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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因C-12的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中,对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的,HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和CD4+T细胞免疫反应的重要抗原,寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因,是研究HBcAg生物学功能的重要途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-d-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank的信息设计新基因的引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录PCR扩增出C-12#新基因的完整序列,连入另一酵母表达载体pGADT7,并转化进酵母细胞Y187,再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交),以进一步证实HBcAg与C-12#新基因编码蛋白的结合作用.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中的表达,配合后选出既能在四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中未知基因4个.用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出C-12#新基因的完整序列,回交实验证实二者之间的结合作用.结论:成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白,发现未知功能基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV的前-X基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,配合后选出在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落19个,其中5个是人铁蛋白;1个是人的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3);1个是人醛缩酶B;1个是人糖基化磷脂酰肌醇锚定结合因子1(GPAAl);1个是人血红素结合蛋白;1个是人C1酯酶抑制子(C1-INH);1个是人玻连蛋白;1个是人电压依赖性阴离子通道1(VDACl);1个是丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin);1个是人梭素;1个是人纤溶酶原(PLG);3个是人假想蛋白;1个是RP11-542M13克隆,位于染色体16.结论:成功克隆出前-X的结合蛋白,为进一步研究HBV的前-X蛋白的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选人白细胞中与乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因
目的:筛选并克隆人白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,进一步探讨HBxAg的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落50个,其中含真核翻译延伸因子2基因20个,真核翻译延伸因子1基因1个,真核翻译起始因子3基因2个,急性髓样白血病MTG8蛋白基因2个,髓样关联分化蛋白基因1个,髓样分化主反应蛋白基因1个,皮肤T细胞淋巴瘤肿瘤抗原基因1个,大组织相容性复合物Ib抗原基因3个,白细胞抗原CD37基因1个,慢性白细胞性白血病相关抗原基因1个,α白细胞整联蛋白基因1个,生长停止和DNA损伤诱导因子34基因1个,转录变异因子1基因2个,蛋白磷酸酶1调控抑制因子15A基因1个,单核细胞系胞苷脱氨酶基因1个,巨噬细胞钙离子依赖型凝集素2基因1个,KIAA1949蛋白基因3个,尿激酶型血浆素原激活剂基因1个,GDP分解抑制因子基因3个,软骨素4磺基转移酶基因1个,锌指蛋白1A亚目基因1个和未知蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒X蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBxAg的生物学作用提供了新的线索.
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小鼠和大鼠NS5ATP4同源基因序列的生物信息学分析
目的:克隆、鉴定、分析小鼠和大鼠NS5ATP4基因序列,确定编码产物序列,并对于其与人的NS5ATP4基因及其编码产物的序列的同源性进行分析.方法:利用基因芯片技术获得了人NS5ATP4的cDNA序列,利用生物信息学技术确定小鼠、大鼠的NS5ATP4的基因及其编码产物的序列,并对于其同源性进行生物信息学分析.结果:利用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4的基因及其编码产物的序列,小鼠和大鼠的NS5ATP4编码基因区分别由762和756个核苷酸(nt)组成.编码产物分别由263和261个氨基酸残基(aa)组成.与人NS5ATP4基因和蛋白质一级结构序列的同源性分别为90.29%,84.25%和95.65%,86.96%.结论:应用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4的基因及编码产物的序列.
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应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin(MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15;1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因.结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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应用抑制性消减杂交技术筛选TAHCCP2的反式调节基因
目的:筛选与克隆TAHCCP2的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆TAHCCP2反式激活的新型靶基因.以TAHCCP2表达质粒pcDNA3.1(-)-TAHCCP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人TAHCCP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到70个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了TAHCCP2可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析
目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白基因,并对新基因转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)基因的全长编码序列,并构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,确定人的HCBP6基因由456 nt组成,编码152aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,HCBP6表达质粒转染的细胞有20条差异表达基因,其中13条基因表达增强,7条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、增生、分化及生长调节密切相关.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆蛋白结合蛋白的有效方法,基因表达谱芯片技术对于初步全面探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白与Hcbp6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据.
