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应用聚合酶链式反应鉴定实验细胞的来源种属
目的 应用聚合酶链式反应(PCR)鉴定常见细胞的种属来源,以判断培养细胞是否存在种间的交叉污染.方法 根据文献报道和NCBI数据库我们得到了32对种属特异性引物,并分别针对10种常见的细胞种属,对这些引物进行特异性和敏感性的筛选;以待检测细胞的基因组DNA为模板进行PCR及后续的琼脂糖凝胶电泳;以不同种属来源细胞的DNA混合物作为阳性对照模板,以水作为阴性对照模板.结果 针对上述10种常见细胞来源的种属分别得到了1对特异性和敏感性均较好的引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后可以准确鉴定待检测细胞的种属来源,并判断该细胞是否存在种间污染.结论 应用聚合酶链式反应可以简便、快速地鉴定实验细胞的种属,并判断该细胞是否存在种间的交叉污染.
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随机扩增多态DNA技术在鼠类种属来源判定中的应用研究
目的 研究如何运用随机扩增多态DNA(RAPD)技术判定鼠类种属及来源.方法 取鼠尾组织制备DNA基因组,并进行RAPD扩增,以强带差异来区分鼠类遗传多态性.结果 建立了褐家鼠DNA快速制备方法,并获得基因图谱.根据120条引物各自表现出的不同多态性,合成一组褐家鼠的通用引物,定名为P1(5'-TCG GCG GTT C-3')、P2(5'-GAGAGC CGT C-3')、P3(5'-ATG GCA TCT C-3')和P4(5'-CTT GGC ACG A-3'),结果显示,该组引物对褐家鼠在目的片段(925 bp)处均有良好的扩增.结论 分析个体DNA序列同源程度判断遗传距离大小,可鉴别鼠的来源是否为输入性鼠类,对追溯某种鼠类扩散途径和历史以及预警鼠传疾病提供科学依据.
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夏季成蚊夜间活动规律的调查
为了解临沭县夏季成蚊夜间活动规律,我们于2001年7月15日在临沭县农村居民区对夜间成蚊活动情况进行了通宵观察.1 材料与方法1.1 选点调查点设在临沭县临沭镇杨楼村,选择调查前3周内不施用任何杀虫剂的居民区.于2001年7月15日,捕蚊时间从19时开始至翌日晨7时结束,连续捕蚊12 h.1.2 调查方法采用人帐诱捕法,将白色棉纱蚊帐放置于居民户院内,蚊帐顶面80cm×80cm,垂直高度150cm,蚊帐下缘的高度距地面30cm,并用线绳将上下四角固定.选用3cm、长15cm玻璃吸蚊管,采用人工小时计数法,调查者在帐内用手电照明,吸蚊管捕蚊.将每小时捕获的成蚊用乙醚麻醉后放入玻璃试管,带回实验室进行种属鉴定和计数.
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慈溪市蚊媒季节消长调查及防制对策
为了解慈溪市蚊虫种群及季节消长情况,2004年10月至2005年5月我们在市区和逍林镇破山4个村居民区对成蚊活动情况进行了观察.1调查方法在市区按东、南、西、北、中位置设5个调查点,每月监测1次;逍林镇破山4个村以居民区为调查重点,猪舍兼顾监测,每月监测2次.采用电动捕蚊器捕蚊,人工小时法计数,每间房屋捕蚊15 min.捕获的成蚊用乙醚麻醉后放入玻璃瓶内,带回实验室进行种属鉴定和计数.
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Beta-TC-6细胞的免疫组化及分子生物学属性分析
目的 探讨Beta-TC-6细胞免疫组化及分子生物学基本属性及基本鉴定指标.方法 (1)用针对小鼠细胞种属特异且敏感的c ox-Ⅰ基因引物,以Beta-TC-6细胞的基因组DNA为模板行PCR及后续琼脂糖凝胶电泳;(2)将Beta-TC-6细胞制备成细胞蜡块,用免疫组化S-P法检测细胞蜡块胰岛素标记物(INS)和神经内分泌细胞特异性分子标记物突触素(Syn)、嗜铬素(CgA)及神经特异性烯醇化酶(NSE)的表达,并检测细胞增殖指标Ki67和P53.(3)用计算机图像分析技术测试活细胞面积及细胞蜡块中细胞的大小.结果 (l)cox-Ⅰ基因引物经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后在目的泳道上得到单一目的条带;(2)免疫组化检测:INS、Syn、CgA、Ki67及P53均表达阳性,Ki67的阳性指数为99％,NSE表达呈阴性;(3)体外培养状态下活细胞的面积均值为696.59 μm2,细胞蜡块切片中细胞及核的面积分别为60.54 μm2、32.17μm2,核浆比1.32.结论 cox-Ⅰ基因引物PCR扩增并联合免疫组化检测指标INS、Syn、CgA、Ki67及P53可对Beta-TC-6细胞属性进行甄别.
