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应用高效液相色谱-质谱法监测蛇胆陈皮片原料药的投料分析研究
目的 应用高效液相色谱-质谱法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS/MS)全面监测蛇胆陈皮片中原料药蛇胆汁和陈皮的投料情况,并可同时检测其中牛磺胆酸钠和橙皮苷的含量.方法 采用ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温40℃,流动相以乙腈-10mmol/L乙酸钠溶液,使用梯度洗脱程序,以HPLC分离有效成分、采用电喷雾离子源负离子模式检测,选择多反应离子监测方式进行原料药投料情况的定性监测及有效成分的定量分析.结果 牛磺胆酸钠和橙皮苷分别在0.242×10-2~1.45×10-2μg(r=0.9960),0.688×10-2~10.30×10-2μg(r=0.9992)范围内线性关系良好;精密度试验RSD分别为0.78%、1.56%;回收率分别为100.07%~108.7%,92.78%~99.32%;结论 高效液相色谱-质谱法快速简便、准确可靠、灵敏度高,适用于全面监测蛇胆陈皮片中蛇胆汁和陈皮的投料情况及质量.
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急性胰腺炎大鼠清胰汤治疗的肠动力作用机制
目的:从急性胰腺炎(AP)大鼠肠动力改变探中医中药急性胰腺炎治疗的以通为用思想的机制.方法:由胆总管逆行注射15 g/L牛磺胆酸钠0.5 mL诱导大鼠AP,以红霉素为对照,并设假手术组空白对照,给模型大鼠灌喂通下解毒的代表方清胰汤,分别观察各组小肠动力学、血清胃动素(Mot)、血清淀粉酶(AML)和胰腺组织病理改变指标.并用正交设计的方法,观察了清胰汤不同药物对离体豚鼠结肠平滑肌条张力的影响.结果:小肠推进比与AP组(0.21±0.08)相比较,清胰汤组(0.49±0.17)和红霉素组(0.30±0.10)明显提高(P＜0.01),AP组血清MOT(119±24 pg)明显低于对照组(169±52 pg,P＜0.05),清胰汤组(206±60pg)显著高于AP组(P＜0.01).清胰汤组的胰腺组织病理改变和血清AML显著改善.清胰汤各药对平滑肌有兴奋作用,对肌条张力影响的大小顺序是白芍、木香、延胡索和大黄.结论:小肠动力障碍是AP发展的重要病理过程,中医以通为用、通下解毒的清胰汤能改善AP大鼠的胃肠动力的同时,减轻了AP的病理损伤.
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血清IL-2、IL-10及肠黏膜Fas在重症急性胰腺炎大鼠中的动态变化
目的:探讨重症急性胰腺炎大鼠血清IL-2、IL-10、sFas及IL-2/IL-10动态变化以及Fas在肠黏膜的表达及意义.方法:将SD大鼠64只,随机分为对照组和胰腺炎组.经大鼠胰腺被膜下均匀注射50 g/L牛磺胆酸钠制作重症急性胰腺炎模型,对照组仅胰腺被膜下注射等量生理盐水.通过肠系膜上静脉取血测定血清IL-2、IL-10和sFas水平,并计算IL-2/IL-10比值.分别对胰腺损伤、肠损伤程度进行病理评分.免疫组化方法检测大鼠肠组织内Fas蛋白的表达水平.结果:0.5 h后血清IL-2水平胰腺组较对照组明显升高(3.53±0.62 ng/L vs 2.79±0.51 ng/L,4.35±1.11 ng/L vs 2.93±0.89 ng/L,6.94±1.55 ng/L vs 4.81±1.23 ng/L,4.80±1.10 ng/Lvs 3.41±0.72 ng/L,P＜0.01),并于6 h达到高点.胰腺炎组6 h后血清IL-10水平较对照组明显升高(494.98±11.23 ng/L vs 89.18±32.52ng/L,93.28±25.81 ng/L vs 77.15±22.60 ng/L,P＜0.01),12 h血清IL-10水平较6 h降低.胰腺炎组的IL-2/IL-10先降低后升高,0.5 h后即开始下降,6 h时达到低点然后开始升高,显著低于对照组(P＜0.01),12 h接近对照组.与对照组比较,胰腺炎组各时相胰腺及肠黏膜病理改变明显加重.免疫组化结果显示,在正常的肠黏膜未见明显表达.造模0.5 h后,大鼠肠组织内Fas表达增加,至12 h达高水平.结论:Fas参与胰腺炎肠损伤的病理过程,其机制可能与其介导的Th细胞凋亡有关.
