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大肠杆菌生物合成中心代谢途径的改造及其对工程菌色氨酸产量的影响
目的 改造大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,以进一步提高色氨酸产量.方法 根据ppsA和tktA基因序列分别合成引物行PCR扩增,将PCR扩增所得PLacO1-tktA-T1片段和pZA31质粒连接,经筛选鉴定正确的pZA31-tktA重组质粒和PCR扩增所得PLacO1-ppsA-T1片段连接,构建pZA31-ppsA-tktA重组质粒,并进行测序鉴定.将鉴定正确的pZA31-ppsA-tktA和pZE12-arofbr-trpEDfor重组质粒共转化至E.coli MGl655ART-R,获得的重组菌株命名为E.coli MG1655△RT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfbr](工程茵);以pZEl2-aroGfbr-trpEDfbr重组质粒转化至E.coli MGl655ART-R得到的重组菌株E.coli MG1655△RT-R[pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]作为对照菌株,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,3 h后收集部分菌体行ppsA、tktA酶活性测定,其余发酵液继续培养4-5h后,监测调整培养基中葡萄糖浓度和pH值保持不变,48 h后检测色氨酸产量.结果 PCR扩增所得片段均与预期DNA表达片段大小一致;pZA31-ppsA-tktA重组质粒测序显示,克隆的tktA和ppsA基因序列与报告序列完全相同.工程菌ppsA和tktA酶活性(U)与对照菌株比较,分别提高了3和3.5倍(分别为0.25±0.04 vs.0.08±0.02,P<0.05:0.21±0.03 vs.0.06±0.02,P<0.05);色氨酸产量(g/L)与对照菌株比较,提高了13倍(1.10±0.05 vs.0.80±0.05,P<0.05).结论 成功改造了大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,进一步提高了色氨酸产量,为构建高产色氨酸基因工程菌打下了基础.
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色氨酰tRNA合成酶(TTS)的免疫调节作用
近年来,在自身免疫性疾病、移植排斥和抗肿瘤免疫中,免疫系统的过度激活和免疫耐受逐渐成为研究关注的热点.大量研究证实,吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)是催化色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶,其高表达在抑制T细胞免疫、诱导肿瘤免疫耐受中发挥重要的调节作用[1-2].研究显示,另一种色氨酸代谢酶——色氨酰tRNA合成酶(tryptophanyl-tRNA synthetase,TTS,TrpRS)能够催化色氨酸与其对应的tRNA结合,增加细胞内色氨酰tRNA储备,对抗IDO介导的色氨酸消耗,参与机体的免疫调节过程,与多种自身免疫性疾病及恶性肿瘤的发生、发展和预后密切相关,但其具体的调控机制尚未完全阐明.现就TTS参与的色氨酸代谢过程及其免疫调节作用作一综述.
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慢性运动性中枢疲劳大鼠血清色氨酸与亮氨酸的测定价值
目的：通过对于慢性运动性中枢疲劳模型大鼠血清色氨酸及亮氨酸含量测定，探讨色氨酸及支链氨基酸在慢性运动性中枢疲劳调控机制方面的变化规律。方法建立大鼠慢性运动性中枢疲劳模型；应用高效液相色谱-质谱的研究方法对大鼠血清色氨酸及亮氨酸进行测定。结果与正常饲养大鼠比较发现，奔跑条件下运动性中枢疲劳大鼠血清中色氨酸水平明显降低，差异有显著性（ P <0.05）；亮氨酸的水平无统计学差异（ P >0.05）；亮氨酸/色氨酸明显升高，差异有显著性（ P <0.05）。结论慢性运动性中枢疲劳时大鼠血中色氨酸表现为明显下降的趋势，支链氨基酸亮氨酸与其比值明显升高可能进一步抑制其进入中枢，调控中枢性疲劳的发生和发展，该变化可能是机体为适应慢性运动性中枢疲劳状态的一种自我调控反应。
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孪生姐妹同患烟酸缺乏病
烟酸缺乏病(糙皮病)是多种因素引起烟酸及其前体色氨酸缺乏而发生的一种代谢性疾病,儿童期发病而病因尚不明者较为少见.本文报告2例12岁孪生姐妹同患烟酸缺乏病,结合有关文献对其发病特点作出分析.
