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嗜水气单胞菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究
目的 建立嗜水气单胞菌ATCC7966 外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法. 方法利用双向电泳技术对嗜水气单胞菌外膜蛋白进行分离,用LC-LTQ-XL质谱技术鉴定,并结合Western blot技术寻找具有免疫应答的蛋白质. 结果 LC-LTQ-XL质谱共鉴定出43个肽段,共计39个蛋白质. 这些蛋白质不仅有外膜蛋白(69%),还有内膜蛋白(12%)等,功能涉及物质运输、细胞运动和生物合成等领域. 终利用2D结合Western blot技术找到了一个疫苗候选蛋白. 结论 成功建立了嗜水气单胞菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,为将来发现更多候选疫苗提供理论基础.
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亚胺培南治疗铜绿假单胞菌所致新生儿下呼吸道严重感染失败分析
目的研究亚胺培南治疗新生儿下呼吸道铜绿假单胞菌感染失败因素.方法分析1例重度窒息新生儿,下呼吸道分泌物检出大量铜绿假单胞菌,药敏试验亚胺培南敏感,用治疗剂量亚胺培南静脉滴注1 h滴完,连续4 d,然后再培养分析.结果新生儿窒息症状无改善,再次检出大量铜绿假单胞菌,经药物敏感试验证实亚胺培南耐药,经检测发现其外膜蛋白(OprD2)含量相对减少且已诱导出金属酶.结论治疗剂量亚胺培南静脉滴注时间过长导致血药浓度低于治疗浓度,诱导铜绿假单胞菌OprD2缺失及产生金属酶.正确使用亚胺培南至关重要.
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登革病毒Ⅰ～Ⅳ型外膜基因的表达及重组抗原的血清学应用
目的 选取登革病毒Ⅰ～Ⅳ外膜蛋白DⅢ区基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断的纯化重组蛋白.方法 用RT-PCR法扩增登革病毒Ⅰ～Ⅳ毒株外膜蛋白DⅢ区基因,与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白用电洗脱法进行纯化.纯化的重组蛋白用间接ELISA法、捕获ELISA法和夹心ELISA应用于血清学检测,检测结果与间接免疫荧光法进行比较.结果 重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,纯化的重组蛋白对登革热病毒感染者具有很高的检出率,与间接免疫荧光法检测结果基本相符.结论 登革病毒Ⅰ～Ⅳ外膜蛋白DⅢ区基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白可应用于血清学检测.
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应用单克隆抗体技术研究淋病奈瑟菌外膜蛋白
淋病奈瑟菌细胞的外膜蛋白I(outer membrane protein I,PI)是淋病奈瑟菌抗原的重要组成部分,也是其血清学分类的重要物质基础,PI可分为低分子量的PI-A和较高分子量的PI-B两类. 本研究应用单克隆抗体分型技术对2000年1月-2001 年10月门诊分离的淋病奈瑟菌进行了外膜蛋白抗原性测定.
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绿脓假单胞菌主动外排表型及OprM基因检测
绿脓假单胞菌(PA)是医院内常见的条件致病菌之一,对多种抗菌药物表现耐药[1].研究发现PA细胞膜上的主动外排泵是导致其多重耐药的主要原因之一,主动外排泵由菌体细胞膜的内膜蛋白与外膜蛋白组成,在六种外排泵中外膜蛋白OprM为常见[2].本试验对临床分离的PA多重耐药菌主动外排表型及OprM基因进行筛选,探讨PA多重耐药和主动外排的分子机制.
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空肠弯曲菌28-31 ku外膜蛋白的免疫原性
目的:探讨空肠弯曲菌28-31 ku外膜蛋白的免疫原性.方法:将BALB/c小鼠分为正常对照组和不同剂量抗原的免疫组,正常对照组不予抗原免疫,而免疫组采用28-31 ku蛋白(纯)或甘氨酸提取的外膜蛋白(粗),分别加用或不加用完全弗氏佐剂(F),采用sc,在0,1,2,3,4 wk免疫,于末次免疫后10 d,用双向免疫琼脂扩散试验测定各免疫组抗血清效价,待效价达到1:4至1:16时.分别采集各免疫组及对照组小鼠的血清、空肠及回肠内的肠液,用间接ELISA法检测各组标本的特异性抗体IgA,IgG.结果:不同剂量的抗原sc免疫BALB/c小鼠后,免疫组血清及肠液中特异性IgA,IgG抗体水平较正常对照组及实验对照组显著升高(P＜0.05).结论:空肠弯曲菌的28-31 ku外膜蛋白是一种良好的免疫原,能够诱导BALB/c小鼠产生特异性抗体,可能成为空肠弯曲菌亚单位疫苗候选的重要组分.
