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载体介导的RNAi对胰腺癌细胞交叉抑制的研究
国内外研究结果显示,以K-ras基因突变位点在内的mRNA片段作为靶序列设计的shRNA(短发卡RNA),能有效的抑制相应突变型K-ras基因的表达和细胞的增值,且不影响野生型K-ras基因的表达[1,2].
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2型重组腺相关病毒/增强型绿色荧光蛋白转染胰腺癌细胞PANC-1的体外研究
基因治疗的关键是目的基因的高效转染和表达.我们采用2型重组腺相关病毒(rAAV2/EGFP)对人胰腺癌细胞PANC-1进行体外基因转移,观察EGFP基因能否在PANC-1中有效表达及其细胞毒性,探讨rAAV2介导目的基因转导胰腺癌细胞的效率.
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辐射调控自杀基因的腺病毒载体在胰腺癌细胞中的表达
早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子可由电离辐射诱导,使得转导基因的表达可从时间与空间上进行调控[1],由此驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TK)在胰腺癌细胞中高效表达,提高杀伤胰腺癌细胞的效率,本研究旨在观察辐射调控下的自杀基因的腺病毒载体在胰腺癌细胞中的表达.
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全反式维甲酸对人胰腺癌细胞PC-3诱导分化作用及其对Survivin表达的影响
维甲酸类药物是一类细胞诱导分化剂,能够抑制多种肿瘤细胞的增殖,调节着细胞的生长和分化,全反式维甲酸(A-TRA)作为维甲酸类药物的代表,具有显著的抗肿瘤作用[1,2].我们用ATRA诱导人胰腺癌细胞PC-3,观察细胞周期的改变和Survivin基因表达的变化,以及ATRA对人胰腺癌细胞增殖的抑制作用,为维甲酸类药物临床应用于胰腺癌的治疗提供实验依据.
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SST2R与DPC4、p53、Ras基因在胰腺癌中表达的相关性研究
有研究结果表明,DPC4、Ras、p53突变基因是肿瘤血管形成的重要突变基因[1,2];人体胰腺癌细胞SST2R基因的表达变化与肿瘤血管形成密切有关的促血管生成因子如转化生长因子(TGF)-β有关[3].本研究旨在分析它们之间的相关性,探讨SST2R基因表达变化与胰腺肿瘤血管发生机制的关系.
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hTR反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞Panc-1生物特性及端粒酶活性的影响
端粒酶持续激活导致恶性肿瘤细胞获得无限增殖能力,人端粒酶RNA组分(hTR)对端粒酶活性维持具有重要作用,破坏端粒酶RNA组分的模板功能,即可抑制端粒酶活性[1].我们针对hTR模板区设计合成反义寡核苷酸(ASODN),观察其对Panc-1端粒酶活性及细胞生长的影响,为胰腺癌基因治疗提供新的实验依据.
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罗格列酮抑制胰腺癌细胞侵袭和转移的机制
目的 观察胰腺癌细胞是否存在过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)/第10 号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)/基质金属蛋白-9(MMP-9)信号通路,以及基因PTEN和MMP-9 的变化,探讨罗格列酮对胰腺癌细胞侵袭和转移的机制.方法 培养人胰腺导管上皮癌细胞(PANC-1),经40μmol/L PPARγ配体罗格列酮和10μmol/L抑制剂GW9662 处理24h后,用细胞的活力测定[四唑氮化合物(MTS)法]测胰腺癌细胞活力,用伤口愈合实验和基质胶(Matrigel)体外侵袭实验检测细胞的迁移能力,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞PTEN 和MMP-9 mRNA的相对表达.结果 罗格列酮对PANC-1胰腺癌细胞的增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性,明显抑制胰腺癌细胞侵袭和转移,增加(2.51±0.05)倍PTEN mRNA,减少(0.39±0.02)倍MMP-9 mRNA;而GW9662无此作用.结论 胰腺癌细胞可能存在PPARγ/PTEN/MMP-9信号通路,通过上调PTEN和下调MMP-9的表达,来抑制胰腺癌细胞的侵袭和转移.
