牛乳头瘤病毒L1基因粘膜免疫的增强作用
为探讨优化密码对牛乳头瘤病毒1型主要晚期基因(BPV1L1)免疫原性的影响,分别将含野生型和优化密码的人源化BPV1L1基因的真核表达质粒转入减毒沙门菌S.BRD509后,通过滴鼻、阴道免疫、静脉注射、腹腔注射等途径免疫小鼠,经VLP ELISA方法测定抗L1构象性抗体产生,MTT法观察诱导的特异性细胞免疫反应.抗体检测结果显示,经粘膜免疫途径,与含有野生型L1基因的表达质粒pcDNA3WBPVL1相比,含优化密码L1基因的pcDNA3HBPVL1诱导产生的SIgA、IgG明显升高,而细胞免疫反应无明显差异.表明优化密码能促进乳头瘤病毒晚期基因L1诱导的体液免疫反应,减毒沙门菌是PVL1 DNA疫苗粘膜免疫的有效载体.
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妊娠合并急性白血病1例报告
妊娠合并白血病临床上极为少见,发病率在国内报道为同期住院孕妇的16～40/10万,国外为18.8/10万,且占白血病总数的0.78%.而妊娠晚期合并高危白血病者更为少见.上海瑞金医院曾为3例妊娠合并白血病产妇成功接生,3例的婴儿均健康成长,而母亲在生产1年多后死于白血病复发.加拿大多伦多白血病研究室曾有1例妊娠合并白血病双胞胎出生的记录,足月出生的双胞胎兄弟现健康成长.急性白血病时子宫及卵巢常受累而影响怀孕,妊娠合并白血病以慢性髓性白血病多见;而慢性淋巴性白血病多半发生在50岁左右的妇女,故合并妊娠者较少.本院新近收治1例有两次剖宫产术史,本次为输卵管结扎术后意外妊娠(晚期),合并高危急性白血病患者,现报告如下.
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HPV L1壳蛋白在宫颈病变诊断及随访中的临床意义
目的：探讨宫颈脱落细胞HPV L1壳蛋白检测在宫颈病变诊断及随访中的临床意义。方法：选取2013年1月至2014年6月在温州市中心医院宫颈液基细胞学检查（TCT）诊断≥未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS），HPV病毒基因分型检测高危型HPV阳性276例患者，检测HPV L1壳蛋白在子宫颈病变中表达情况。结果：①HPV L1壳蛋白在低度鳞状上皮内病变（LSIL）、ASCUS、非典型鳞状上皮-不除外高度病变（ASC-H）/高度鳞状上皮内病变（HSIL）/鳞状上皮浸润癌（SCC）中的表达率分别是70.09%、55.46%、10.00%，3者间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。②HPV L1壳蛋白在组织病理学诊断慢性子宫颈炎（CC）、CINI、CINII-III和SCC中的阳性表达率分别是63.55%、75.32%、21.59%、0.00%，不同组间的HPV L1壳蛋白表达率差异有统计学意义（P＜0.05）。③在高危型HPV基因阳性妇女中，HPV L1壳蛋白联合TCT及单独TCT对诊断组织病理学≥CINII的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别是88.89%、46.73%；88.65%、96.20%；71.43%、86%和96.15%、78.32%。④对31例CINI妇女随访1年，结果发现CINI妇女中HPV L1壳蛋白阳性者和HPV L1壳蛋白阴性者相比，1年病变自然消退率高，差异有统计学意义（P＜0.05）；HPV L1壳蛋白预测CINI患者病变消退的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为91.67%、57.89%、57.89%、91.67%。结论：①HPV L1壳蛋白随着子宫颈病变程度增高表达率下降；②在高危型HPV基因阳性妇女中，宫颈脱落细胞HPV L1壳蛋白检测联合TCT比单独TCT预测组织学病理≥CINII有更高的敏感度（88.89% vs 46.73%）和阴性预测值（96.15% vs 78.32%）；③在CINI随访妇女中，HPV L1壳蛋白阳性妇女CINI自然消退率更高，有较高的预测CINI病变消退的敏感度和阴性预测值，值得临床推广。
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人源化BPVL1-GFP融合基因的构建以及在哺乳动物细胞中的瞬时表达
目的:构建牛乳头瘤病毒晚期基因L1-GFP融合基因真核表达质粒,自细胞水平探讨优化密码对晚期基因L1蛋白瞬时表达的影响.方法:用PCR方法扩增获得优化密码人源化BPVL1(hL1)基因.TA克隆后,酶切释放hL1基因,定向插入质粒pET30a/NM-GFP的BamHI、SacII位点,获得正确框架的hL1-GFP融合基因.再用BamHI、NotI酶切释放hL1-GFP融合基因,与pcDNA3载体定向重组构建真核表达质粒pcDNA3/hL1-GFP.同法克隆获得含野生型BPVL1-GFP融合基因的表达质粒pcDNA3/wL1-GFP.用质粒DNA分别在体外转染哺乳动物细胞COS-1细胞和Wish细胞,荧光显微镜下观察L1-GFP融合蛋白的瞬时表达情况.结果:酶切鉴定表明成功构建了含wL1-GFP、hLI-GFP的真核表达载体,与pcDNA3/wL1-GFP相比,pcDNA3/kL1-GFP在COS-1细胞、WISH细胞中获得有效表达.结论:优化密码能提高乳头瘤病毒L1基因在哺乳动物细胞内的蛋白表达.
