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汉滩型与希望山型汉坦病毒的体外重组
目的探明汉坦病毒汉滩型与希望山型之间能否发生基因重排,以及发生重排的频率和特点. 方法用汉坦病毒汉滩型76-118株与希望山型PHV株混合感染Vero E6细胞,空斑形成实验挑取子代病毒克隆株,传代培养后用RT-PCR方法鉴定子代病毒基因型. 结果子代病毒14/36来源于PHV株; 12/36来源于76-118株;5/36 汉滩型与希望山型分型引物扩增均为阳性;1株子代病毒L, S片断均来源于76-118株,而M片段两种引物扩增均为阳性;2株子代病毒L片断来源于76-118株,S片断来源于PHV株,M片段两种引物扩增均为阳性. 1株子代病毒L, S片断均来源于76-118株,而M片段来源于PHV株. 结论汉坦病毒汉滩型与希望山型之间可以发生基因片段的重排.
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肝癌患者HBV血清学标志和HBV-DNA的关系
目的为了探讨肝癌患者血清中HBV标志物与HBV-DNA之间的相关性.方法运用酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应同时检测血清中HBV标志物和HBV-DNA.结果在427例肝癌患者的血清中,HBV-M(+)为74.0%,HBV-DNA(+)为44.0%,与正常对照组差异非常显著.结论乙型肝炎病毒的感染与复制仍是肝癌的主要致病因素.
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HFRS患者血清中HV-RNA的PCR检测及扩增产物的测序分析
目的探讨RT-PCR用于HFRS临床标本中病毒基因检测的若干影响因素及西安地区近年主要流行汉坦病毒(HV)毒株的分子流行病学特点. 方法设计合成了两套分别互补于HV M基因片段和S基因片段的引物, 建立了检测HFRS患者临床血清标本中HV 基因的RT-nested PCR方法, 并对扩增的部分HV靶基因进行了测序分析和比较. 结果 119份HFRS患者血清(经临床和IFA确诊)经用S基因片段引物的RT-nested PCR检测,阳性率分别为:60.5% (<1 wk), 34.1% (1～2 wk), 4.0% (2～3 wk), 0% (>3 wk), 31份HFRS急性期患者 血清用M基因片段引物的RT-nested PCR检测,仅12份阳性,阳性率40.0%.将PCR扩增的6个靶基因序列与76～118株S基因片段相应的核苷酸序列进行分析比较,同源性为87.2%～96.0%;其推导的氨基酸序列与76～118株核衣壳蛋白相应的氨基酸序列比较,同源性为89.0%～96.0%. 结论 S基因片段引物的PCR扩增效果优于M基因片段引物.6份S基因片段引 物扩增产物的测序结果显示,西安地区引起HFRS流行传播的主要毒株仍为汉滩型.
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用PCR-SSCP及DNA测序法研究胃癌p53基因突变
目的探讨p53基因突变与人类胃癌发生的关系. 方法运用PCR、PCR-SSCP结合银染法对25例胃癌组织p53基因第4、第5～6和第7外显子进行突变检测; 运用双脱氧链终止法对第7外显子阳性突变标本进行DNA测序. 结果在25例胃癌组织中检出突变5例,突变率为20%;在第7外显子阳性突变标本中发现了18 bp的大片段缺失. 结论 p53基因突变与人类胃癌的发生具有明显相关性,并且这种突变可能不仅仅局限于点突变,大片段缺失也是p53基因突变方式之一.
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大鼠睾丸前促甲状腺激素释放激素及其受体cDNA的克隆和序列测定
目的 研究促甲状腺激素释放激素(thyrotrophin-releasing hor mone, TRH)及其受体(TRH receptor, TRH-R)在大鼠睾丸组织中的表达规律和在生殖发育调节中的作用. 方 法 以大鼠 睾丸组织总RNA为模板，依据大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA设计引物，进 行反 转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain rection, RT-PCR)，对 特 异性片段进行序列测定. 结果 从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的 cDNA片段，其核苷 酸序列与大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA序列完全一致. 结论 首次用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA克隆.