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反义核苷酸抑制人高迁移率族蛋白1表达对胰腺癌细胞的影响
目的构建高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因的反义真核表达载体,寻找胰腺癌基因治疗新途径.方法应用分子克隆技术构建HMGB1基因反义真核表达载体pcDNA3.1/antisense-HMGB1,转染胰腺癌细胞株PANC-1,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)、噻唑蓝(MTT)比色法检测转染48 h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化.结果成功构建pcDNA3.1/antisense-HMGB1反义真核表达载体.所获反义表达载体pcDNA3.1/antisense-HMGB1转染可使PANC-1细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P＜0.01).反义pcDNA3.1/antisense-HMGB1的导入能有效抑制PANC-1增殖活性(P＜0.01).结论应用反义RNA技术阻断HMGB1基因的表达,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性,为基因治疗提供了新思路.
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三乙酰白藜芦醇对胰腺癌PANC-1细胞增殖及STAT3、NF-κB的影响
目的:研究三乙酰白藜芦醇(TRES)对胰腺癌Panc-1细胞增殖及STAT3、NF-κB的影响.方法:采用MTT法检测Panc-1细胞增殖活性,克隆形成、细胞划痕实验分别检测Panc-1细胞的分化和迁移侵袭能力,以及Western blot ting法检测STAT3和NF-κB的蛋白表达.结果:MTT实验结果表明TRES可以抑制Panc-1细胞的增殖.与对照组比较,克隆形成和细胞划痕实验显示TRES抑制了Panc-1细胞的分化和迁移侵袭能力(P＜0.05),Western blotting结果显示TRES下调了磷酸化的STAT3和NF-κB蛋白表达,表明TRES抑制了STAT3和NF-κB的活化.结论:TRES可以抑制Panc-1细胞增殖,可能具有抗肿瘤活性.
关键词： 白藜芦醇 三乙酰白藜芦醇 胰腺癌细胞 信号传导与转录激活因子 核转录因子-κB -
CD1D基因与B7-1基因共转染胰腺癌细胞及其抗癌作用的实验研究
目的 观察共转染小鼠B7-1和CD1D 基因对小鼠胰腺癌细胞的免疫应答.方法 将表达B7-1和CD1D 基因的逆转录病毒载体导入包装细胞系,然后转染入胰腺癌细胞.用PCR和Western方法鉴定细胞表达;用B7-1和CD1D 阳性的细胞在体内诱导抗肿瘤免疫反应.结果 B7-1和CD1D 阳性的细胞在同基因小鼠体内能诱导抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长.结论 B7-1基因和CD1D 基因共转染肿瘤细胞,能抑制肿瘤生长,可能为肿瘤的基因治疗开辟一条新途径.
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基因沉默整合素连接酶对胰腺癌细胞上皮向间质转化的影响
目的 研究基因沉默整合素连接酶(ILK)对胰腺癌细胞(Panc-1)上皮向间质转化(EMT)的影响.方法 对胰腺癌Panc-1细胞进行细胞培养,成功构建ILK-specific shRNA慢病毒载体后对Panc-1细胞进行转染,荧光显微镜下观察,评估转染效率,然后通过Q-PCR及Western blot方法验证干扰基因片段的有效性,应用Transwell方法比较转染前后各组胰腺癌细胞迁移、侵袭能力,再通过WB比较各组胰腺癌细胞上皮向间质转化(EMT)标志性蛋白E-cadherin表达情况.结果 siRNA-ILK慢病毒载体构建完成后对Panc-1细胞转染,通过荧光显微镜下观察可见感染效率达80％以上,RNAi靶点病毒感染的细胞组(KD)的ILK mRNA及蛋白表达明显低于空病毒组(NC)及正常细胞组(CON) (P＜0.01).siRNA慢病毒转染对Panc-1细胞迁移、侵袭实验结果显示基因沉默ILK后胰腺癌细胞的迁移能力、侵袭能力受到了明显的抑制,迁移侵袭的细胞数减少.其中KD组的迁移率比较NC组,具有明显的差异(P＜0.01),而KD组的侵袭率比较NC组也有显著的差异(P＜0.05)以NC组为阴性对照,以GAPDH为内参,采用Western blot检测NC、KD组细胞的E-cadherin蛋白表达情况.S实验结果表明siRNA慢病毒转染Panc-1细胞后KD组E-cadherin表达较NC组明显上调(P＜0.01).结论 基因沉默ILK的胰腺癌细胞(Panc-1)后,其迁移、侵袭能力受到明显的抑制,EMT标志性蛋白E-cadherin表达也明显上调,逆转了EMT的发生.