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幽门螺杆菌OipA、HopX、HopW基因的检测及序列分析
目的:检测幽门螺杆菌(H pylori)标准菌株NCTC11637及临床菌株外膜蛋白的三种基因(OipA、HopX、HopW)及比较NCTC11637中三种基因与国际标准菌株(26695和J99)的同源性,为Hpylori疫苗的筛选提供实验依据.方法:运用PCR方法检测标准菌株NCTC11637及27例临床菌株中的三种基因,并对其进行测序.运用GenBank比较与国际标准菌株(26695和J99)的同源性.结果:在标准菌株NCTC11637中检测到三种基因.在27例临床菌株中,有10例检测到OipA基因.在23例中检测到HopX基因,在27例中均检测到HopW基因.NCTC11637中OipA基因与26695和J99的核苷酸序列同源性分别为95.38%、94.60%,均低于两株国际标准菌株的同源性95.50%.HopX基因的同源性分别为94.90%和95.15%,同样低于两株国际标准菌株的同源性96.49%.HopW基因与26695和J99的同源性分别为97.38%、94.90%,两株标准菌株的同源性为95.20%.结论:在标准菌株NCTC11637和临床菌株中检测到三种基因.Hpylori HopW基因核苷酸序列具有一定的保守性.
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乙肝病毒表面抗原基因启动子Ⅱ的结构及调节研究
0引言乙型肝炎病毒(HBV)为含有一段单股区的双链环状DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科,其基因组结构紧密,可分为结构基因序列和调节基因序列两部分,二者可具有相互重叠的特点.HBV基因的负链核苷酸序列中,至少有4个开放读码框(open reading frame,ORF),包括编码外膜蛋白的S基因区,编码核衣壳蛋白的C基因区,编码聚合酶的P基因区和调节病毒基因转录水平的X基因区,4种ORF分别有各自的启动子.HBV的外膜蛋白能使病毒由感染的细胞分泌,并能附着和侵入新的细胞;同时其也是引起宿主保护性应答的免疫原表位[1-6].因此,作为指导S基因组RNA转录的SP启动子序列,在HBV的生活周期中,具有较为重要的作用.
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丙型肝炎病毒5'-非翻译区的结构与功能研究
0引言丙型肝炎病毒(HCV)是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒,属黄病毒科肝炎病毒类.在大多数感染人群中丙型肝炎病毒表现为持续性感染,并可导致慢性肝炎、肝硬化,或肝细胞癌[1,2].从不同患者中分离的病毒表现出明显的序列差异,从同一患者分离的病毒呈现出准种的特点.然而5'-非翻译区(5'-NTR,5'-nontranslated RNA)在HCV不同基因型却相对保守和稳定,这种序列保守的特点可能在病毒基因组的复制和翻译中起着重要的作用[3,4].