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环氧化酶2启动子区基因多态性与慢性牙周炎的关系
目的:研究环氧化酶2启动子区-765位点、-1195位点单核苷酸多态性与慢性牙周炎遗传易感性的关系.方法:根据慢性牙周炎的诊断及纳入标准收集150例慢性牙周炎患者及143名健康对照者,检查牙周状况并根据牙周附着丧失的程度进行分类,用问卷调查了解受试者的一般情况.取患者的颊黏膜拭子提取其基因组DNA,采用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性的方法检测环氧化酶2-765位点G>C及-1195位点G>A的基因型分布并分析其基因多态性与慢性牙周炎易感性的关系.结果:环氧化酶2-765位点G>C基因型频率在各组间无显著性差异,但-1195位点G>A的基因型分布在中、重度牙周炎患者较健康对照者之间有统计学差异(P<0.05),携带GA或从基因型可使牙周病的患病风险增加(OR3.3,95%CI 1.6～6.9或OR3.7,95%CI 1.5～9.5),中、重度牙周炎患者从或GA基因型频率较健康对照者显著增加.结论:环氧化酶2启动子区位点单核苷酸多态性与慢性牙周炎的易感性有关.
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人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆
目的扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因,将其克隆到T载体来构建T载体文库.方法收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例,TRIzol法提取总RNA、纯化mRNA,行RT-PCR扩增,制备T载体,用于PCR产物的克隆.结果总RNA纯度高,完整性好,mRNA获得率为1%.经RT-PCR,VH、Vλ、Vκ的每一条5＇端引物均与其相应的3＇端引物成功地扩增出了可变区基因片段,轻、重链T载体库分别为1.7×108和3.5×108.结论所采用的引物能够100%扩增目的片段,T载体过渡能显著提高克隆效率,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础.
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聚合酶链式反应方法筛查慢性阻塞性肺疾病常见致病菌
目的 对慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期及急性加重期(AECOPD)患者痰标本进行细菌学分析,筛查常见致病菌的感染情况,探索细菌感染与COPD发病及进展之间的关系.方法 选择7种COPD常见致病菌(肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、卡它莫拉菌和鲍曼不动杆菌)的特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法,对42例COPD稳定期患者、66例AECOPD患者和11例正常人痰标本进行检测,筛查上述病原菌的感染情况.结果 肺炎克雷伯杆菌在稳定期检出8例(19％),AECOPD检出4例(6.1％)；铜绿假单胞菌在稳定期检出2例(4.8％),AECOPD检出11例(16.7％)；肺炎链球菌在稳定期全部检出(100％),AECOPD检出26例(39.4％),正常对照组全部检出(100％)；金黄色葡萄球菌在稳定期未检出,AECOPD检出6例(9.1％)；流感嗜血杆菌在稳定期检出39例(92.9％),AECOPD检出51例(77.3％),正常对照组全部检出(100％).正常对照组以下各菌均未检出.卡它莫拉菌在稳定期检出12例(28.6％),AECOPD检出6例(9.1％)；鲍曼不动杆菌在稳定期检出3例(7.1％),AECOPD检出5例(7.6％).肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和卡它莫拉菌在COPD稳定期和AECOPD间的检出率差异有统计学意义(P＜0.05),铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌在两组间的检出率差异无统计学意义(P＞0.05).测序结果与检出结果一致.结论 COPD稳定期患者上呼吸道菌群水平接近正常人,而AECOPD患者明显降低.某些细菌感染是AECOPD发病的主要原因,但并非所有细菌感染都与COPD疾病进展有关.
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慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因检测及其临床意义
目的:探讨BCR-ABL融合基因与慢性粒细胞白血病(CM L)的相关性.方法:利用实时荧光定量PCR检测168例CM L患者体内BCR-ABL含量,并与113例非CM L患者作为对照组进行比对,分析BCR-ABL基因与CM L的相关性.结果:168例CM L患者BCR-ABL检测阳性156例(92.9%),阴性12例(7.1%).对照组113例非MCL者BCR-ABL阳性3例(2.7%),BCR-ABL阴性110例(97.3%).CM L患者BCR-ABL阳性率明显高于正常对照组,差异有统计学意义.其中,BCR-ABL阳性组男性高于女性,差异有统计学意义;阳性组的平均年龄和白细胞平均数均高于阴性组,差异有统计学意义.结论:BCR-ABL是诊断CM L重要辅助检查,与CM L之间存在相关性.