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Rip2诱导人胰腺癌细胞自噬及其机制研究
目的:研究受体相互作用蛋白2(Rip2)是否诱导人胰腺癌细胞株Panc-1发生自噬及其作用机制.方法:用jetPRIME转染试剂将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-Rip2分别转染入Panc-1细胞,不做处理的细胞为对照组.转染后培养细胞48 h,采用Western blot检测Rip2、自噬相关蛋白[beclin-1和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)]及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白的表达;透射电子显微镜观察自噬体的数量.结果:转染pEGFP-Rip2的细胞Rip2蛋白表达显著增加.与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-Rip2组细胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(均P<0.01);在透射电子显微镜下观察发现,pEGFP-Rip2组细胞内自噬体的数量明显多于对照组和pEGFP-C2组.pEGFP-Rip2组细胞的p-Akt和p-mTOR蛋白水平明显低于对照组和pEGFP-C2组(均P<0.01),而总Akt和mTOR的蛋白水平变化不明显.结论:过表达Rip2可诱导Panc-1细胞发生自噬,其作用机制可能与Rip2抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有关.
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垂体腺苷酸环化酶激活多肽对胰腺癌细胞的生长调控
1989年Miyata A.从绵羊下丘脑中提纯出一种含38个氨基酸残基的神经肽,此肽能激活大鼠脑垂体细胞的腺苷酸环化酶,故称之为垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary Adenylate Cyclase Activating Peptide,PACAP).相继又发现另一个C端被酰胺化的PACAP-27.1995年Falnokrug J.在产血管活性肠肽(VIP)肿瘤中发现了一种由PACAP前体衍生出的一个含29个氨基酸的多肽,称为PACAP相关肽(PACAPrelated peptide,PRP),迄今从PACAP前体己衍生出3种方式的多肽,即PACAP38.PACAP27及PRP.PACAP与VIP有68%的同源性,属于胰泌素/VIP肽类家族,PACAP有一个与VIP相似的血管舒张活性,但激活腺苷酸环化酶的作用比VIP大1000倍.
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高迁移率族蛋白框1反义核酸抑制人胰腺癌细胞系PCNA-1侵袭的研究
背景与目的:研究证明高迁移率族蛋白框1(high mobility group box 1, HMGB1)在大多数未成熟及恶性肿瘤细胞中高表达,它与细胞增殖、侵袭、转移有密切关系.我们前期的研究证明 HMGB1在胰腺癌组织中高表达并与肿瘤的侵袭及转移显著性相关.本研究的目的是观察 HMGB1反义核酸对胰腺癌 PCNA 1细胞体外侵袭能力的影响,并探讨其作用机制.方法:以脂质体介导方法将 HMGB1反义表达载体转染胰腺癌细胞株 PCNA 1,采用逆转录-聚合酶链反应 (RT PCR) 方法检测 HMGB1、基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinase 2, 9,MMP 2,MMP 9) mRNA的表达, Western blot法检测 HMGB1蛋白表达,明胶酶谱法( gelatin zymography)检测 MMP 2和 MMP 9活性的变化, Boyden小室法检测 PCNA 1的体外侵袭能力.结果: HMGB1反义核酸明显抑制 PCNA 1细胞 HMGB1 mRNA和蛋白的表达.转染后, MMP 2及 MMP 9 mRNA表达和酶活性亦受到显著抑制( P< 0.01).另外, HMGB1反义核酸的导入显著减弱了胰腺癌细胞的跨膜侵袭能力( P< 0.01).结论:HMGB1在胰腺癌侵袭转移中,阻断 HMGB1基因的表达,可能是阻抑胰腺癌转移的一种新策略.