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应用线粒体12srRNA和COX-1基因进行种属鉴定
目的 以线粒体DNA为目标序列,探讨生物检材的种属来源问题.方法 收集人和7种动物的血液或肌肉组织样本,提取DNA定量后,复合扩增线粒体12srRNA和COX-1基因片段,2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物谱带.结果 人类DNA扩增产物分别为436 bp、277 bp两条谱带.而鼠、鸡、猪、兔、猫、狗、羊的扩增产物仅有一条谱带,430～450 bp,即动物基于COX-1基因片段无扩增产物.结论 复合扩增线粒体12srRNA和COX-1两基因片段进行种属鉴定,方法简单,灵敏度较高,可应用于法医学实践.`
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应用线粒体12srRNA和COX-1基因进行种属鉴定
目的 以线粒体DNA为目标序列,探讨生物检材的种属来源问题.方法 收集人和7种动物的血液或肌肉组织样本,提取DNA定量后,复合扩增线粒体12srRNA和COX-1基因片段,2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物谱带.结果 人类DNA扩增产物分别为436 bp、277 bp两条谱带.而鼠、鸡、猪、兔、猫、狗、羊的扩增产物仅有一条谱带,430～450 bp,即动物基于COX-1基因片段无扩增产物.结论 复合扩增线粒体12srRNA和COX-1两基因片段进行种属鉴定,方法简单,灵敏度较高,可应用于法医学实践.`
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热带珊瑚岛恙虫病流行病学调查
自陆振豸报道西沙永兴岛存在我国南边的热带珊瑚岛恙虫病疫源地以来[1],患者逐年增多,时有暴发.为查明热带珊瑚岛恙虫病的流行病学特征及其影响因素,我们于1999年10～12月对西沙永兴岛进行流行病学调查研究.现将结果报告如下.1 材料和方法1.1 一般资料了解岛上自然地理条件、气象及军民生活环境等情况.1.2 个案调查对岛上医院门诊及各单位1999年1～12月临床确诊恙虫病患者进行调查,了解恙虫病流行情况,走访本病疑似患者,填写流行病学个案资料.1.3 储存宿主调查选择有代表性的生境用笼日法捕捉小兽,经种属鉴定后,采集恙螨.
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种属鉴定中的DNA技术方法
随着科学技术的发展及社会的需要,种属鉴定所应用的领域越来越广泛,不仅局限在法医学.现对在打击假冒伪劣、保护野生物种、食品安全问题等检验检疫方面所使用的相关现代技术方法(DNA)作以综述.
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16S rRNA基因检测在细菌学中的应用
16SrRNA普遍存在于原核单细胞生物体内,利用体外扩增16SrRNA基因,借助各种检测手段或序列分析,可用于各种细菌、螺旋体、支原体、衣原体和立克次体种系发生的分析和种属鉴定.在种系发生学研究中,16SrRA基因几乎是"金标准";在用于鉴定方面,某些情况下虽然尚需要其他方法的配合,但是就单一检测方法的准确性和检测效率来看,针对16SrRNA的细菌鉴定方法仍然是好的方法之一.
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异尖线虫分子分类方法概述
异尖线虫传统的分类主要基于形态学方法,但该方法在种属鉴定上较困难.多种分子生物学方法,如多重PCR、PCR-限制性片段长度多态性、PCR-单链构象多态性、DNA序列分析等,应用于异尖线虫分类鉴定,具有快速、准确和特异性高等优点.该文综述了这些技术的基本原理、影响因素及其在异尖线虫分类中的应用.