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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因
目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术,筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1个,RNA多聚酶Ⅲ 3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个.结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.
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截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上调c-myc基因表达的研究
目的:应用抑制性消减杂交方法构建截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式调节基因的消减文库,用免疫印迹方法验证截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白对c-myc基因的上调表达.方法:构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Mt,分别以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-Mt和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,用抑制性消减杂交技术,将实验组与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),构建eDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.生物信息学分析结果显示部分与肿瘤发生密切相关的基因,如癌基因c-myc.结果:显示截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白可以反式激活c-myc基因,并上调其表达.结论:成功构建截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的消减文库,细胞原癌基因c-myc是MHBst反式激活作用的靶基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中HCV NS3蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS3基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS3基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落18个,其中4个真核细胞翻译延伸因子2;2个免疫球蛋白λ轻链;1个肌动蛋白β;1个铁蛋白轻多肽;1个(丝裂原)活化蛋白激酶3;2个肌球蛋白因子1;1个白介素2受体β;1个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6;1个组织蛋白酶S;1个2'-5'寡腺甘酸合成酶类似物;1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个CNN2;1个新基因.结论:成功克隆出HCV NS3的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中HCV核心蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV核心蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出核心蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α--半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共6个,其中2个高尔基复合体关联蛋白1,1个Ran结合蛋白M,1个pellino同族体2,2个未知功能蛋白基因(KIAA1949).结论:成功克隆出丙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因和蛋白的生物信息学分析
目的:克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞的蛋白基因,对新发现的基因及编码产物的结构与功能,及其基因表达的调节机制的结构基础进行生物信息学分析.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,对其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)全长基因及其编码产物的一级结构序列,进行生物信息学分析.获得该基因的基因组序列,并利用同源基因序列的比对,确定该基因在染色体上的定位,并确定人HCBP6基因的内含子序列.对其编码上游的基因组DNA序列进行分析,获得该基因启动子序列的一些信息.同时,根据同源基因序列的比较,确定了小鼠HCBP6的基因序列和氨基酸残基序列.通过对氨基酸残基序列的疏水性特点的分析,确定了HCBP6蛋白的潜在的抗原结构位点.通过蛋白质一级结构的在线计算机软件的分析,对人HCBP6蛋白质一级结构潜在的功能性结构位点进行了计算机辅助分析预测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,证实人HCBP6基因由456 nt组成,编码产物由152 aa组成.人HCBP6的基因组DNA是没有内含子序列的DNA结构.通过生物信息学技术分析,确定人HCBP6基因组DNA定位于人22号染色体上.在对人HCBP6基因启动子序列的生物信息学分析中发现了几段可能的启动子序列结构,以及可能的转录因子蛋白潜在的结合位点.利用同样的技术,确定了小鼠的HCBP6的基因序列和蛋白质一级结构序列.对人HCBP6的蛋白质一级结构序列进行分析,发现在其序列中第80-110氨基酸残基序列之间存在疏水性结构位点,提示抗原位点所在,对其进行免疫学分析提供了可能.利用在线软件,对人的HCBP6蛋白质结构中潜在的功能位点进行了初步的预测,为进一步研究HCBP6蛋白的生物学功能的实验研究,提供了丰富的信息.这些生物信息学分析的结果,虽然目前还只是初步的,有些还不能被实验所证实,但是,对新基因的结构与功能的研究来说,毕竟这种生物信息学分析,能够提供一些线索,对下一步结构与功能分析实验的设计,具有很大的帮助.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆、分析蛋白结合蛋白的基因,对于其功能结构域的预测的有效工具,在病毒性肝炎的致病机制研究中具有重要应用前景.
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丙型肝炎病毒核心蛋白与载脂蛋白A1结合的研究
目的:为了探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白在肝脂肪变性中起作用的分子机制,研究了核心蛋白是否与脂肪代谢相关蛋白存在相互作用.方法:应用酵母双杂交系统3,构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AHl09后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选.筛选出30个克隆,对能在涂有X-α-gal的四缺营养缺陷培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上生长并变蓝的菌落,提取酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后测序,进行生物信息学分析.结果:发现了一个与载脂蛋白Al(apoAl)同源序列,同源性99%.结论:载脂蛋白Al在酵母双杂交中能与HCV核心蛋白相互作用,推测此蛋白参与了脂质代谢紊乱,部分解释了HCV感染后普遍引起肝脂肪变性的发病机制.