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原花青素上调let-7a抑制胰腺癌AsPC-1细胞生长及迁移
目的 探讨原花青素是否通过上调let-7a表达而抑制胰腺癌细胞生长及迁移.方法 体外培养人胰腺癌AsPC-1细胞,原花青素处理细胞后,分别用MTT法、Annexin V-FITC/PI双染及Transwell迁移等实验检测细胞增殖率、细胞凋亡率及细胞迁移能力的改变;利用miRNA实时逆转录PCR检测细胞内let-7a表达变化.AsPC-1细胞转染let-7a mimics后,MTT法、Transwell迁移实验分别检测细胞增殖率及细胞迁移能力的改变.结果 与对照组相比,原花青素处理AsPC-1细胞后,细胞增殖率、细胞迁移能力随着原花青素浓度升高而下降,而细胞凋亡率随着药物浓度升高而逐渐升高.与对照组相比,原花青素处理细胞后, let-7a的表达升高.通过脂质体转染let-7a mimics后,细胞的增殖率及迁移能力均低于对照组,且let-7a mimics与原花青素共同作用后,细胞增殖及迁移明显低于let-7a mimics和原花青素单独作用组.结论 原花青素具有抑制胰腺癌细胞生长、迁移,及诱导细胞凋亡的作用.原花青素可能是通过上调let-7a表达,从而抑制胰腺癌细胞的生长及迁移.
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硝酸纤维素膜介质对鼻咽癌和胰腺癌细胞株的细胞相容性
目的 观察3株鼻咽癌细胞和1株胰腺癌细胞在硝酸纤维素膜材料表面的生长情况,探讨硝酸纤维素膜材料作为一种细胞生长支架材料用于鼻咽癌细胞和胰腺癌细胞培养的可行性.方法 将3株鼻咽癌细胞和1株胰腺癌细胞培养于硝酸纤维素膜上,HE染色并观察细胞生长情况;并且在扫描电镜下观察鼻咽癌细胞在此种膜上的贴壁情况、细胞生长形态,同时收集细胞培养液上清检测培养细胞LDH渗出量.利用免疫细胞化学染色检测膜上胰腺癌细胞表达CA199、CEA等肿瘤细胞标志物.结果 膜透明处理后,在光镜下可以观察到这4株细胞在硝酸纤维素膜表面较好地生长,膜能促进细胞黏附和生长;通过检测细胞的增殖状态和肿瘤细胞标志物的表达,发现细胞可呈集落状生长且增殖明显,细胞主要肿瘤标志物阳性表达.结论 硝酸纤维素膜不仅具有良好的生物相容性,能够有效地支持鼻咽癌和胰腺癌细胞在其表面的贴附和生长,同时还可以在其上面进行诸如形态学观察及细胞功能检测,有望作为一种新的组织培养介质和细胞贴附的支架材料加以应用.
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Novobiocin类化合物抑制胰腺癌细胞的2D-QSAR研究
目的 为Novobiocin类化合物建立一个有效的2D-QSAR模型来预测其抑制胰腺癌细胞(PL45)的活性,对抑制胰腺癌细胞(PL45)机理研究和发现高活性的Novobiocin类化合物提供参考和帮助.方法 采用密度泛函理论、分子力学和统计学相组合的方法,对23个具有抑制胰腺癌细胞(PL45)的Novobiocin类化合物进行了二维的定量构效关系(2D-QSAR)的研究.结果 所建立的2D-QSAR方程具有较好的回归性(R达到0.767).结论 Novobiocin类化合物分子的酰胺键的氧原子荷电量(QO1)对PL45的抑制活性起着关键的作用；同时,Novobiocin类化合物分子的R基团的大小,SR,也对PL45的抑制活性起着重要的作用.