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幽门螺杆菌外膜蛋白对Helicobacter pylori感染的诊断
目的:通过检测伴有H pylori感染的上消化道疾病患者血清对H pylori OMP的反应性,来探讨基因重组H pylori OMP对H pylori感染及其相关性疾病的诊断价值,为进一步开发诊断试剂盒及其临床应用奠定基础.方法:分别将已鉴定、测序的含H pylori Mr为18000,26 000 OMP重组质粒转化表达菌-大肠杆菌BL21中,让其大量表达、纯化,制备金标免疫检测试纸;选择2002-01/2002-12因消化道症状来我院就诊的H pylori阳性患者150例,经胃镜证实:慢性浅表性胃炎60例;胃溃疡30例;十二指肠球部溃疡30例;胃癌30例,以及33例H pylori阴性的健康者作为对照,分别采用以H pylori Mr为18 000,26000 OMP为抗原制备金标免疫检测试纸,对183例受试者血清进行特异性抗体检测.结果:重组蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度高达95%以上,经检测其抗原性良好.用金标免疫试纸对H pylori感染的上消化道疾病患者150例,以及H pylori阴性的健康者33名进行了检测,其结果为:26 000 OMP对H pylori感染的检出率为94.0%,对慢性浅表性胃炎、胃溃疡、十二指肠球部溃疡以及胃癌患者中H pylori感染的检出率分别为95.0%,96.7%,96.7%和90.0%,与常规ELISA方法检测结果相比,二者无显著性差异(x2检验,P＞0.05),其敏感性、特异性和准确性分别为94.0%、97.0%、94.5%;而18 000OMP对H pylori感染患者的检出率为52.0%,对慢性浅表性胃炎、胃溃疡、十二指肠球部溃疡和胃癌患者中H pylori感染的检出率分别为40.0%、40.0%、53.3%和86.7%,对胃癌患者中H pylori感染检出率86.7%与慢性浅表性胃炎、胃溃疡、十二指肠球部溃疡总检出率43.3%相比,具有显著的差异性(P＜0.05).因此以26 000OMP的金标免疫检测试纸可以作为H pylori感染的常规检测方法,他与常规ELISA检测方法相比具有可靠的特异性以及敏感性,同时与18 000 OMP金标免疫检测试纸一起,对胃癌患者中H pylori感染检出率高对胃肠道肿瘤特别是胃癌的诊断及预测方面具有独特之处,这值得进一步的研究.结论:H pylori Mr 18000,26000 OMP金标免疫检测试纸对H pylori感染及其相关性疾病,尤其对消化道恶性肿瘤的诊断及预测具有重要的价值,可以作为常规检测手段对消化道溃疡及肿瘤高危人群进行检测.
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肺炎衣原体感染致动脉粥样硬化病理机制的研究进展
1999年Ross[1]提出了"动脉粥样硬化-慢性炎症学说",修正和补充了他于1993年提出并得到公认的"血管内皮损伤反应学说"[2],认为动脉粥样硬化是发生在大、中动脉血管壁的内皮细胞损伤后,由细胞免疫所介导的慢性炎症反应.近10年来,关于肺炎衣原体感染在动脉粥样硬化形成和发展中作用的研究正逐渐深入,从流行病学相关性、病理机制探讨、动物疾病模型复制到大规模临床抗生素干预试验,均初步证明肺炎衣原体感染是动脉粥样硬化的一个重要的病因.本文以"肺炎衣原体感染-宿主免疫-动脉粥样硬化"为主线,简要介绍肺炎衣原体感染致动脉粥样硬化相关病理机制的研究进展.一、致病机制肺炎衣原体侵入机体后主要是通过两种机制参与动脉粥样硬化的:(1)肺炎衣原体抗原,如脂多糖、热休克蛋白60及富含半胱氨酸的外膜蛋白(MOMP)等诱导机体产生抗体,并对动脉壁靶细胞进行免疫攻击,引起抗体依赖性细胞毒[3].(2)单核-巨噬细胞作为载体,将肺炎衣原体由寄居部位肺泡迁移到动脉壁,并在内皮细胞、血管平滑肌细胞及巨噬细胞内慢性迁延感染,诱导细胞因子及黏附分子表达,导致内皮细胞损伤、泡沫细胞形成、血管平滑肌细胞增殖、迁移及基质胶原成分改变[4,5].
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碳青霉烯酶:未来困扰我们的难题
在所有β内酰胺类抗生素中,碳青霉烯类具有广泛的抗菌活性,它对革兰阴性菌产生的超广谱β内酰胺酶(ESBL)、AmpC酶都很稳定;但随着碳青霉烯类的广泛使用,细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性.铜绿假单胞菌由于外膜蛋白的D2孔的缺失而对亚胺培南耐药.非特异的多药外排泵的表达增强可以引起铜绿假单胞菌对美罗培南、头孢菌素、喹诺酮类、四环素等耐药.肠杆菌科细菌高产AmpC酶,同时外膜通透性降低,会造成碳青霉烯类耐药.麻烦的是,近来产生获得性碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠杆菌科细菌的报道有所增加[1,2].由这些产酶株感染造成的暴发流行,使治疗陷入无药可用的境地,病死率很高.