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清胰解毒方对急性出血坏死性胰腺炎大鼠的治疗作用
目的:探讨清胰解毒方对急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)大鼠的治疗作用及可能机制.方法:34只SD大鼠随机分为AHNP模型组(AHNP,n=17)和AHNP+清胰解毒方疗组(QJF,n=17).模型制备采用胆胰管逆行注射牛磺胆酸钠.造模前12 h和造模后每隔12 h,AHNP组给予生理盐水,QJF组给予相应中药10 mL/kg体重灌胃.造模后4 d留取血清,测定淀粉酶(Amy)和C-反应蛋白(CRP)活性.取胰腺组织、肠组织作病理切片,进行组织损伤严重程度评分.通过ELISA法检测炎症递质肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6表达的变化.结果:QJF组大鼠血清Amy的表达(36 724±257.88nk/L)明显低于AHNP组(37 340.8±283.39nk/L)(P＜0.05);QJF组CRP活性(2±1.7 mg/L)显著低于AHNP组(3.56±2.7 mg/L)(P＜0.05);QJF组炎症递质IL-6的表达(19.22±2.24 mg/L)显著低于AHNP组(23.20±1.82 mg/L)和TNF-α的表达(11.57±5.85 mg/L)显著低于AHNP组(21.42±10.1 mg/L)(P＜0.05);病理组织学评分结果显示,QJF组胰腺组织坏死和炎性细胞浸润程度比AHNP组显著减轻(P＜0.05),胰腺组织水肿和出血程度两组无明显差异(P＞0.05);QJF组小肠和结肠组织的损伤比AHNP组显著减轻(P＜0.05).结论:QJF组可显著降低实验性大鼠胰腺损伤的严重程度,其可能机制与保护肠道屏障、减少细菌移位、下调炎症递质表达、阻断内毒素信号通路等有关.
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清胰汤对急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB p65表达的影响
急性胰腺炎(AP)为临床常见病,病情凶险,常引起全身炎症反应综合征(SIPS),并终导致多器官功能衰竭(MODS).目前具体发病机制尚不明确,治疗仍以对症支持为主.因而探求AP发病机制对寻找有效的治疗方法意义重大.本研究观察清胰汤对AP大鼠胰腺NF-κB p65表达的影响.一、材料与方法1.实验动物分组:54只SD大鼠由广东省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(粤)2008-0002,雌雄不限,体重(200±10)g.按完全随机法分成对照组、AP组、清胰汤组.采用逆行胰胆管注射3％牛磺胆酸钠的方法[1]建立AP模型.清胰汤组于建模后立刻予清胰汤1 ml/100 g体重灌胃,每12 h给药一次;对照组仅开腹翻动胰腺数次即关腹,以生理盐水替代灌胃.
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牛磺胆酸钠诱导的急性坏死性胰腺炎大鼠基因表达谱变化
基因芯片技术是高通量的差异基因表达研究手段.通过杂交后的生物信息学分析有助于全面了解复杂基因和信号转导通路在急性坏死性胰腺炎(ANP)中的作用.因此,利用全基因组表达谱方法分析ANP基因的变化较单个基因的研究具有理论上的优势.李磊等[1]曾报道,腹腔注射雨蛙肽诱导的急性水肿性胰腺炎(AEP)基因表达谱的变化,但尚未见类似临床重症急性胰腺炎(SAP)的ANP模型的胰腺组织基因表达谱的报道.故本实验观察ANP大鼠胰腺组织基因表达谱的变化.
