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哈蟆油匀浆水溶液抗疲劳作用研究
目的：研究哈蟆油的抗疲劳作用。方法制备0.5% g/ mL 哈蟆油匀浆水溶液，采用小鼠灌胃给药，按成人日摄入量的1、10、30倍(即0.3、3.3、10.0 mL/ kgBW)连续灌胃30天，与阴性对照组比较，测定负重小鼠游泳后血清尿素、肝糖原和血乳酸的含量。结果10.0 mL/ kgBW 剂量组能延长小鼠负重游泳时间，减少小鼠游泳时血清尿素和血乳酸的产生，与阴性对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论成人每天服用20 mL 的0.5% g/ mL 哈蟆油匀浆水溶液(0.1 g 哈蟆油)有明显的抗疲劳作用。
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哈蟆油石油醚提取物的抗抑郁作用
目的:探索哈蟆油石油醚部位(ROS)的抗抑郁作用及可能的机制.方法:雄性ICR小鼠,分为2批,每批均设空白对照组(生理盐水)和6个治疗组(分别给予阳性药氟西汀10 mg·kg-1和ROS不同剂量10,30,100,300,900 mg· kg-1),连续灌胃给药8d.第1批动物在第7天给药后1h和第8天给药后1h,分别采用小鼠强迫游泳和小鼠悬尾2种“行为绝望”抑郁动物模型进行行为学观察;行为学观察结束后小鼠眼球取血,用放射免疫法检测小鼠血清皮质酮(CORT)水平.第2批动物在第8天给药后采用利血平拮抗模型,观察ROS对由利血平引起小鼠体温下降和运动不能的影响.结果:ROS 100,300,900 mg· kg-1均能不同程度地缩短小鼠强迫游泳和悬尾不动时间(P＜0.05),能拮抗利血平致小鼠体温下降和运动不能(P＜0.05),降低小鼠血清皮质酮水平(P＜0.05).结论:ROS具有抗抑郁作用,其机制可能与单胺类神经递质以及下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴密切相关.
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HPLC测定哈蟆油中4-胆甾烯-3-酮及胆固醇含量
目的:采用高效液相法同时测定哈蟆油中4-胆甾烯-3-酮和胆固醇.方法:使用Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相甲醇-永(91.5∶8.5),柱温35℃,体积流速1.0 mL·min-1,检测波长215 nm,进样量10 μL.结果:哈蟆油中4-胆甾烯-3-酮进样量在0.011 65～0.116 5μg呈良好的线性关系,平均回收率为100.0％,RSD 1.83％ (n =6),且稳定性、精密度及重复性均良好;胆固醇进样量在2.282～22.82 μg成良好的线性关系,平均回收率为99.3％,RSD 1.19％(n=6),且稳定性、精密度及重复性均良好.结论:该方法能够同时、准确、稳定、快速的测定哈蟆油中4-胆甾烯-3-酮和胆固醇的含量.
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哈蟆油药材基因组DNA提取方法的比较
目的:建立一种适合于哈蟆油药材基因组DNA的提取方法,为该药材的后续分子鉴定奠定基础.方法:采用十二烷基硫酸钠(SDS)法,改良SDS法,Chelex-100法,异硫酸氰胍(GuSCN)法,试剂盒法及改良试剂盒法提取哈蟆油基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法及细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)序列的引物聚合酶链式反应(PCR)扩增对DNA产量及质量进行检测.结果:Chelex-100法,改良SDS法,GuSCN法及改良试剂盒法均能从哈蟆油药材中提取得到基因组DNA,SDS法和试剂盒法提取不到.其中改良SDS法得到的DNA质量良好,得率高,但操作繁琐;改良试剂盒方法得到的DNA质量较好,但得率低,成本高;Chelex-100法操作简单快速、得率高,但得到的DNA质量较差;GuSCN法提取的DNA含有较多杂质,会抑制PCR反应.结论:Chelex-100法、改良SDS法及改良试剂盒法均可得到满足PCR扩增要求的DNA,实践中可根据条件选择适宜方法来提取哈蟆油基因组DNA.