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液相色谱-质谱联用技术同时定量检测结核病患者中多种色氨酸代谢产物及其临床意义
目的建立液相色谱-质谱联用（ LC-MS）同时测定血清中色氨酸及其代谢产物---犬尿氨酸、喹啉酸、吡啶酸、邻氨基苯甲酸浓度的定量的方法，并探讨结核分枝杆菌感染的患者体内色氨酸代谢的变化及其与机体免疫之间的关系。方法先利用标准化合物摸索测定条件并建立标准化合物浓度与峰面积的线性关系，再对100例健康体检者和104例结核病患者血清进行色氨酸、犬尿氨酸、吡啶酸、喹啉酸、邻氨基苯甲酸定量检测，并通过犬尿氨酸/色氨酸比值来评估代谢过程中的酶活性。结果色氨酸及其代谢产物的血清浓度和性别、年龄因素均无明显相关性。结核病患者组色氨酸浓度为（41.810±16.539）μmol/L，显著低于健康对照组[（47.898±10.821）μmol/L，P＜0.01]。结核病患者血清犬尿氨酸浓度为（2.341±0.934）μmol/L，显著高于健康组（1.699±0.352）μmol/L；结核病患者血清的喹啉酸含量为（9.141±8.747）μmol/L，较对照组（2.364±1.369）μmol/L显著上升（P＜0.01）；与健康对照组吡啶酸[（0.121±0.070）μmol/L]和邻氨基苯甲酸[（0.147±0.023）μmol/L]相比，结核病患者组血清吡啶酸、邻氨基苯甲酸浓度并没有明显变化；结核病患者犬尿氨酸/色氨酸比值为（6.28±3.36）％，相比健康人[（3.65±0.83）％]有显著提高（P ＜0.01）。结论体内色氨酸-犬尿氨酸途径代谢活性的显著增强和结核分枝杆菌的感染有关，并且结核感染还造成色氨酸下游代谢产物犬尿氨酸、喹啉酸的蓄积现象，由此可能影响结核病患者机体的免疫功能。
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氨基酸分析仪测定血清中犬尿氨酸和色氨酸的应用价值
Trp是机体必需的氨基酸之一,Kyn是Trp为重要的中间代谢产物之一.研究发现,Kyn代谢异常与多种疾病,包括抑郁症、帕金森综合征等神经精神疾病、免疫失调、异常妊娠等的发生和发展密切相关~[1-2].血液和组织液中Trp和Kyn的检测将为这些疾病诊断治疗、病情监测及发生机制研究提供有效的试验支持~[3].目前尚鲜见用氨基酸自动分析仪检测Kyn的报道,这可能与氨基酸自动分析仪标准分析程序~[4]不能将Kyn和Trp分开有关.本研究通过改进日立L-8800型氨基酸自动分析仪缓冲液洗脱程序,建立同时测定人血清中Kyn和Trp的检测方法.
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高效液相色谱-荧光法测定血清犬尿喹啉酸和色氨酸方法的建立
目的 建立同时检测血清犬尿喹啉酸(kynurenic acid,KYNA)和色氨酸(tryptophan,Trp)的高效液相色谱-荧光法.方法 采用高效液相色谱在线衍生技术,通过对佳检测波长、流速、流动相中醋酸锌浓度和乙腈比例等因素的探讨,得出测定Trp和KYNA的优实验方案,并对其进行方法学评价;测定50名正常人血清KYNA和Trp含量.结果 KYNA保留时间约为8.1 min,线性范围为1.05～2 093 nmol/L,低检出浓度为0.05 nmol/L,平均回收率为101.19%;Trp保留时间约为11.3 min,线性范围为0.49～196 μmol/L,低检出浓度为0.001 μmol/L,平均回收率为104.43%,二者日内、日间测定的变异系数均小于5%,苯丙氨酸、酪氨酸、5-羟色胺和犬尿氨酸等物质对该法均无干扰.健康成人血清KYNA和Trp含量分别为(24.25±9.11)nmol/L和(49.05±11.67)μmol/L.结论 建立的方法简便、快速、稳定、可行,适用于临床和科研工作.