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两种不同因素对胰腺腺泡细胞损害机制的研究
目的探讨蛙皮素和牛磺胆酸钠这两种不同因素对胰腺腺泡细胞的损害机制.方法采用一步消化法分离Wistar大鼠胰腺腺泡细胞,然后与不同浓度蛙皮素、牛磺胆酸钠共同孵育,采用台盼蓝法和双标法测定细胞活率、全自动生化仪测定淀粉酶浓度、比色法测定乳酸脱氢酶浓度、激光显微共聚焦法测定钙离子波动和浓度.结果蛙皮素处理后,腺泡细胞仍保持较高的活率,淀粉酶分泌率明显上升,同时乳酸脱氢酶漏出率增加,与淀粉酶分泌率之比约为4:1;而胆酸钠处理后细胞活率明显下降,淀粉酶分泌率明显升高的同时伴有乳酸脱氢酶漏出率也等比例的增加.蛙皮素可引起胰腺腺泡细胞内游离钙离子脉冲式升高,其波动方向由分泌极向基底极;牛磺胆酸钠引起细胞内钙离子持续低幅增高,细胞两极间未出现钙离子波动.结论蛙皮素及牛磺胆酸钠通过不同机制影响胰腺腺泡细胞的存活率,导致胰腺细胞损害.
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蛋白酶激活受体-2在重症急性胰腺炎中的作用
目的 探讨蛋白酶激活受体-2(PAR-2)在大鼠重症急性胰腺炎病理损害中发挥的作用.方法 由大鼠胰胆管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠,制作坏死性胰腺炎模型.36只大鼠被随机分为对照组、胰腺炎组、胰腺炎+皮下活化肽组(给药组),造模后3 h取材.免疫组化方法测定造模前后胰腺组织PAR-2表达情况变化;胰腺损害程度采用病理评分评价;测定胰腺组织湿/干重比、髓过氧化物酶含量,通过股静脉注射Evans blue(EB)测定EB漏出率;ELISIA方法测定血清IL-6水平.结果 正常胰腺组织胞浆及胞膜弱表达PAR-2,造模后表达升高.给药组病理评分、湿/干重比、髓过氧化物酶含量、Evans blue漏出率、血清IL-6水平明显低于胰腺炎组,胰腺病理评分与IL-6之间存在相关关系.结论 诱导重症急性胰腺炎后胰腺PAR-2表达升高,PAR-2可明显减轻胰腺炎症程度,对胰腺局部损害起保护作用.
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牛磺胆酸钠混合大肠杆菌逆行胰管注射法建立感染性坏死性胰腺炎大鼠模型
目的建立一个稳定可靠的感染性坏死性胰腺炎大鼠模型,为深入研究感染性坏死性胰腺炎的病理生理、病变转归以及探索新的治疗方法提供动物模型载体.方法46只SD大鼠随机分成5组:牛磺胆酸钠逆行胰管注射组、大肠杆菌逆行胰管注射组,牛磺胆酸钠混合不同浓度大肠杆菌(浓度分别为103个/ml、104个/ml和105个/ml,混合液为实验即时配制)逆行胰管注射组,注射量为0.1 ml/100 g体重,注射速度为0.2 ml/min.观察8 h,记录生存率;存活者8 h后活杀,抽血测定血清淀粉酶,并取胰腺组织行病理学检查和细菌培养.结果单纯牛磺胆酸钠逆行胰管注射能建立坏死性胰腺炎模型,其中胰腺组织细菌培养阳性率为12.5%(1/8);单纯大肠杆菌逆行胰管注射不仅不能建立坏死性胰腺炎模型,而且胰腺组织细菌培养阳性率为0(0/8);牛磺胆酸钠混合大肠杆菌逆行胰管注射能够建立感染性坏死性胰腺炎模型,大肠杆菌浓度为103个/ml组、104个/ml组、105个/ml组胰腺组织细菌培养率分别为60%、100%、100%,而8 h存活率分别为100%、100%、70%.结论(1)大肠杆菌浓度为104个/ml和牛磺胆酸钠浓度为5%的混合液,按0.1 ml/100 g体重的量经胰管逆行注射(注射速度为0.2 ml/min)可建立稳定可靠的感染性坏死性胰腺炎大鼠模型.(2)该方法导致感染性坏死性胰腺炎发生的可能机制为:牛磺胆酸钠导致胰腺组织发生出血、坏死,并引起胰腺组织抵抗细菌定植能力下降;同时,坏死的胰腺组织给细菌提供了良好的生长环境;此外,胰腺组织发生细菌感染与入侵的细菌量有正相关关系.