关键词： 2D-QSAR Novobiocin类化合物 胰腺癌细胞 -
PTN shRNA腺病毒载体的构建及其对大鼠DRGn神经突起的影响
目的:构建特异性shRNA腺病毒载体,使之干扰神经轴突过度生长因子(PTN)在胰腺癌细胞中的表达,探讨其对SD大鼠背根神经节神经元(DRGn)神经轴突的影响.方法:设计并合成4对靶向PTN单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导转染胰腺癌细胞,通过RT-PCR方法筛选对PTN沉默效果佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒进行同源重组,筛选出正确重组子,用HEK293A细胞包装出表达shRNA-PTN的重组腺病毒并测定其病毒滴度,通过Western blot方法对腺病毒沉默PTN效果予以检测.shRNA-PTN腺病毒构建成功后感染胰腺癌PC-2细胞,然后和DRGn共培养,观察DRGn生长分化和形态特征.结果:测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从4对ds oligos筛选出对PTN沉默效果佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-PTN复制缺陷型重组腺病毒.转染胰腺癌细胞后,Western blot检测显示shRNA-PTN腺病毒感染胰腺癌细胞后对PTN蛋白的沉默效果7 d后达佳效果.感染shRNA-PTN腺病毒的胰腺癌PC-2细胞和DRGn共培养,DRGn神经轴突的生长和延长受抑制,以第7天为明显.结论:成功地构建介导shRNA-PTN复制缺陷型重组腺病毒;感染shRNA-PTN腺病毒的胰腺癌PC-2细胞和SD鼠DRGn共培养可以抑制DRGn神经轴突的生长.
关键词： 重组腺病毒 神经轴突过度生长因子 PTN 短发夹RNA 胰腺癌细胞 -
胆汁酸对人胰腺癌细胞的毒性作用
目的:通过研究人胆汁中胆汁酸对人胰腺癌PANC-1和MIA PaCa-2细胞株体外增殖和超微结构的影响,探讨胆汁酸对人胰腺癌细胞生长抑制作用.方法:选用人胰腺癌PANC-1和MIA PaCa-2细胞在不加或添加10 mL·L-1、20 mL·L、40 mL·L-1胆汁的RPMI-1640培养液中经过2,4,6,8 d培养后,用MTT方法测定胆汁对细胞增殖抑制率.PANC-1细胞培养24 h和48 h以后用扫描电镜和透射电镜观察细胞表面和内部超微结构变化.结果:PANC-1和MIA PaCa-2细胞在添加胆汁的培养液中增殖受明显抑制(P＜0.01),其对PANC-1的抑制率为(24.09±5.05)%-(89.61±2.28)%,对MIA PaCa-2的抑制率为(16.71±10.51)%-(78.55±6.59)%.PANC-1细胞在含胆汁培养液中培养后,细胞表面微绒毛变短变疏,细胞内线粒体、粗面内质网发生空泡变性.结论:胆汁中的胆酸对人胰腺癌细胞增殖有抑制作用,其抑制机制在于胆酸的细胞膜毒性作用.
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血管抑素对胰腺癌血管生成的抑制作用
目的 观察血管抑素在胰腺癌血管生成中的作用.方法 采用Lipofectamine 2000基因转染技术将真核表达载体pcDNA3.1(+)-angiostatin导入人胰腺癌PC-3细胞,筛选阳性克隆并扩大培养.PC-3细胞分为血管抑素转染组、空白对照组及脂质体对照组,分别检测各组血管抑素蛋白表达；利用显微镜下细胞计数法测定转染前后PC-3细胞的体外生长曲线；检测各组PC-3细胞培养上清所分泌的血管抑素对血管内皮细胞ECV-304增殖的影响.进一步建立种植瘤模型,通过CD34染色法检测Angiostatin对种植瘤中血管密度的影响.结果 Western blotting检测显示血管抑素转染组的PC-3细胞可分泌血管抑素,而空白对照组及脂质体对照组的PC-3细胞无血管抑素的分泌；细胞生长曲线显示,血管抑素转染组、空白对照组及脂质体对照组的细胞生长速度和倍增时间无明显差异；3组PC-3细胞上清液对内皮细胞ECV-304的生长有明显差异,血管抑素转染组的生长明显低于空白对照组及脂质体对照组.体内试验显示血管抑素转染组的种植瘤生长明显低于空白对照组及脂质体对照组.血管抑素转染组的种植瘤微血管密度(19.6±3.6)显著少于空白对照组(48.5±4.7)和脂质体对照组(51.1±5.4).结论 血管抑素可抑制血管内皮细胞的增殖,进一步产生抑制胰腺癌血管生成效应.
