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恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因分枝杆菌——大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定
本文对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)基因片段进行克隆和序列测定。根据恶性疟原虫837株基因编码序列设计合成一对引物，采用PCR技术从恶性疟原虫FCC-1/HN株基因组DNA中特异扩增CSP基因片段的Ⅰ区、中央重复区、重复区后可变区和Ⅱ区；经纯化的扩增产物用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后，定向克隆入大肠杆菌——分枝杆菌穿梭表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，重组克隆经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定，再经PCR和酶切鉴定，并对重组子进行序列测定。结果表明从恶性疟原虫FCC-1／HN株基因组DNA中可特异扩增出约1 171bp的基因片段，阳性重组质粒经双酶切和PCR鉴定与预期的结果一致，序列测定表明所克隆的基因和编码环子孢子抗原的基因片段相符。
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恶性疟原虫GLURP基因的体外扩增,克隆及序列分析
通过体外扩增,克隆恶性疟原虫海南(FCCl/HN)株GLURP基因,测定其基因序列,了解该基因的结构及在FCCl/HN株与其它分离株间的序列差异.根据GLURP基因已知序列设计合成3对引物,用PCR技术从FCCl/HN株基因组DNA中扩增3个部分序列重叠的GLURP基因片段;并分别克隆入测序用PMD-18T载体.用双脱氧链末端终止法测定GLURP基因序列,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较.恶性疟原虫FCCl/HN株GLURP基因全长3711bp,编码l 236个氨基酸.FCCl/HN株与F32株GLURP基因核苷酸序列同源性为96.27%;编码氨基酸序列同源性为95.78%.本文为继续进行FCCl/HN株GLURP抗原的免疫原性和保护性研究奠定基础.
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青海省1999年脊髓灰质炎Ⅰ型野毒株的分子病毒学分析
自中国脊髓灰质炎(脊灰)监测网络建立以来,有报告的脊灰暴发和流行主要由脊灰Ⅰ型野病毒引起.1993年在新疆维吾尔自治区分离到1株Ⅲ型野病毒,但未发现Ⅱ型野病毒.此外,1995年、1996年在云南省发现2例Ⅰ型[1]、2例Ⅲ型境外输入野毒病例[2].1994年10月以来我国本土未发现脊灰野病毒.但是,1999年10月从青海省循化撒拉族自治县分离到2株脊灰Ⅰ型野病毒,1株来自1位16月龄的病例,另1株来自该病例的接触者.应用基因测序法对该毒株做了VP1片段序列的测定,并与疫苗株SabinⅠ型参考株、国内曾经流行的脊灰Ⅰ型野病毒代表株、我国周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株的序列作了基因同源性比较,并由计算机用Neighbor Joining和Bootstrap Test方法分析处理,构建出它们之间的关系树,初步揭示了该毒株很可能是由境外传入我国.
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陕西省西安市及周边地区百日咳鲍特菌抗原基因型别的研究
目的 了解西安市及周边地区百日咳鲍特菌(Bp)5种疫苗相关抗原基因(ptxA、ptxP、prn、fim3和fhaB)的型别分布.方法 对2012-2014年西安市儿童医院患儿350份鼻咽拭子(NPS)标本进行BP的IS481和Ptx-pr基因检测,对双基因阳性的NPS标本进行5种疫苗相关抗原基因的扩增和测序,并与分离菌株的测序结果进行验证;分析5种抗原基因扩增的敏感性和特异性.结果 从350份NPS的190份(54.3％)中成功扩增5种基因并测序;ptxA、ptxP、prn tim3 fhaB扩增成功率分别为56.0％、61.1％、63.1％、60.0％、57.4％,其敏感性分别为67.3％、73.5％、76.0％、72.2％、69.1％,特异性均为100％.ptxA和fhaB分别只有一种基因型,ptxA1和fhaB1;ptxP、prn 、fim3分别以ptxP1、prn1 、fim3-1为主.菌株测序结果与相应NPS的测序结果一致.结论 可以直接从Bp DNA阳性的NPS中进行主要Bp抗原基因型别分析,西安市及周边地区Bp基冈型组合以ptxA1/ptxP1/prn1tim3-1/fhaB1为主.