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胰腺炎相关蛋白
胰腺炎相关蛋白(pancreatitis as-sociated protein,PAP),是在1 984年由Keim等[1]在大鼠急性胰腺炎模型的胰液中发现,由于这种蛋白在急性胰腺炎时胰液中测得,而在正常胰腺测不到,因而将其命名为"胰腺炎相关蛋白".PAP属C类植物血凝素基因家族,在急性胰腺炎时过度表达,与急性胰腺炎的严重程度、临床过程密切相关.除胰腺外,PAP还广泛存在于回肠、空肠、十二指肠等处,经表达PAP的组织及肾脏迅速从血循环清除.另外,PAP还与某些消化道肿瘤等疾病有关.现就PAP的生物学特性进行简要的介绍.一、PAP的生物学特点Keim等[1]从蛙皮素或牛磺胆酸钠诱发的大鼠急性胰腺炎模型胰液中提取了PAP,用双向PAGE推测出PAP的分子量约为16 000,等电点为8.2.进一步研究发现PAP合成于胰腺组织的粗面内织网,存储于酶原颗粒中.PAP在正常胰腺细胞及胰液中几乎测不到,而在急性胰腺炎时胰腺组织中的浓度可增加至少100倍.1. PAP的蛋白及基因结构:PAP在胰腺中以前蛋白的形式存在,由175个氨基酸组成,其N端有26个氨基酸组成的信号肽,去掉信号肽后变为PAP蛋白分泌入胰液[2].
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常用免疫抑制剂对急性胰腺炎免疫异常的调节作用
已经证实,免疫功能异常是急性胰腺炎病情恶化的重要因素[1,2].推测免疫抑制剂可能通过其免疫调节作用,而对急性胰腺炎有普遍治疗效果.为证实这一假说,本研究通过动物实验观察了常用的免疫抑制剂氟尿嘧啶,甲泼尼龙,环磷酰胺和氨甲喋呤对大鼠急性胰腺炎的炎症性细胞因子和抗炎症细胞因子的抑制作用及其治疗效果.1.材料和方法:(1)动物:10～12周龄雄性SD大鼠,体重200～250 g,由华西医科大学动物中心提供.(2)急性胰腺炎模型和细胞因子检测:SD大鼠,共分6组,实验前16 h禁食不禁水.1组:正常对照组(n=6).2组:采用5%水合氯醛腹腔麻醉,开腹胰胆管注射5%牛磺胆酸钠0.6 ml/kg.制成胰腺炎模型;不治疗(n=8).余下各组在胰腺炎诱导成功后0.5 h分别经阴茎背静脉注射氟尿嘧啶40 mg/kg(3组n=6);甲泼尼龙30 mg/kg(4组n=6);环磷酰胺20 mg/kg(5组n=6);氨甲碟啶1.2 mg/kg(6组n=6),所有动物术后皮下输液6ml/kg-1@h-1).24 h后处死动物;抽血采用Bioassay法测定血TNF-α,IL-1,IL-6水平;采用标准商用试剂盒ELISA法测定血IL-10,TGF-β水平及胰淀粉酶,胰腺湿重.