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丙型肝炎病毒携带者病毒基因型分布特征及临床意义
目的：研究丙型肝炎病毒（HCV）携带者病毒基因型流行趋势和分布特征，探讨其临床应用价值。方法：随机收集无临床症状 HCV携带者血清样本共计90例，HCVRNA含量大于1×103 IU／ml ，其中男58例，女32例。应用聚合酶链式反应（PCR）和反向斑点杂交技术（RDB）进行HCV基因分型检测，并对受检者相关资料进行分析。结果：HCV携带者 HCVRNA 平均浓度为4．94±1．36 lg IU／ml。不同性别组之间 HCVRNA 含量无明显差异（P＞0．05）。所有标本HCV基因成功分型。单基因型感染为主要感染类型，占95．56％（86／90）。其中1b型感染率为48．89％（44／90），2a型感染率为42．22（38／90）。不同性别组 HCV携带者 HCV基因型分布差异无统计学意义（P＞0．05）。结论：本地区 HCV携带者感染主要类型为单基因型感染；HCV1b为主要基因型，其次为2a型；开展HCV基因型检测具有重要的临床意义。
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PCR荧光法和 PCR-反向斑点杂交法检测人乳头瘤病毒比较研究
目的：研究PCR荧光法和PCR‐反向斑点杂交（PCR‐RDB）法检测高危型人乳头瘤病毒（HPV）在宫颈病变筛查中的意义。方法：收集271例女性宫颈脱落细胞样本，分别采用PCR荧光法和PCR‐RDB法进行HPV检测，比较两种方法检测结果的一致性；另设立双阳组（两种方法检测8种高危型H PV均为阳性的患者）和对照组（其余患者），以病理检测为标准，比较两者阳性率之间的差别。结果：两种方法检测8种 H PV 亚型显示有82．66％（224／271）的样本，以检测结果一致，两者比较差异无统计学意义；在宫颈组织病理活检中，双阳组患者病变率为42．11％（24／57），对照组为10．49％（15／143），两者比较差异有统计学意义。结论：PCR荧光法和 PCR‐RDB法用于H PV检测一致性较好，高危型H PV检测是宫颈癌筛查的有效方法。
关键词： 宫颈疾病/诊断 乳头状瘤病毒科/分析 聚合酶链式反应 酶免疫斑点检测 -
PCR-RDB 技术在 HCV 基因分型中的应用研究
目的：评价 PCR-RDB 技术在丙型肝炎病毒(HCV)基因型检测中的临床实际应用价值。方法：随机收集经实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测 HCV RNA 含量大于1×103 IU/ml 血清样本总计158份,其中无临床症状丙型肝炎病毒携带者90例,慢性丙型肝炎(CHC)患者48例,肝硬化(HS)患者16例,肝癌(LC)患者4例。全部血清样本应用 PCR 和反向斑点杂交技术(RDB)进行 HCV 基因分型检测,并对检测结果进行统计学分析。结果：所有标本 HCV 基因分型成功,其中1b 型78例,2a 型65份,3a 型3例,3b 型2例,6a 型2例,1b 和2a 混合感染型8例。不同疾病组 HCV 不同基因型分布差异无统计学意义。结论：HCV 基因型与疾病类型无相关性；PCR-RDB 杂交技术适用于临床实验室开展 HCV 基因型检测。
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人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒临床应用及初步评价
目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）核酸定量检测试剂（PCR‐荧光探针法）的临床使用及初步评价。方法：用浓缩一步法试剂与煮沸法试剂对192例临床收集的样本进行HCMVDNA检测并对比其结果，同时，将两种试剂的检测结果分别与HCMV‐pp65抗原检测结果进行对比。结果：新型人巨细胞病毒核酸检测试剂与煮沸法试剂的阳性一致性百分比98．06％，阴性一致性百分比95．51％，总一致性百分比96．88％；对6例不符样本进行测序复核，并对复核后的结果进行Kap‐pa检验一致性分析，结果Kappa值＝1．000，表明新型试剂的检测结果与煮沸法试剂及复核检测的结果具有很好的一致性。在与HCMV‐pp5抗原检测结果的对比中，两种试剂均表现出较好的准确性。结论：人巨细胞病毒核酸检测试剂与煮沸法试剂检测结果具有很好一致性，操作简单快速，减少污染环节，并具有内标控制假阴性，结果准确，符合临床检测要求，具有较高的应用价值。
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乙型肝炎病毒DNA定量检测室内质控品的制备及应用研究
目的 自制乙型肝炎病毒DNA室内质控血清并探讨其在临床标本检验中的应用价值.方法 用检测后的患者标本自制阳性室内质控血清,用实时荧光定量PCR检测血清HBV-DNA,记录2013年1～5月质控结果、标准曲线的斜率、截距、相关系数和相关结果的均值(x)、标准差(s)及变异系数(cv);结果 自制质控物结果对数的累计数据x±2s范围为4.3～5.34,在该质控的参考值范围内;结论 本实验室采用Taqman实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA实验中,质控品稳定性良好,可联合运用多参数同时监测的质拉方法进行,能保证为临床提供有效可靠的准确结果.