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埃及2003年1月～2004年7月消灭脊髓灰质炎的进展
从1988年至今,世界范围内脊髓灰质炎(脊灰)野病毒流行国家减少了99%以上,3个世界卫生组织(WHO)区(美洲区、欧洲区和西太平洋区)已证实为无脊灰区.WHO东地中海区消灭脊灰也取得了实质性进展,目前在22个国家中,有18个国家已达到无脊灰,只有3个国家(阿富汗、埃及、巴基斯坦)仍有脊灰流行.近苏丹发现了1例由输入Ⅰ型脊灰野病毒引起的病例,通过基因测序发现该病毒与尼日利亚流行的病毒有关.
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盆腔炎患者感染大肠埃希菌中重组质粒pGEX-SrtA△N59的构建及测序分析
目的 构建盆腔炎患者感染大肠埃希菌重组质粒pGEX-SrtA△N59并进行测序鉴定,为寻找盆腔炎患者感染大肠埃希菌的治疗新方法和新药研发奠定基础. 方法 分别提取pMD20-SrtA和pGEX-4T-1质粒并进行鉴定.然后根据SrtA基因序列来设计特异性引物,以pMD20-SrtA为模板进行SrtA△N59基因PCR扩增.将目的片段克隆至pGEX-4T-1中,构建pGEX-SrtA△N59重组质粒,进行酶切和测序分析. 结果 pMD20-SrtA酶切目的基因片段约为618 bp,与预期SrtA基因片段大小相符合,可作为模板扩增SrtA△N59.pGEX-4T-1经单、双酶切均获得5 000 bp片段,大小与预期值(4 900 bp)相符合,该质粒可应用于构建重组质粒.PCR扩增产物约460 bp,与SrtA△N59基因的大小符合.构建的pGEX-SrtA△N59重组质粒经双酶切,获得460 bp目的基因片段,表明SrtA△N59基因成功插到载体pGEX-4T-1中;基因测序显示,其与AF162687基因序列100％匹配.SrtA△N59基因大小应为441 bp,但本实验设计引物时在其两端分别加有酶切位点以及保护性基团,所以所得扩增产物的目的片段大小约为460 bp. 结论 构建的pGEX-SrtA△N59中成功插入SrtA基因,重组质粒构建正确.
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长春地区出入境人员感染丙型肝炎病毒的基因分型研究
目的 研究长春地区出入境人员感染丙型肝炎病毒(HCV)的基因型分布. 方法 收集42例丙型肝炎阳性者的血清标本,采用基因测序法进行HCV基因型检测和分析. 结果 42份HCV阳性血清基因分型分别为1b、1a、 2a,其中基因1型21份(占50％),1b亚型13份(占30.95％),1a亚型8份,2a亚型9份.HCV基因型性别、年龄分布差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 长春地区出入境人员感染的HCV以1b型为主,2a型次之.
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骨科患者术后创面感染鲍曼不动杆菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性分析
目的 了解医院骨科患者手术后创面感染的鲍曼不动杆菌的耐药情况,以指导医生合理用药,有效控制鲍曼不动杆菌耐药性的进一步发展,预防和减少医院感染的发生. 方法 从骨科患者手术后创面感染标本分离鲍曼不动杆菌28株,作gyrA基因测序,并进行BLASTn比对;通过测定小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)进行药敏试验,测定鲍曼不动杆菌的耐药性;选取经纯培养的鲍曼不动杆菌菌落置入含蛋白酶K溶液的离心管内,分别进行水浴,再离心,留取上清液,以此为模板PCR扩增与喹诺酮类抗菌药物耐药性相关的gyrA、qepA、qnrS、qnrA、qnrB和aac(6)-Ib基因,使用Chromas分析软件进行测序. 结果 鲍曼不动杆菌对诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、司帕沙星、左氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星的耐药率分别为:96.43％、96.43％、96.43％、89.29％、85.71％、85.71％、82.14％、78.57％和78.57％.PCR检测28株鲍曼不动杆菌gyrA基因100％阳性,即都发生了gyrA基因突变,而其他相关基因检测均阴性.基因测序看出,其83位发生突变,即由TCA转变为TTA. 结论 本组分离骨科患者手术创面感染的鲍曼不动杆菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况严重,其中对诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星等的耐药率均在90％以上.临床抗感染治疗应根据耐药结果进行用药,并控制喹诺酮类抗菌药物的使用.