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奥曲肽抑制重症急性胰腺炎大鼠诱生型一氧化氮合酶
一般认为奥曲肽(善宁)治疗急性胰腺炎的显著疗效常与抑制胰酶、消化液分泌有关〔1〕，重症急性胰腺炎(SAP)急性期常伴有急剧的全身病理生理改变，细胞因子和炎症介质的过度表达可引起急性胰腺炎组织损伤〔2，3〕，诱生型一氧化氮的过量产生可明显引起细胞毒性作用以及脏器血供的低灌注〔4〕。本研究探讨奥曲肽缓解急性胰腺炎的病情，是否还通过抑制过量产生的一氧化氮(NO)。 材料和方法 1.实验动物：雄性SD大鼠200～250 g128只，清洁级，购自中国科学院上海实验动物中心。随机分为假手术组8只，SAP组60只，治疗组60只，其中SAP组和治疗组各观察20只动物死亡率。 2.大鼠重症急性胰腺炎模型制作：参照Schmidt等〔5〕方法并加以改进 氯胺酮(50 mg/kg)和3%苯比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉经右颈外静脉行右心房插管，无菌条件下，手术显微镜下，十二指肠降部的肠壁处逆行穿刺胆胰管，微量药液注射泵注射5%牛磺胆酸钠(Sigma公司)1.0 ml/kg，注射速度0.2 ml/min，注射持续10 min。肉眼下，大鼠胰腺组织出现充血、水肿后方开始后续实验。假手术组仅翻动胰腺后关腹，治疗组于诱发SAP后皮下注射奥曲肽(诺华公司)，每次14 μg/kg q8 h×2 d。
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早期肠内营养联合大黄治疗重症急性胰腺炎的实验研究
本实验旨在探讨早期肠内营养(early enteral nutrition,EEN)联合大黄治疗重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的合理性及治疗效果.材料与方法1.主要材料:雄性Wistar大鼠,生大黄煎液分别购自哈尔滨医科大学第一临床医学院动物实验中心及药房;结晶牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司;肠内营养液百普素购自荷兰Nutricia公司.
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HPLC测定片仔癀中4种成分的含量
目的 建立测定片仔癀中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及牛磺胆酸钠的含量.方法 采用Hypersil BDSC<,18>(4.6mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)梯度洗脱:0～40 min(20%A～40%A),40一90 min(40%A～90%A),90～100 min(90%A);柱温:30℃;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:203 nm.结果测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及牛磺胆酸钠的回收率分别为100.3%,101.6%,103.3%,100.6%.线性范围分别是:三七皂苷R1 0.346 4～8.66 μg(r=0.996 3),人参皂苷Rg1 0.432 2～10.805 lxg(r=O.996 4),人参皂苷Rb10.422 4～10.56μg(r=0.999 9),牛磺胆酸钠0.448～11.2 μg(r=0.999 6).结论 采用高效液相色谱梯度洗脱能将片仔癀中的皂苷及胆汁酸较好的分离检测,方法准确可靠,重复性好,结果稳定,可作为该产品质量控制的方法.