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甘肃地区一个遗传性痉挛性截瘫家系spastin基因的突变分析
目的 对甘肃地区一个常染色体显性遗传性痉挛性截瘫(HSP)家系spastin基因突变进行分析.方法 应用聚合酶链反应一单链构象多态性结合DNA序列分析方法,检测该家系中9名患者spastin基因突变.结果 该家系中9名患者均出现异常单链构象多态性电泳带,经DNA测序证实为第8号外显子第1288位核苷酸存在碱基A被碱基G置换.结论 该家系HSP致病基因为spastin在第8号外显子第1 288位核苷酸发生错义突变,碱基A被碱基G置换,氨基酸改变K388R.
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新型PCR技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种选择性DNA快速扩增技术,常用于基因检测与分子诊断.作为分子生物学的关键技术,其发展经历了终点PCR、实时PCR和数字PCR三个阶段,实现了定性检测到绝对定量的转变.面对高GC模板和稀有突变的扩增难题,以及快速、高效和经济的特殊需求,诞生了极限PCR、光PCR、Cast PCR和脉冲PCR等多种新型PCR技术.
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新疆老年人群TTV感染状况的初步研究
目的 了解输血传播病毒(TTV)在老年易感人群中的感染情况.方法 采用套式PCR方法,对214例老年易感人群血清进行TTV-DNA的检测.结果 在214例老年易感人群中共检出71例,TTV-DNA阳性血清,总检出率为33.2%,TTV-DNA阳性率与民族、性别无统计学差异(χ2=1.14,P>0.05);其中甲型肝炎老年病人中TTV-DNA阳性率为28.6%,乙型肝炎老年病人中TTV-DNA阳性率为36.0%,HBsAg(+)携带者的TTV-DNA阳性率为29.1%,各组相比差异无统计学意义(χ2=0.779,P>0.05).结论 新疆老年易感人群中存在较高的TTV感染,TTV的感染可能与肝炎有关.
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乌鲁木齐高考学生输血传播病毒感染的比较分析
目的 研究输血传播病毒(TTV)在新疆乌鲁木齐市体检高考学生和HBV携带考生中的感染情况,以探讨输血传播病毒的致病特性.方法 以公布的TTV第一读码区序列设计两对寡核苷酸引物,用套式PCR方法,对120例体检HBsAg阴性考生和46例HBV携带考生血清进行TTV- DNA的检测.结果 120例体检HBV阴性考生中检出4例TTV-DNA阳性血清,阳性率为3.3%;46例HBV携带考生中检出8例TTV-DNA阳性血清,TTV-DNA阳性率为17.4%,两组相比差异有统计学意义(χ2=7.81, P﹤0.01).结论 新疆考生中存在TTV的感染, HBV携带考生中TTV的感染率较高.
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儿童中输血传播病毒(TTV)感染的检测及分析
目的了解输血传播病毒(TTV)在新疆儿童中的感染情况. 方法采用套式PCR方法对160例体检儿童血清进行TTV- DNA的检测.结果 160例体检儿童中共检出22例TTV-DNA阳性血清,检出率为13.7 %,TTV-DNA 阳性率与民族、转氨酶数值无统计学差异(P>0.05). 结论新疆儿童中存在TTV的感染.
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各型肝炎患者中输血传播病毒感染的检测及临床意义
目的:了解输血传播病毒(TTV)在各型肝炎患者中的感染情况. 方法:采用套式PCR方法,对218例不同型别的肝炎病人血清进行TTV- DNA检测.结果:218例不同肝炎病人中共检出72例TTV-DNA阳性血清,总检出率为33.0%,不同民族、性别间TTV-DNA 阳性率差异无统计学意义(P>0.05).其中排除非甲-非戊型肝炎单纯转氨酶增高病人中TTV-DNA阳性率为53.9%,而在明确诊断为甲型、乙型、丙型肝炎病人中TTV-DNA阳性率为26.5%,两组相比差异有统计学意义(χ2=13.38, P<0.05).结论:各型肝炎患者中存在TTV感染,非甲-非戊型肝炎单纯转氨酶增高病人中TTV感染率明显高于明确病原肝炎病人.TTV感染与肝炎有关,可能是原因不明肝炎的病因之一.