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发热与SARS
严重急性呼吸综合征(SARS)流行面广、病死率高,在WHO带领下,各国科学家奋力攻关,在病原确定、基因测序、蛋白质组、重症治疗、早期诊断实验技术、流行病学研究等方面均有了喜人的突破,但对新传染病的病原学特性尚未完全认识,免疫预防还没有疫苗,诸多的流行规律需要时间去摸索和研究,在SARS特异性抗原抗体系列诊断技术形成之前,探讨分析发热与SARS的关系很有必要.
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Bx02等位基因的鉴定及家系遗传分析
目的:对ABO正反定型不符的疑难标本进行血型鉴定,并对其家系的ABO基因的分子生物学特点进行探讨.方法:采用PCR-SSP对血清学方法定型为B亚型的先证者及其家系共5份样本做基因分型,并对其ABO血型基因第6、7外显子扩增后进行直接测序及单倍型测序,分析后确定其基因型.结果:该家系中3份标本ABO基因序列与ABO* B101相比,在第905位碱基发生了A＞G的突变.结合血清型学表现,先证者ABO基因型可定为Bx02/0102.结论:采用DNA序列分析法可以对ABO血型血清学正反定型不符的标本进行验证,并能阐述ABO血型正反定型不符或弱表达现象的分子基础.
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精准医学第二期高端沙龙在上海举办
8月18日，“高通量测序+大数据应用”的基因测序行业引爆点--精准医学第二期高端沙龙在上海举办。
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精准医学高端沙龙在京举办
7月8日，我会在北京举办了以“高通量测序+大数据应用的基因测序行业引爆点”为主题的精准医学高端沙龙（第一期）。来自中科院、医科院等业内专家，博奥医学检验、诺禾致源等业内企业，博泽资产、鼎辉创投等投资机构和戴尔等 IT企业代表，共计40余家企业和研究机构的60余人参加了本次沙龙。
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个体化医学的经济学价值及其发展策略
个体化医学（personalized medicine）是近年来提出的新概念，它强调基于个体情况给予适宜的治疗方案，目前在肿瘤诊断与治疗领域中开展的靶向治疗（targeted therapy）、基因诊断与治疗（gene diagnosis and therapy）都是个体化医学理念在临床实践中的应用。事实上，对于同一种疾病，医生往往按照经验处方用药与治疗。但已有的研究发现，患者对于药物疗效以及毒性反应均存在个体差异，而这些差异很可能决定治疗成败。通过基因检测，可以识别和筛选出易感基因亚组群或对某种治疗可能有良好反应的亚组人群，有针对性地进行预防治疗，达到预防疾病发生、提高疗效、降低毒副作用、延长生存时间、以及提高生活质量等一系列效果。随着科技不断发展进步，人类基因测序变得越来越价廉和便捷，以靶向治疗和药物基因组学（pharmacogenomics）为典型代表的个体化医学具有巨大的发展潜力。本文将重点阐述个体化医学的经济学价值，并探讨个体化医学面临的主要挑战及未来发展，为深化人们对个体化医学的认识提供参考。
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基因科学研究动态
2011 年,基因科学研究不断向前发展,笔者仅就和医学有关的基因测序,新基因和新功能的发现,基因的应用研究等加以总结,供读者参考.1 基因测序方面美国科学家首次绘制出了人体胚胎干细胞内一个名为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的修饰因子的全基因图谱.5hmC在一些被打开或激活的基因内出现的频率非常高,新研究将有助于癌症的控制.研究论文发表在美国<基因组生物学>杂志上.
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二代基因测序在临床病理中的应用专题论坛在承德顺利召开
为了探索二代基因测序（ NGS）在病理诊断中的运用，并加强各地区的交流，由《中华病理学杂志》编辑委员会主办，南京世和基因生物技术有限公司承办的“NGS在临床病理中的应用专题论坛”于2016年8月6日在承德市隆重召开。来自全国各地的近百位专家同仁参加了会议。
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超广谱β-内酰胺酶TEM和SHV型全长基因PCR直接测序
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)TEM和SHV型是常见的基因型,并且呈全球性分布.TEM和SHV的衍生型不断出现.TEM和SHV型全长基因测序对亚型的区别、新亚型的确认和各衍生型的基因进化树分析以及分子流行病学研究具有重要意义.本文介绍TEM和SHV型全长基因PCR直接测序方法.