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益妇宁软胶囊提取工艺实验研究
目的:对益妇宁软胶囊的提取工艺进行研究.方法:运用药效学方法确定莪术有效成分.采用正交试验法优选莪术油提取工艺条件和哈蟆油粉碎条件.结果:莪术应用挥发油部分,佳提取工艺条件为 A3B2C3;哈蟆油的粉碎工艺确定为粗粉在-20℃条件下粉碎 20 min.结论:提取工艺设计合理,对大生产有指导意义.
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HPLC测定哈蟆油中十六烷酸胆甾醇酯含量研究
目的:建立测定哈蟆油中的十六烷酸胆甾醇酯的含量方法.方法:采用Zorbax Silica色谱柱,流动相为环己烷-乙醚(40∶1);检测波长203 nm;柱温40 ℃;流速1 mL*min-1.结果:十六烷酸胆甾醇酯在0.60～8.92 μg具有良好线性关系,平均回收率为98.4%,RSD 1.8%,具较好的精密度及稳定性.结论:HPLC法测定哈蟆油中的十六烷酸胆甾醇酯的含量,不仅操作简单、准确,而且重复性好.
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哈蟆油动物基原问题探讨
目的:根据历史文献及现代在中国林蛙分类方面研究成果,确定哈蟆油的正品动物基原.方法:查阅历代本草著作及相关历史文献资料与近代国内外对中国林蛙有关研究报道,进行整理、分析、总结.结果:本草著作中记载的山蛤原动物为中国林蛙;中国林蛙是独立的种,而不是欧洲林蛙的一个亚种;中国林蛙有4个亚种,分别为中国林蛙指名、兰州、康定、长白山亚种;哈什蟆的原动物为中国林蛙长白山亚种.结论:中国林蛙长白山亚种为哈蟆油正品动物基原.
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快速PCR方法在哈蟆油真伪鉴别中的应用研究
该研究依据哈蟆油Cyt b基因155位SNP位点设计位点特异性PCR引物,采用碱裂解法提取基因组DNA,2步循环 PCR 程序进行 PCR 反应,并对PCR反应条件进行优化,从而建立起一种哈蟆油及其4种常见混伪品的快速PCR鉴别方法.该方法在90 ℃变性3 s,62 ℃退火延伸20 s进行32个循环时,加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光.该方法准确、简便,40 min内即可完成鉴别,为哈蟆油药材现场快速鉴定提供技术支持.
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基于COI序列的哈蟆油基原动物DNA条形码鉴定研究
哈蟆油具有较高的经济和社会价值,其混伪品较多,给市场造成了很大的混乱.利用基于COI序列的DNA条形码技术对已鉴定的东北林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙和黑龙江林蛙进行PCR扩增和测序,建立4种林蛙COI基因数据库;将所测的序列与GenBank上的序列进行比对,显示为上述4种林蛙;应用MEGA(molecular evolutionary genetics analysis)7.0软件计算K2P遗传距离并构建NJ(neighbor-joining)系统聚类树,所测4种林蛙的序列和GenBank上下载的4种林蛙的序列分别聚为1支,但与GenBank上下载的2个外群独立分开,东北林蛙的COI基因可能存在地域性差异,但该技术并不能鉴别林蛙的雌雄.结果显示DNA条形码技术能够准确鉴定哈蟆油的基原动物,说明DNA条形码COI为哈蟆油基原动物的鉴定提供一个新的手段和方法.