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应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因
目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid-ization,SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆双环醇调节相关基因,阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到46个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到2 0-1 000bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得14种已知基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.
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酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因
目的:Hcbp6是与核心蛋白相结合的未知功能蛋白基因,为了初步提示他的生物学功能和在细胞中的存在形式,采用酵母双杂交体系寻找与他相互作用的肝细胞蛋白,探讨Hcbp6的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建Hcbp6诱饵质粒并转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,在涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出4种与Hcbp6特异性相互作用的蛋白,包括Paralemmin(PALM)、Ran结合蛋白2(Ranbp2)、跨膜运输蛋白21(Tmp21)和血清白蛋白.结论:推测该蛋白可能为一分泌性蛋白,或与分泌蛋白的形成有关,进一步的生物学功能的研究需要更多的实验加以探讨.
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淋巴细胞内与乙型肝炎病毒X蛋白结合的新蛋白X-30编码基因的克隆
目的:为探讨HBxAg在HBV致病过程中的作用,筛选并克隆人淋巴细胞cDNA文库中与HBxAg有相互作用的蛋白基因.方法:利用酵母双杂交系统3筛选并克隆人淋巴细胞cDNA文库中与HBxAg有相互作用的蛋白的基因.将HBxAg编码基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋巴cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,双重筛选阳性菌落,提取质粒并测序,结果进行生物信息学分析,发现其中有1个未知基因.根据GenBank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为X-30,在GenBank中注册,注册号为AY280722.结果:X-30基因的编码序列全长为315个核苷酸(nt),编码产物由103个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg与淋巴细胞结合蛋白新型基因X-30的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg的分子生物学机制及探索新型治疗技术奠定了基础.
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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因
目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因.以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.
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应用白细胞cDNA文库的酵母双杂交技术筛选HCTP4结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCTP4蛋白结合的蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCTP4基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCTP4基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-ga1)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落44个,其中25个免疫球蛋白λ轻链;6个来自RP11-189K21克隆的人DNA序列;4个来自RP11-507C10克隆的人DNA序列;2个人BAC克隆RPCI11-75L1;1个人BAC克隆RP11-21M10;1个人遍素酶智能弹(MIB);1个来自RP11-867O8克隆的人DNA基因;1个来自RP3-509I19克隆的人DNA序列;1个小核糖核蛋白G;1个UMP-CMP激酶;1个新基因.结论:成功克隆出HCTP4的结合蛋白,为进一步研究丙型肝炎病毒(HCV)的作用提供了新线索.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合视黄醇脱氢酶11蛋白
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白是HCV基因组编码的一种主要的结构蛋白,研究表明这种病毒的蛋白具有复杂的生物学调节作用.方法:以HCV的核心蛋白作为诱饵(bait),利用酵母双杂交技术,对于肝细胞表达型酵母细胞cDNA文库进行筛选.对于在缺陷型培养基上生长的真阳性酵母集落,进行回交实验,并对于cDNA文库表达载体质粒中插入的基因片段进行序列分析和生物信息学分析.结果:其中一个克隆命名为HCBP12,后来证明为视黄醇脱氢酶ll(retinol dehydrogenase ll,RDHll),或称为雄性激素调节的短链脱氢酶/还原酶l(androgen-regulatedshort-chain dehydrogenase/reductase l,ARSDRl).结论:这是首次发现和证实HCV核心蛋白与视黄醇脱氢酶ll之间存在着相互结合和相互作用,为充分阐明HCV核心蛋白在HCV感染发病机制中的作用,开辟了新的研究方向.
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应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心抗原反式调节基因
目的:筛选与克隆HBcAg反式调节基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg,以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBcAg激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得17种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因,推测了HBcAg在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.