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健康国人血清犬尿氨酸和犬尿氨酸/色氨酸含量比值参考值范围的建立
目的 建立我国正常人血清犬尿氨酸(KYN)及犬尿氨酸/色氨酸含量(KT)比值参考值范围.方法 采用高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)检测86名健康成人血清KYN和色氨酸 (TRP)含量,并计算KT比值.结果 正常成人血清KYN为0.364～3.022 μmol/L,平均(1.426±0.542) μmol/L, KT比值为11.008～47.528 mmol·L-1·M-1,平均(29.271±9.315) mmol·L-1·M-1.不同年龄组之间,血清KYN、TRP含量及KT比值差异均无统计学意义(P＞0.05);性别之间,血清KYN、TRP含量及KT比值差异均有统计学意义(P＜0.05) .结论 建立了健康国人KYN及KT比值参考范围,为相关疾病的辅助诊断、疗效观测及发病机制等研究提供相应参数.
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HPLC-UV检测法同时测定血浆色氨酸和犬尿氨酸的方法学研究
目的 建立一种同时测定血浆中Trp和Kyn浓度的HPLC-UV检测法.方法 以3-硝基酪氨酸(3-N-Tyr)为内标,采用Agilent Hypersil ODS色谱柱进行分离.流动相中醋酸缓冲液( 15 mmol/L,pH 5.5):乙腈为94∶ 6(v/v)；流速为0.8 ml/min；柱温:25℃；紫外程序化检测波长:0～4 min,360 nm；4～5 min,302 nm.选取2010年9-12月重庆市九龙坡区第一人民医院15例慢性乙型肝炎患者、8例慢性肾炎患者、10例血小板减少性紫癜患者以及15名健康体检者,用该方法检测其血浆Trp、Kyn水平并计算Kyn/Tp比值；各指标在上述4组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK法.结果 Kyn与Trp的保留时间分别为2.9 min和4.4 min,线性范围分别为0.44～18.30μmol/L和3.67～470.00 μmol/L,检测限分别为0.014 μmol/L和0.122 μmol/L.Kyn与Trp的日内变异均小于3％,日间变异均小于4％.平均回收率均在92.29％～104.40％之间.用该方法测定临床标本,健康对照组、慢性肾炎组、血小板减少性紫癜组以及慢性乙型肝炎组血浆中Kyn浓度分别为(1.59±0.28)、(2.73±0.56)、(2.69±0.44)和(1.54±0.48) μmol/L,Trp浓度分别为(59.8±10.0)、(46.1±11.7)、(58.5±8.0)和(41.4±13.1)μmol/L,Kyn/Trp比值分别为(0.027 4±0.007 5)、(0.061 6±0.0165)、(0.0467±0.0091)和(0.038 3±0.007 5),差异均有统计学意义(F值分别为23.734,8.463和20.921,P均＜0.01).结论 所建立HPLC-UV检测法可同时测定血浆中Kyn和Trp浓度,适合于临床检测.
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高效液相色谱法在类风湿关节炎患者血清TRP和KYN检测中的应用与临床价值
目的 探讨高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FLD)同时测定血清色氨酸(TRP)和犬尿氨酸(KYN)对诊断类风湿关节炎(RA)的临床意义.方法 血清标本加等量5%(V/V)高氯酸溶液去除蛋白,离心取上清液20 μl,直接进样分析.色谱柱为HpemilC_8柱(300 mm×6.0 mm i.d,10 μm);流动相为0.25 mol/L醋酸锌和50 mmol/L醋酸溶液(含3%乙腈),流速为1.5 ml/min;0～10 min荧光检测器的激发波长和发射波长分别为365 nm和480 nm,10 min后激发波长和发射波长分别变换为254 nm和404 nm.同时,用该方法测定120名健康成人和110例RA患者血清TRP、KYN和TRP/KYN比值(K/T),并评价其诊断RA的敏感度、特异度和方法学效能.结果 血清标本的KYN和TRP保留时间分别为8.1和11.5 min,两者分离良好.KYN线性范围为0.098 ～19.600 μmol/L,低检测浓度为0.04 μmol/L;回收率为90.8%～96.2%,日内变异系数为3.68%,日间变异率为4.97%.TRP的线性范围为4.9～196.0μmol/L.低检测限为0.005 μmol/L,回收率为92.6～106.9%,13内变异系数为3.63%,日间变异系数为4.44%.在本试验的色谱条件下测定苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、犬尿喹啉酸(KYNA)、5-羟色胺(5-HT)和Cr均无干扰.RA组患者血清KYN含量和K/T比值[(2.06±0.38) μmol/L和(55.46±5.81)×10~(-3)]与健康对照组[(1.51±0.35)μmol/L和(32.54 ±9.00)×~(-3)]比较,均显著升高(U=3 251.0,t=10 741,P均为0.000),而RA组TRP含量[(38.24±5.27)μmol/L]与健康对照组[(47.52±5.79)μmol/L]比较,则显著降低(t=10.399,P=0.000).K/T比值诊断RA的敏感度、特异度分别为83.6%(92/110)、85.8%(103/120).结论 HPLC-FLD同时测定血清TRP和KYN的方法精密度、回收率、抗干扰能力、线性范围等均符合临床检测要求.K/T比值可作为RA的辅助性诊断指标.