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铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达
目的：克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因，构建其原核表达载体并鉴定其表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因；采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒，并经酶切和序列测定后，获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中，以构建pET28b-OprH重组表达质粒，并在表达宿主菌E?Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功；重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物，为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。
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鲍曼不动杆菌美罗培南体外诱导后对常用抗菌药物敏感性降低及其机制研究
目的：研究美罗培南体外诱导后的鲍曼不动杆菌对药物的敏感性及相关机制。方法将临床分离的3株对碳青霉烯类敏感的鲍曼不动杆菌用美罗培南体外诱导后获得突变株（MS1、MS2和 MS3），对诱导前后的菌株，采用全自动药敏分析仪测定抗菌药物低抑菌浓度（MIC）的变化，采用肠杆菌科细菌间重复共有序列聚合酶链反应（ERIC－PCR）分析其同源性，改良 Hodge 试验和 EDTA－Na2双纸片协同法分别检测碳青霉烯酶和金属β－内酰胺酶，PCR 法检测碳青霉烯酶基因，对产物进行测序分析，荧光定量 PCR 检测外排泵基因 adeB 的表达差异，并用 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外膜蛋白表达变化。采用 t 检验分析数据。结果美罗培南对鲍曼不动杆菌突变株的 MIC 上升，除亚胺培南、阿米卡星和多黏菌素对突变株的 MIC 无变化外，其他大部分抗菌药物对突变株的 MIC 也上升，且 MS2和 MS3对美罗培南的敏感性下降可稳定传代。同源性分析显示，亲本株和突变株100％同源。亲本株和突变株碳青霉烯酶和金属酶均阴性，只检测到 OXA－51耐药基因。突变株 adeB 基因表达量为24．26±0．91，亲本株为22．81±0．38，二者差异无统计学意义（t ＝2．534， P ＞0．05）。 MS1缺失相对分子质量为54000外膜蛋白，MS2和 MS3缺失相对分子质量为47000外膜蛋白。结论美罗培南体外诱导后，鲍曼不动杆菌对美罗培南和常用抗菌药物的敏感性下降，可能与相对分子质量为47000外膜蛋白缺失有关。
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产金属酶合并外膜蛋白缺失的铜绿假单胞菌的检测
目的研究铜绿假单胞菌对亚胺培南(IMP)耐药机制,为临床合理选择抗生素提供确切的依据. 方法对20株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌,以EDTA、CuCl2、 FeCl2、2-MPA、IMP为酶抑制剂,头孢他啶(CAZ)、亚胺培南为底物,在M-H平板上用纸片扩散法进行抗生素协同敏感性检测,并用聚合酶链反应(PCR) 检测金属酶基因;对3株耐亚胺培南(IMP)的菌株和3株敏感株,提取其菌株外膜蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析,比较两组菌株外膜蛋白的差异. 结果协同法检测20株铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶有1例阳性,结果与PCR法检测结果一致,PCR产物经测序证实为VIM-2型金属β-内酰胺酶;金属β-内酰胺酶阳性的菌株在2 种底物纸片中均与EDTA、2-MPA和IMP 纸片有协同作用,其中2-MPA效果好,与CuCl2、 FeCl2纸片无协同作用;在外膜蛋白SDS-PAGE电泳图谱上发现敏感株存在OprD2、OprE带,但耐药株缺乏OprD2,OprE带缺乏或者染色较淡;定量分析发现耐药株OprD2、OprE含量明显低于敏感株. 结论铜绿假单胞菌对IMP耐药的主要原因是外膜蛋白OprD2、OprE缺失或含量减少以及VIM-2型金属β-内酰胺酶的产生所致,或由两者共同作用所致.
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AdeABC主动外排系统及外膜蛋白在鲍氏不动杆菌对碳青霉烯类耐药中的作用研究
目的 探索AdeABC主动外排系统及外膜蛋白在鲍氏不动杆菌对碳青霉烯类耐药中的作用.方法 随机收集复旦大学附属中山医院临床标本鲍氏不动杆菌40株,以琼脂稀释法测定其对美罗培南、亚胺培南的低抑菌浓度,按不同的耐药表型分组,进行羰基氢氯苯腙抑制试验,普通PCR扩增外排泵基因adeB,实时荧光定量PCR检测adeB基因表达水平;超声物理法提取外膜蛋白,12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析外膜蛋白.结果 40株鲍氏不动杆菌中,对亚胺培南、美罗培南均敏感检出15株,检出率37.5%,亚胺培南敏感美罗培南耐药检出6株,检出率15.0%,亚胺培南、美罗培南均耐药检出19株,检出率47.5%;中山医院鲍氏不动杆菌中,adeB外排泵基因广泛存在,在敏感菌株中存在率也很高;碳青霉烯类耐药组外排泵adeB基因的表达量相对高于敏感组,统计学分析3组之间差异无统计学意义;外膜蛋白分析发现,部分菌株有29 kd的条带丢失.结论 主动外排系统和外膜蛋白缺失在鲍氏不动杆菌对碳青霉烯类耐药中可能发挥一定的作用.
