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生物医学检测的PCR技术及其应用
聚合酶链反应或多聚酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)检测技术,又称体外基因扩增技术,早由美国Cetus公司的Kary Mullis及其同事于1985年发现并研究成功.它是通过聚合酶促寡核苷酸引物的延长,反复循环,使目的DNA成指数扩增,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法,也是体外酶促合成特异DNA片段的新方法.经过PCR过程,可在数小时内使几个拷贝的DNA序列扩增107-109倍.它已广泛应用于基因分离、基因克隆、核酸序列分析和测序,应用于研究基因表达和调控、基因多态性分析以及探讨基因与疾病等生物医学体外检测的各个领域.
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含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰序列短肽的合成及应用研究进展
精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)是具有生物活性的短肽序列之一.它是大多数细胞表面粘附分子能识别的配体上的小氨基酸序列,在内皮细胞的识别、抗血栓、抑制肿瘤,治疗烧伤和皮肤溃疡等方面具有重要的作用.本文综述了近年来国内外对含RGD序列短肽的合成及其应用研究进展.
关键词: 精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸 液相合成 固相合成 酶促合成 生物活性肽 -
去唾液酸糖蛋白受体配体胆固醇-半乳糖苷的酶促合成优化研究
目的 在有机相中利用酶促反应合成能被去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异性识别的配体胆固醇-半乳糖苷分子,对其合成工艺进行优化.方法 采用质谱和核磁碳谱鉴别产物结构;单因素和正交设计法优化酶促合成条件.结果 酶促佳条件为底物胆固醇癸二酸乙烯酯(CH-VS)与乳糖醇(LA)物质的量之比4∶1,脂肪酶Novozym 435 25 mg,反应32 h,产率高达92%.结论 该方法高效、反应条件可行、产物专一.
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酶催化合成CCK-4三肽片段
目的探讨酶法合成胃泌激素CCK-4 C-末端片段三肽衍生物Phac-Met-Asp(OMe)-Phe-NH2.方法以Phac-Met-OCam为起始原料,采用三种蛋白酶,即α-糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(α-chymotrypsin,papain,thermolysin),经过三步酶促反应得到目标三肽化合物;研究了酶催化条件下Met-Asp肽键的形成以及天门冬氨酸双酯中α-酯的酶催化条件下的选择性水解;对酶以及反应介质的选择等酶促合成条件进行了研究.结果三步酶促反应均可得到较合适的收率(63%~92%),产物经FAB-MS、FD-MS质谱确认.结论以α-糜蛋白酶为酶催化剂,在含有1.5%0.05 mol/LT^s-HCl缓冲液的乙酸乙酯介质中,Phac-Met-OCam和H-Asp(OMe)2缩合可得到收率大于63%的缩合产物;木瓜蛋白酶催化下可选择性水解Phac-Met-Asp(OMe)2中的α-酯而保留β-酯;嗜热菌蛋白酶能有效地催化Phac-Met-Asp(OMe)-OH与H-Phe-NH2生成肽键.
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影响PCR-RFLP的相关因素
限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, PCR-RFLP)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又称无细胞分子克隆技术.它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增.扩增后,将PCR产物直接酶切、电泳、显色,即可对目的基因进行分类分型.现将我做PCR-RFLP的体会简要陈述如下.