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常见嗜尸性蝇类蛹壳样品在种属分子鉴定中的应用
目的 探讨常见嗜尸性蝇类蛹壳样品在法医昆虫学种属鉴定中的应用价值. 方法 收集不同保存时间的嗜尸性蝇类成虫及其羽化后的蛹壳成套样品共55套,根据形态学特征鉴定为2科6属8种.以不同保存时间,将上述样品分为＜2年组(n=23)、2～5年组(n=20)和＞5年组(n=12).取单个成蝇胸部和空蛹壳,以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取各样品mtDNA,并测定其浓度和纯度.PCR扩增CO Ⅰ基因,获得CO Ⅰ基因序列Ⅰ和Ⅱ,分别截取498 bp和841 bp的序列.在GenBank数据库对所获序列作BLAST搜索,进行同源性比对分析. 结果 所有样品均成功提取了mtDNA.保存时间≤5年的成虫胸肌和＜2年的空蛹壳DNA浓度多在1.0～3.0μg/μl之间,ArJA 280值多在1.6～～1.8之间.保存时间＞5年的成虫胸肌和≥2年的空蛹壳DNA浓度多低于1.0μg/μl,A260/A280值多低于1.6.随着样品保存时间的延长,各样品DNA浓度均明显下降(P＜0.01).保存时间＜2年,成虫胸部样品和空蛹壳样品均成功扩增出CO Ⅰ序列Ⅰ和序列Ⅱ.随着保存时间的延长,扩增成功率明显下降,序列Ⅱ表现更为明显(P＜0.01).8种嗜尸性蝇类CO Ⅰ基因序列Ⅰ和序列Ⅱ分别有6个和7个种属的同源性比对结果完全正确且样品序列比对的Max ident值均＞97％. 结论 嗜尸性蝇类空蛹壳样品可作为mtDNA提取和种属比对的检材.
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糜蛋白酶原粗品中猪牛羊源性成分的PCR检测
目的:采用PCR方法检测糜蛋白酶原粗品中的猪、牛、羊源性成分.方法:利用柱式动物基因组DNA抽提试剂盒从糜蛋白酶原粗品中提取残留DNA,以其为模扳通过PCR扩增法进行动物源性成分鉴定及考察该方法的特异性及灵敏度.结果:柱提取法能够提取适用于PCR反应的模板DNA.PCR方法对猪、牛、羊源性成分的鉴定具有特异性,且灵敏度分别达到0.02、0.02和0.2 ng/mg.结论:建立了一种快速、有效、适用于糜蛋白酶原粗品中猪、牛、羊源DNA鉴别的方法.
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玻璃酸酶粗品中猪、牛、羊源性成分的PCR检测
基于限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术及TaqMan探针实时荧光PCR技术,建立针对玻璃酸酶粗品的猪、牛及羊源性成分鉴定方法.用DNA提取试剂盒提取玻璃酸酶粗品中的DNA,以DNA提取液为模板进行PCR-RFLP及TaqMan探针实时荧光PCR,检测样品中是否含有猪、牛、羊源性成分.2种PCR方法均具有良好的特异性,且皆可检测到0.01 ng/μl的猪、羊源性DNA,和0.1 ng/μl的牛源性DNA,实时荧光PCR方法更可检测到0.001 ng/μl的猪源性DNA.PCR-RFLP方法和TaqMan探针实时荧光PCR方法可用于检测生化药品原材料的种属来源.
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多重PCR快速鉴定19种致病真菌
目的 建立快速鉴定致病真菌的多重PCR体系.方法 选取19种致病真菌的rDNA内部转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立两个多重PCR体系,扩增临床与环境分离真菌菌株、人类细胞及9种常见细菌DNA,检测体系的特异性；以浓度梯度的DNA模板检测体系的灵敏度.结果 对氟康唑天然耐药的克柔念珠茵、光滑念珠茵以及对两性霉素B耐药的土曲霉、镰刀茵、尖端赛多孢、根霉在该体系中可扩增出特异性条带,其他真菌可同时进行种属鉴定.74株被测真菌菌株的鉴定结果与常规鉴定的符合率为95.9％.两个多重PCR体系对人类基因组及9种常见细菌DNA的扩增结果均为阴性；扩增阳性的低模板浓度均为10 fg/μL.结论 建立的两个多重PCR体系可对致病真菌进行检测和种属鉴定.