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哈蟆油对雌性衰老大鼠肝脏组织p16,p21和细胞周期蛋白D1蛋白表达的影响
目的 探讨哈蟆油(OR)对D-半乳糖所致雌性衰老大鼠肝脏组织p16、p21和细胞周期蛋白D1蛋白表达的影响,进一步探讨哈蟆油延缓雌性大鼠机体衰老机制.方法 SPF级SD雌性青年大鼠40只随机分为D-半乳糖组、维生素E组、哈蟆油高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组8只,D-半乳糖颈背部皮下注射42 d,建立亚急性衰老模型.另取雌性青年大鼠8只,同样部位每日注射生理盐水,作为空白对照组.第15天开始灌胃给药,给药时间28 d.给药结束后,免疫组化法检测衰老大鼠肝脏组织p16和p21蛋白的表达情况,蛋白免疫印迹法检测哈蟆油对雌性衰老大鼠肝脏组织细胞周期蛋白D1表达的影响.结果 雌性衰老大鼠肝脏组织免疫组化结果表明,p16和p21多为胞浆表达,弥漫性、灶性分布均有.D-半乳糖组p16和p21阳性细胞积分与空白组比较升高,差异有显著性(P＜0.01).与D-半乳糖组相比,哈蟆油中、低剂量组,p16阳性细胞积分降低,差异有显著性(P值均＜0.01),哈蟆油各剂量组p21阳性细胞积分降低,差异有显著性(P值均＜0.01).肝脏组织蛋白免疫印迹法结果表明,D-半乳糖组肝脏组织细胞周期蛋白D1蛋白表达与空白组比较降低,差异有显著性(P＜0.01).哈蟆油各剂量组细胞周期蛋白D1蛋白表达与D-半乳糖组比较,表达均升高(P值均＜0.01),哈蟆油高剂量组尤为明显.结论 哈蟆油可降低肝脏组织p16、p21蛋白的高表达.同时显著提高细胞增殖正性调控因子细胞周期蛋白D1蛋白的表达,促进衰老雌性大鼠肝细胞增殖.哈蟆油延缓雌性衰老作用可能通过调控肝脏p16,p21,细胞周期蛋白D1信号通路来促进有关增殖调控蛋白表达发挥延缓衰老作用.
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哈蟆油核苷类成分肌苷响应面优化提取研究
目的：探讨响应面法优化哈蟆油肌苷提取的佳工艺条件。方法：在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对影响加热提取哈蟆油核苷类成分肌苷得率的主要因素（甲醇体积分数、提取时间和料液比）进行优化，建立影响因素与肌苷之间的函数关系。结果：获得佳工艺条件为：甲醇体积分数为0，即为纯水提取，时间为67.0 min，料液比（g∶ml）为1∶71，在此佳条件下，得到肌苷的含量为23.31μg／g，试验结果与模型预测值相符。结论：该研究可为哈蟆油的深入开发和广泛应用提供科学依据。
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名贵药材哈蟆油化学成分的现代研究进展
哈蟆油为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的输卵管,经采制干燥而得,又名田鸡油、哈士蟆油等.哈蟆油是一种传统中药,主产地是黑龙江、吉林、辽宁省,尤以吉林省为多.据报道[1],哈蟆油具有健脾养胃、滋阴补肾、润肺生津之功效,是一种扶正固本的药物,对体弱气虚、气血亏损、精力耗损、记忆力不佳、神经性头痛、神经衰弱等均有很好疗效[2].近半个世纪以来,国内外学者对其进行了一些研究,目前已知的哈蟆油的化学成分多数为一般性成分,对其指标性、专属性或特征性成分的深入研究尚不够.现在所做的研究主要有以下几个方面的成分研究:
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哈蟆油酶解物抗疲劳作用
哈蟆油(Oviductus Ranae)是中国雌性林蛙(Rana temporaria chensinensis David)的干燥输卵管.有研究表明,其含有多种生物活性物质,具有补肾益精、养阴润肺、退热消炎等功效和明显的生理保健作用,临床上用于阴虚体弱、神疲乏力、咳嗽咳血等症[1].哈蟆油利用酶解技术加工处理后具有良好的溶解性和流动性[2].疲劳是是机体脑力或体力活动到一定阶段时必然出现的1种正常生理现象,标志着机体原有工作能力的暂时下降,也可能是机体处于伤病状态的1个先兆[3].