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三种不同严重程度大鼠重症胰腺炎模型比较研究
目的：为研究者选择合适的牛磺胆酸钠浓度来制备大鼠重症胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP） SAP 模型提供依据。方法将60只 SD 大鼠随机分为假手术组、1．5％浓度组、3．5％浓度组和5％浓度组，造模各组分别用1．5％、3．5％和5％牛磺胆酸钠按逆行胆胰管注射法制备 SAP 模型。术后统计各组大鼠的死亡率；检测血清淀粉酶、肿瘤坏死因子－α（ TNF －α）、白介素－6（ IL －6）水平；观测各组大鼠胰腺组织 HE 染色病理评分。结果5％浓度组死亡率较1．5％浓度组显著升高，血淀粉酶、肿瘤坏死因子－α（ TNF －α）、白介素－6（ IL －6）水平、出血和腺泡组织坏死的病理评分较1．5％浓度组和3．5％浓度组均有显著升高。结论5％的牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射法能更好的制备 SAP 模型，且更符合 SAP 的生理、病理表现。
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血液透析膜生物相容性及在重症胰腺炎中的应用
背景：连续性血液净化可以清除细胞因子和炎症递质，维持内环境稳定，阻止重症胰腺炎患者多器官功能障碍综合征发生，已经成为重症胰腺炎患者中的主要治疗方法。血液透析技术从应用开始，学者就对透析膜材料及其理化生物特性进行了研究，并且相继研究出多种血液透析膜，以改善其生物相容性及机体外抗凝效果。目的：观察血液透析膜在重症胰腺炎疾病中的应用效果。方法：将体积分数5%的牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射建立急性重症胰腺炎大鼠模型，建模后随机分2组，在血液透析过程中分别采用血仿膜和聚砜膜透析，每组5只，进行血液透析生化指标检测。结果与结论：①血液透析生化指标检测结果：与血仿膜组相比，聚砜膜组超滤系数、肌酐清除率、尿素氮清除率、磷清除率、循环血内皮细胞数量、血浆一氧化氮和非对称性二甲基精氨酸浓度显著降低(P <0.05)；聚砜膜组维生素B12清除率以及预充血量显著升高(P <0.05)。②结果证实，聚砜膜血液透析时生物相容性较好，在重症急性胰腺炎患者中能够维持其内环境稳定。
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HPLC测定蛇胆川贝胶囊中牛磺胆酸钠的含量
蛇胆川贝胶囊载于中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂第6册,功能为清肺,止咳,除痰.用于肺热咳嗽,痰多.由蛇胆汁、川贝母组成,原标准有一个川贝母显微鉴别,文献资料尚未见该制剂质量分析的报道,我们参照有关蛇胆汁中牛磺胆酸钠含量测定方法[1～5],用高效液相色谱法测定了制剂中牛磺胆酸钠的含量,并进行了方法学研究.
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大鼠急性胰腺炎急性期脑脊液肿瘤坏死因子-α和脑组织CD44表达
胰性脑病是急性胰腺炎急性期严重的并发症之一,肿瘤坏死因子(TNF)-α和粘附分子CD44与其关系尚不清楚.然而,胰性脑病的实验研究模型尚不成熟,故本研究采用牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射诱发大鼠胆源性急性胰腺炎的实验模型,并对急性期脑脊液TNF-α和脑组织CD44的表达情况进行观察.
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环氧合酶-2对重症急性胰腺炎大鼠模型的实验研究
胰腺细胞内胰蛋白酶原激活是引起急性胰腺炎(AP)的起始因素,然而决定病程转归及严重程度的机制并未明确.研究显示,胰酶激活后的炎症反应与AP严重程度密切相关[1].环氧合酶-2(COX-2)受各种炎症因子调节,在炎症发生发展中起重要作用[2].已有研究证实,AP时胰腺细胞中COX-2表达增加.我们在5%牛磺胆酸钠诱导大鼠重症急性胰腺炎(SAP)模型中,用特异性COX-2抑制剂(NS-398)干预,观察胰腺组织COX-2变化及这一变化与胰腺组织学之间的关系,探讨COX-2在AP中的可能作用机制.
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制备型高效液相色谱法从牛胆汁中制备牛磺胆酸钠
建立了制备型液相色谱法从牛胆汁中制备牛磺胆酸钠.将牛胆汁用75％乙醇浸泡,过滤,经硅胶柱色谱吸附,以二氯甲烷∶甲醇∶水(70∶30∶10)下层洗脱,得到牛磺胆酸钠混合物粗品.采用GRACE Adsorbosphere C18色谱柱分离纯化,以甲醇∶0.4％磷酸二氢钠水溶液(55∶45)为流动相,检测波长205 nm.根据色谱图收集柱后浓度较高的牛磺胆酸流出液,经脱盐和碱化处理后得到牛磺胆酸钠,纯度98.1％,回收率约60％.利用红外、核磁共振等光谱学方法确证结构.