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乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达
目的:为进一步探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的功能,在真核生物酵母细胞中表达X基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法以HBV ayw亚型全序质粒pCP10为模板扩增X基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoRI和PstI双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBKT-7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析,以明确HBxAg是否在其中表达.结果:成功地扩增出HBx基因,测序鉴定符合Gene Bank报告序列;酶切回收的HBx基因成功地克隆入酵母表达载体pGBKT-7并转化入酵母细胞AH109中,Western免疫印迹显示X基因在酵母细胞中表达,表达产物在胞内存在,相对Mr为35000左右结论:成功地构建了HBxAg在酵母表达载体,并在酵母细胞中表达
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春之馈赠——雨后春笋
吃过竹笋的人都会对其鲜美的味道记忆深刻.竹笋一年四季皆有,但惟有春笋、冬笋味道佳.烹调时无论是凉拌、煎炒还是熬汤,均鲜嫩清香,是人们喜欢的佳肴之一.竹笋的营养价值竹笋除了富含膳食纤维外,还含有蛋白质、碳水化合物、维生素和多种矿物质元素,因此有"素食第一品"之称.其中蛋白质的氨基酸种类丰富,除了缺乏色氨酸外,囊括了其他的必需氨基酸,在常见的蔬菜中蛋白质质量较高.另外,竹笋中含有维生素和矿物质元素,有助于增强机体的免疫能力,提高防病抗病能力.
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色氨酸2,3-双加氧酶在色氨酸分解代谢及免疫调节中的作用
色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)是催化色氨酸由犬尿氨酸(Kyn)途径分解代谢的限速酶.TDO主要在肝内降解色氨酸,调整体内色氨酸水平,能够抑制T细胞增殖,参与抗菌及炎性反应.代谢产物Kyn为芳烃受体(AhR)的内源性配体,TDO-Kyn-AhR通路具有调节肿瘤生长作用.随着对TDO介导色氨酸代谢免疫机制研究的不断积累,其在肿瘤治疗及移植免受耐受领域的应用前景令人期待.本文就TDO介导的色氨酸分解代谢及免疫调节作用进行综述.
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IDO与胆囊癌的免疫耐受
吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)是色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶,其高表达是导致肿瘤免疫耐受的原因之一,直接影响树突状细胞(DC)疫苗的肿瘤治疗效果.脂多糖和细胞凶子等物质可调节IDO的表达.IDO通过3种机制参与肿瘤局部免疫耐受.对IDO的这种免疫调节机制的深入研究将在胆囊癌等肿瘤治疗方面具有重大意义.
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吲哚胺-2,3-双加氧酶介导的色氨酸代谢在器官移植中的作用
色氨酸是细胞生长代谢的必需氨基酸,吲哚胺-2,3-双加氧酶是催化色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶.吲哚胺-2,3-双加氧酶主要通过降解局部微环境中色氨酸,造成色氨酸缺乏,抑制T细胞增生与活化.吲哚胺-2,3-双加氧酶介导的色氨酸代谢中问产物犬尿素、3-羟基犬尿氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸能抑制同种异体T细胞增生.吲哚胺-2,3-双加氧酶树突状细胞与Treg细胞协同作用可能促进免疫耐受的形成.虽然吲哚胺-2,3-双加氧酶介导的色氨酸代谢在移植免疫调节过程中的作用还不甚清楚,但大量的研究表明其诱导移植免疫耐受的应用前景广阔.