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哈蟆油非水溶性成分酶解物的抗疲劳作用
目的:研究哈蟆油非水溶性成分酶解物抗疲劳生物活性.方法:采用碱性蛋白酶酶解法制备哈蟆油非水溶性成分酶解物.以哈蟆油非水溶性成分酶解物高、中、低(0.6g,/kg,0.3g/kg,0.15g/kg)3个剂量组对小鼠进行连续灌胃给药30天,空白对照组给予等体积蒸馏水,分别观察小鼠负重游泳时间、血清尿素氮含量、肝糖原含量、血乳酸含量等指标的变化.结果:中剂量组小鼠负重游泳时间与对照组比较时间显著延长(P＜0.05),低剂量组肝糖原与对照组比较含量显著增加(P＜0.05),各剂量组血乳酸曲线下面积与对照组比较显著减小(P＜0.01),各剂量组血清尿素氮与对照组比较含量均无显著下降(P＞0.05).结论:哈蟆油非水溶性成分酶解物具有明显抗疲劳作用.
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10份不同产地哈蟆油营养保健价值的评价研究
目的:收集不同产地哈蟆油样品,比较各样品的营养成分.方法:采用化学及仪器分析的方法测定不同产地哈蟆油样品的营养成分,从营养成分角度出发,评价哈蟆油的营养保健价值.结果:哈蟆油含有丰富的营养成分,具有较高的营养保健价值.结论:不同产地哈蟆油所含的营养成分具有一定的相似性.
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不同地区及生境中哈蟆油药材总多糖含量比较
目的:比较不同地区及生境中的哈蟆油药材中总多糖的含量,为评价该药材质量提供依据.方法:石油醚脱脂、水回流提取、氯仿萃取,苯酚-硫酸法显色,葡萄糖对照,可见分光光度法测定.结果:哈蟆油药材中总多糖含量,不同地区的以林下产的高于稻田的；同一生境中以黑龙江地区的高于吉林、辽宁的.结论:以哈蟆油药材中总多糖的含量评价其药材质量,与该药材的传统主产区及目前市场定价相吻合.
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星点设计-效应面法优化哈蟆油腺嘌呤提取工艺
目的：采用星点设计-效应面法优选哈蟆油中腺嘌呤的提取工艺。方法采用HPLC测定腺嘌呤含量,以Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm ×4．6 mm,5．0μm)为色谱柱,流动相甲醇-水,梯度洗脱,流速1．0 mL/min,检测波长260 nm,柱温25℃,进样量10μL。以腺嘌呤为考察指标,通过星点设计-效应面法考察甲醇浓度、提取时间、提取温度对哈蟆油腺嘌呤提取工艺的影响。结果腺嘌呤对照品进样量在17．73~110．33μg/mL呈良好线形关系,回归方程为Y=0．1045 X+0．1001,R2=0．9996,平均回收率为97．84%,RSD为1．76%(n=6)。佳提取工艺为甲醇浓度73%,提取时间68 min,提取温度61℃,哈蟆油得率为465．30μg/g。结论优选的哈蟆油腺嘌呤提取工艺简便、稳定。
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哈蟆油对雌性衰老大鼠子宫组织p21和cyclinD1基因表达研究
目的:探讨哈蟆油(OR)对D-半乳糖所致雌性衰老大鼠子宫组织细胞增殖调控因子p21和cyclinD1基因表达的影响,进一步探讨OR延缓雌性大鼠生殖器官衰老机制.方法:SPF级SD雌性青年大鼠40只随机分为模型组(D-gal组)、维生素E(VE组)、哈蟆油高剂量组(OR-H组)、中剂量组(OR-M组)、低剂量组(OR-L组),每组8只,D-半乳糖颈背部皮下注射42 d,建立亚急性衰老模型.另取雌性青年大鼠8只,同样部位每日注射生理盐水,作为空白组.第15天开始灌胃给药,给药时间28 d.给药结束后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测衰老大鼠子宫组织p21和cyclinD1基因的表达情况.结果:雌性衰老大鼠各组子宫组织qRT-PCR结果显示p21和cyclinD1基因表达相比均有显著的统计学意义(P＜0.01).D-gal组p21基因表达与Normal组比较升高,差异有显著性(P＜0.01).OR各剂量组p21基因表达与D-gal组比较下降,差异有显著性(均P＜0.01),OR-L组作用较为明显.D-gal组cyclinD1基因表达与Normal组比较降低,差异有显著性(P＜0.01);OR各剂量组cyclinD1基因表达与D-gal组比较均升高,差异有显著性(均P＜0.01),表达随着OR剂量增加而升高.结论:OR可降低雌性衰老大鼠子宫组织细胞增殖负性调控因子p21基因表达,提高正性调控因子cyclinD1基因表达,促进衰老雌性大鼠子宫细胞增殖.OR延缓雌性生殖器官衰老作用可能通过调控子宫组织p21-cyclinD1信号通路发挥作用.