关键词： 鲍氏不动杆菌 碳青霉烯 AdeABC外排泵系统 外膜蛋白 -
亚抑菌浓度亚胺培南体外诱导铜绿假单胞菌耐药
目的探讨铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗生素的耐药机制. 方法分析亚抑菌浓度亚胺培南诱导耐药的铜绿假单胞菌株体外抗菌活性、OprD2相对含量、β-内酰胺酶活性的改变. 结果与对照组相比,诱导组亚胺培南体外抗菌活性下降,OprD2的相对含量减少,β-内酰胺酶活性明显增加. 结论铜绿假单胞菌诱导耐药可能是OprD2的缺失和β-内酰胺酶高诱导表达共同作用的结果.
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社区肺炎克雷伯菌耐药性分析及耐药基因的研究
目的 研究山西医科大学第二附属医院肺炎克雷伯菌(KPN)耐药性以及10种耐药基因的检测.方法 采用纸片琼脂扩散(K-B法)法测定临床分离的31株肺炎克雷伯菌对环丙沙星、头孢吡肟(FEP)、头孢西丁(FOX)等19种药敏纸片的耐药性,并选22株不同耐药株进行TEM、SHV、CTX-M1、CTX-M9、gyrA、gyrB、parC、pare、ompC、ompF 10种耐药基因进行PCR扩增.结果 药敏试验显示有17株为耐药株,8株为敏感菌株,有6株中介,5株超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表型试验为阳性;PCR扩增试验显示10种耐药基因均能扩增出,其中SHV型超广谱β-内酰胺酶基因17株居首,13株ompF、16株parV、15株gyrB型基因相对4株ompC、6株parE、8株gyrA型氟喹诺酮耐药基因.结论 社区肺炎克雷伯菌中普遍存在ESBLs型基因,DNA旋转酶基因、拓扑异构酶Ⅳ基因、外膜蛋白基因,应加强耐药基因的检测,减少耐药株出现.
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水杨酸盐体外抑制铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2的表达
目的探讨水杨酸盐对铜绿假单胞菌碳青酶烯类抗生素耐药机制的影响. 方法以亚胺培南为代表,分析不同浓度的水杨酸盐,对10株临床分离的铜绿假单胞菌体外抗菌活性、OprD2相对含量的影响. 结果随着水杨酸盐浓度的增高,亚胺培南体外抗菌活性逐渐下降,OprD2的相对含量逐渐减少. 结论水杨酸盐能抑制铜绿假单胞菌OprD2的表达,诱导其对碳青酶烯类抗生素的耐药.
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医院获得性肺炎患者分离耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌OprD的表达
目的 研究耐碳青霉烯类抗菌药物铜绿假单胞菌(PAE) OprD的表达水平,探讨济南地区PAE耐碳青霉烯类抗菌药物的机制.方法 收集从医院获得性肺炎患者痰液中分离的PAE,提取13株耐碳青霉烯类抗菌药物菌株的RNA,应用荧光实时定量PCR分析PAE外膜蛋白oprD的基因表达水平；采用超声破碎法制备外膜蛋白,超速离心收集外膜蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离外膜蛋白,观察OprD的表达.结果 荧光实时定量RT-PCR检测PAEoprD基因表达的结果表明,实验室标准株Ct值oprD/rpsL为1.42；13株碳青霉烯类耐药株Ct值oprD/rpsL平均值为1.17,与实验室标准株相比,差异有统计学意义(t=3.0716,P＜0.01),2株碳青霉烯类敏感株Ct值的oprD/rpsL平均值为1.58,与实验室标准株相比,差异无统计学意义；外膜蛋白电泳图谱表明,碳青霉烯类耐药株在45 kDa处表达明显下降,此处外膜蛋白为OprD.结论 济南地区PAE耐碳青霉烯类抗菌药物与OprD表达水平下降有关.