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人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组质粒的构建及其细胞的免疫性
目的:构建HPV16L1-E7C重组质粒并研究其细胞免疫性.方法:利用基因克隆技术将HPV16L1-E7C DNA片段定向插入pcDNA3.1载体,构建重组质粒pcDNA16L1-E7C,然后将其免疫C57BL/6小鼠,利用T淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖能力,同时利用ELISA试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)的水平.结果:特异性T细胞增殖试验中实验组3H-TdR掺入率为18 339±1 972,对照组为6 737±1 243,实验组小鼠T细胞增殖水平明显高于对照组(P＜0.05).DNA免疫后实验组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平为0.89±0.56,对照组为4.81±1.33,两者相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论:重组质粒能增强小鼠的细胞免疫功能.
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人乳头瘤病毒16型L1-E7c嵌合基因的构建表达及免疫学效应的研究
目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-ETc嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗.方法 以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a(+),获得pET28a(+)-L1-E7c表达质粒.以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16 L1和E7抗体的特异性结合.应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构.纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况.结果 经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白.此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性.结论 构建的嵌合基因HPV16L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP.此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础.
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型特异性、构象依赖性HPV16 L1单克隆抗体的制备与鉴定
目的:研制具有型特异性和构象依赖性的人乳头瘤病毒16主衣壳L1蛋白(HPV16 L1)单克隆抗体(mAb).方法:利用昆虫-杆状病毒系统表达有生物活性的HPV16 L1蛋白.非变性条件下纯化HPV16 L1蛋白,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠.末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆.非变性Western blot鉴定mAb的型特异性和构象依赖性,细胞免疫组化确定抗体的型特异性.间接ELISA法测定杂交瘤分泌上清及腹水中抗体效价.mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类.结果:获得1株稳定分泌具有型特异性和构象依赖性的HPV16 L1抗体的杂交瘤细胞株,命名为2E3.2E3杂交瘤细胞株细胞培养上清中抗体效价为1:800;小鼠腹水中抗体效价为1:12 800.亚类鉴定结果为IgG1κ.Western blot及细胞免疫组化分析结果显示,2E3 mAb具有型特异性和构象依赖性,只与非变性的HPV16 L1蛋白发生反应,不与HPV18L1、HPV58L1、HPV11L1产生交叉反应.结论:成功制备了型特异性HPV16 L1 mAb,为进一步研究HPV16 L1的抗原表位奠定了基础.