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鸡绦虫寄生菌种的PCR鉴定及其进化关系分析
目的 探明寄生于鸡棘沟赖利绦虫体内的细菌和真菌种类.方法 实验分别设计针对细菌和真菌的16s rDNA、18s rDNA通用引物,提取鸡棘沟赖利绦虫基因组DNA,扩增目的基因并进行测序.使用MEGA5.1软件对测序基因序列进行Neighbor-Joining法系统发育树构建,分析其进化关系.结果 寄生于鸡棘沟赖利绦虫的细菌隶属于无色杆菌属,相似性为99％;真菌在已鉴定的种类中隶属于马拉色氏霉菌属,与限制性马拉色菌进化关系接近,相似性高达99％.结论 实验首次应用PCR手段鉴定了寄生于鸡棘沟赖利绦虫体内细菌和真菌的种类,为鸡绦虫病继发性感染的防治提供了有效的依据.
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复合PCR同步鉴别葡萄球菌及其多重耐药基因的研究
葡萄球菌依然是当今医院与公共场所的一种主要病原菌,在医院获得性感染中占重要地位.随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的流行及凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)致病作用的确定,加强对葡萄球菌致病机理与耐药机制的研究,已成为控制其感染蔓延的当务之急. 鉴于在临床微生物实验室中应用分子生物学技术对分离菌株进行快速耐药基因检测的重要性 ,本实验探讨采用复合PCR对葡萄球菌分离株进行种属鉴定,并同步检测甲氧西林和(或)莫匹罗星耐药基因携带情况,其方法与结果如下.
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肝素钠中猪、牛及羊源性成分的PCR检测
目的:采用常规PCR及实时荧光PCR方法检测肝素钠粗品及原料药中的猪、牛、羊源性成分.方法:利用土壤基因组DNA提取纯化试剂盒从肝素钠粗品及原料药中提取残留核酸,以其为模板,通过常规PCR及实时荧光PCR法进行动物源性成分鉴定.以提取猪肝、牛心、羊肝的DNA为对照品,验证所建立的常规PCR法及实时荧光PCR法的特异性及灵敏度,并用以上两种方法对3批肝素钠粗品及4批肝素钠原料药进行动物源性成分鉴定.结果:采用的两种PCR方法对猪、牛、羊源性成分的鉴定具有特异性,且灵敏度分别达到Pg级及10-1 pg级.通过土壤基因组DNA提取纯化试剂盒成功从肝素钠粗品及原料药中提取获得适用于PCR反应的模板DNA,显示7批肝素钠样品均为猪源性产品,且未检出牛、羊源性成分污染.结论:建立了一种快速有效地从肝素钠粗品及原料药中提取DNA的方法,并成功通过两种PCR方法对其猪、牛、羊源性成分进行鉴定,为监督药品规范生产,保证用药安全提供了技术支持.
关键词： 肝素钠 常规聚合酶链式反应 实时荧光聚合酶链式反应 种属鉴定 -
182株儿童患者肺炎链球菌的分子生物学鉴定及分型
目的 对来自患儿的肺炎链球菌进行分型,为肺炎链球菌疫苗的正确选择提供科学依据.方法 收集2014年来自河北省儿童医院的182株肺炎链球菌,普通PCR对肺炎链球菌进行种属鉴定,应用多重PCR方法对菌株进行菌型分析.结果 经PCR检测182株菌的cpsA基因扩增均为阳性;经多重PCR检测,除8株未分型菌株外,其余174株肺炎链球菌中,以19F、19A和6A/6B型数量多,分别为68株(37.36%)、33株(18.13%)和26株(14.28%),其余型别有35B型、14型、6C/6D型、23F型、15B/15C型等.结论 182株肺炎链球菌的菌型主要为19F、19A和6A/6B,为该省肺炎链球菌疫苗的正确选择和制订使用策略提供了科学依据.
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应用HRM技术进行法医昆虫种属鉴定的初步研究
目的 对高分辨率熔解曲线技术(High Resolution Melting,HRM)在昆虫种属鉴定中的有效性进行初步研究.方法 提取绿蝇头部、胸部、腿部组织基因组DNA,设计特异性引物对其线粒体COI和16SrDNA区进行扩增检测,结果分别用HRM和DNA测序两种方法进行检测,对其结果进行比较.结果 HRM方法对COI和16SrDNA基因检测均获得了检测峰,DNA测序COI基因区测序成功,16SrDNA基因区因扩增量少未能成功测序；两种方法对实验样本的胸部、腿部和头部组织的检测结果具有较好的一致性.结论 HRM和测序两种方法具有较好的一致性,可用于法医昆虫的种属鉴定研究.