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聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴别哈蟆油药材及其伪品
目的 建立哈蟆油与伪品蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油水溶性蛋白的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-polyacrylamide gel electrophoresis,Native-PAGE)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴别方法,并对2种电泳方法进行比较.方法 采用Native-PAGE和SDS-PAGE两种电泳系统,分别对不同产地哈蟆油与其伪品的水溶性蛋白的组成及其分子量分布范围进行比较研究.结果 Native-PAGE实验结果显示:哈蟆油与桓仁林蛙油均具有6条特征谱带,黑龙江林蛙油具有5条特征谱带,而蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的特征谱带数目分别为2条、1条和1条.SDS-PAGE实验结果显示:哈蟆油、黑龙江林蛙油和桓仁林蛙油均具有11条特征谱带,而蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的特征谱带数目分别为5条、6条和6条.2种电泳图谱中,哈蟆油等正品药材与伪品蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油在特征谱带位置等特征上有明显区别.结论 Native-PAGE和SDS-PAGE两种电泳方法均可用于哈蟆油与类似品和伪品的鉴别,为哈蟆油质量评价和控制方法提供了一种简易的鉴别方法.
关键词： 哈蟆油 鉴别 伪品 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 -
哈蟆油与类似品和伪品的质量评价
目的 建立哈蟆油及其类似品黑龙江林蛙油、桓仁林蛙油与伪品蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的定性和定量方法.方法 系统地研究不同产地哈蟆油及其类似品与伪品的膨胀度、薄层色谱法等定性鉴别方法,并采用高效液相色谱法、凯氏定氮法、氯胺T比色法和茚三酮柱后衍生化-氨基酸分析法等,分别测定哈蟆油及其类似品与伪品中1-甲基海因、激素、总蛋白质、胶原蛋白和氨基酸的含量.结果 哈蟆油、黑龙江林蛙油及桓仁林蛙油膨胀度均大于75.0,青蛙油膨胀度范围为52.5～95.4,而蟾蜍油和牛蛙油膨胀度均低于40.0.蟾蜍油和牛蛙油薄层色谱图中有2个特征性斑点,与哈蟆油、黑龙江林蛙油、桓仁林蛙油及青蛙油的色谱图有明显区别.哈蟆油及其类似品与伪品中均检测出1-甲基海因,其含量质量分数为1.51×10-4％ ～3.72×10-2％.哈蟆油及其类似品与伪品中雌二醇、雌酮、睾酮和孕酮等4种激素含量为微量.哈蟆油及其类似品总蛋白质含量、氨基酸含量明显高于蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油等伪品,但胶原蛋白含量明显低于3种伪品.结论 系统地研究了不同产地哈蟆油及其类似品与伪品的定性和定量分析方法,为哈蟆油质量综合评价和控制提供了详实的实验数据,对今后药典哈蟆油质量标准的修订具有重要的参考价值.