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2008-2009年肠道病毒71型贵州省分离株的基因特征分析
肠道病毒71型(EV71)感染主要引起手足口病,近年来,EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势,其中令人关注的就是EV71的流行引起患儿的神经症状甚至死亡.贵州省自该病纳入法定传染病管理以来发现2009年感染EV71的患儿及重症病例比2008年多,同时在2009年初实验室诊断因EV71感染引起了患儿死亡,疫情也比2008年开始的早,我们对2008-2009年的手足口病临床标本进行了实验室诊断,并进行了基因测序及特征分析,以期发现是否发生了抗原漂移,分析引起重症的EV71毒株是否与核苷酸序列有相关性,现将结果报告如下.
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心脑血管病患者P2Y1基因多态性与阿司匹林抵抗的相关性
目的 研究ADP受体P2Y1基因多态性与阿司匹林抵抗(aspirin resistance AR)是否存在相关性.方法 选取2010年10月至2012年3月上海交通大学附属第六人民医院急诊科急诊内科和心内科病房住院患者中40岁以上冠心病、高血压、脑梗死后合并或不合并2型糖尿病患者330例.入院后,进行详细病史采集、查体、及测定相关血液指标.服用阿司匹林(100 mg/d)至少7d后次日晨,抽取肘静脉血2管,光学法分别测定花生四烯酸(arachidonic acid,AA)及二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)诱导的血小板聚集率,根据血小板聚集率,确定患者为AR或阿司匹林敏感(aspirin sensitive,AS).另一管置-80℃冰箱待集中后通过PCR扩增直接测序法检测P2Y1基因893及1622位点多态性.结果 AR者95例,发生率为28.79％；AS者235例,发生率为71.21％；基因测序结果相关性分析发现P2Y1基因的893C＞T变异与AR发生率增加有关OR=3.16 (95％CI1.36～7.16).与AS组临床资料相比AR组在以下3个方面差异具有统计学意义(P ＜0.05):AR组年龄大、糖尿病发生率高、HDL水平低,进一步使用从包括年龄、2型糖尿病、高血压等在内的各种可能的危险因素中通过Logistic回归分析筛选发现,2型糖尿病、高血压病和低HDL水平是发生AR的独立危险因素.结论 P2Y1基因的893C＞T变异与AR相关.年龄大,合并2型糖尿病,血HDL水平低者更易发生AR；合并2型糖尿病或高血压病,低HDL水平是发生AR的独立危险因素.
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广东韶关地区异常血红蛋白的分子流行病学调查
目的：调查广东韶关地区异常血红蛋白（hemoglobin， Hb）的分子流行病学特点。方法对2011年11月至2012年5月来我院就诊的9731例调查对象进行血细胞分析和Hb电泳筛查，对电泳异常标本进行基因测序。结果共发现45例异常Hb患者，发生率为0．46％，其中E区带7例，G/D区带9例，J区带7例，K区带6例，Q区带16例。基因测序结果显示，α珠蛋白基因变异25例，基因频率为1．285×10-3，β珠蛋白基因变异20例，基因频率为1．028×10-3；发现9种异常Hb类型，包括Hb Q-Thailand 16例，HbE 7例，Hb G-Chinese 6例，Hb New York 6例，Hb G-Coushatta 3例，Hb J-Bangkok 3例，Hb J-Broussais 2例， Hb Ottawa 1例，Hb G-Taipei 1例。结论韶关地区的异常Hb的发生率高于全国平均水平，异常Hb的基因类型及分布体现出客家人群特有的南方人群和北方人群交汇融合的特点。
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血液学检验技术在血液肿瘤诊治中的应用及展望
血液学检验技术从早期经典的细胞形态学及细胞化学染色方法,到后来的组织病理学检验和免疫学分析,再到细胞遗传学及分子遗传学分析、分子生物学分析,进而对血液肿瘤的认识从细胞形态上升到遗传和基因水平,对血液肿瘤的类型也有了更准确和更细致的划分. 随着科学技术的发展,新的检测技术不断涌现,不同的检测技术适用于不同血液肿瘤的诊治,而多种技术联合检测也能够提高诊断血液肿瘤的准确性,为临床提供可靠的实验依据,对血液肿瘤患者的诊治和预后评估有着重要意义.