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芳香烃受体在色氨酸代谢调节免疫中的作用
芳香烃受体(AhR)是一种配体依赖性胞内受体,配体种类多样,根据来源可分为外源性和内源性配体.不同配体结合并激活AhR,可使AhR转位至核上,调节下游基因如细胞色素P450家族基因CYP1转录活动,在介导病理过程和维持机体正常发育与生理功能中发挥着重要作用.色氨酸(Trp)代谢产物是一类主要的内源性配体.犬尿氨酸(Kyn)作为Trp代谢的主要产物,与AhR相互作用后可影响免疫细胞分化与活性,调节机体适应性免疫应答,发挥抑制抗肿瘤免疫的作用.近年来Kyn在移植免疫中的作用也越来越引人瞩目.本文将对AhR在Trp代谢调节免疫中作用的研究进展进行综述.
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慢性疲劳综合征的辨证治疗体会
慢性疲劳综合征简称CFS,是以持续疲劳,失眠,思维不能集中以及身痛发热等全身衰弱疲劳为特征的疾病[1].现代医学认为:CFS是因病毒感染、色氨酸代谢异常而引起的一系列症状,但目前尚无特别有效的治疗方法[2].
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1-甲基色氨酸与5-氟尿嘧啶联合干预对荷胃癌小鼠髓源性抑制细胞的影响
目的 研究1-甲基色氨酸(1-methyl tryptophan,1-MT)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对荷胃癌小鼠髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)的影响.方法 将稳定转染IDO-pcDNA3.1(+)质粒和空质粒以及未转染的小鼠前胃癌细胞种植于小鼠皮下,建立荷胃癌移植瘤小鼠模型,分别给予生理盐水、1-MT、5-FU和1-MT+ 5-FU治疗.取小鼠脾脏及肿瘤组织,用流式细胞术和免疫荧光法检测组织中MDSC的数量.结果 (1)移植瘤中有MDSC的表达.(2)胃癌小鼠体内MDSC(49.8％±1.1％)较正常小鼠(1.2％±0.3％)明显增加(P＜0.05).(3)与正常小鼠相比,联合用药组MDSC(18.5％±0.5％)的数量明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 1-MT与5-FU联合应用使荷胃癌移植瘤小鼠脾脏及肿瘤部位的MDSC数量减少,改善肿瘤微环境.
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免疫调节剂在维持肠黏膜屏障稳态中的作用及意义
近年来,越来越多的证据显示,免疫调节剂以及益生菌等能够通过提供某些特殊营养素来调控应激状态下机体的代谢过程、炎症介质的产生和释放、增强免疫应答能力、维持肠黏膜屏障稳态.其中,免疫调节剂包括氨基酸类(谷氨酸、精氨酸、色氨酸、瓜氨酸)、脂肪酸类(短链脂肪酸和ω-3脂肪酸及共轭亚油酸)以及益生菌类(双歧杆菌、酵母菌、乳酸杆菌).阐释清楚这一系列物质对肠黏膜屏障稳态调控的靶点及机制,将为研究肠道疾病的诊疗提供理论依据,使临床营养理念得以拓展和提升.
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氨基酸肠外营养支持对肺癌化疗患者血清褪黑素和色氨酸水平的影响
目的 探讨氨基酸肠外营养支持对中晚期非小细胞肺癌(NSCLC)化疗患者血清中褪黑素(MT)和色氨酸(Try)水平的影响.方法 将72例不能手术的中晚期NSCLC患者分为3组,统一采用NP方案(顺铂+去甲长春花碱)进行3个周期的化疗,A组和B组患者在化疗的同时分别给予250和500 ml/d的9-复合氨基酸(9AA)营养支持,C组仅行化疗.测定3组患者治疗前后血清MT和Try的浓度.结果 治疗后中午12:00时,A、B和C组患者血清MT分别为(3.3±2.7)、(5.4±5.2)和(3.0±3.1)pg/ml,夜间0:00时分别为(30.1±4.9)、(30.7±9.5)和(17.1±6.5)pg/ml.治疗后中午12:00时,A、B和C组患者血清Try分别为(31.3±16.6)、(38.3±17.3)和(20.7±12.5)pg/ml,夜间0:00时分别为(15.4±5.4)、(18.6±7.6)和(12.2±9.9)pg/ml.A、B组血清MT和Try浓度高于C组(P＜0.05),且500 ml/d氨基酸营养支持的B组高于250 ml/d氨基酸营养支持的A组(P＜0.05).结论 氨基酸肠外营养支持有利于纠正化疗后中晚期NSCLC患者血清MT和Try水平的低下,且500 ml/d的氨基酸肠外营养支持效果较为显著.
