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太子参类胡萝卜素双加氧裂解酶家族4成员的克隆及表达特性分析
为探讨太子参环肽成分与品质形成的分子机制,利用生物信息学方法从太子参转录组数据库中筛选出太子参类胡萝卜素双加氧裂解酶(carotenoid cleavage dioxygenases,CCDs)新基因,并设计引物对其进行全长扩增及克隆、生物信息学分析和基因表达分析.克隆得到的4条CCDs序列全长分别为1 617,1 461,1 746,1 875 bp,并根据其功能依次命名为PhCCD1,PhNCED2,PhNCED3,PhCCD4.序列分析结果表明,4个基因均含有REP65结构域,且均含有与亚铁离子结合的位点.系统进化分析表明,PhNCED2,PhNCED3聚为NCEDs一支,PhCCD1,PhCCD4聚为CCDs一支,且与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtC-CDs家族相比,PhCCD1与AtCDD1同源性高,PhCCD4与AtCCD4同源性高,PhNCED2,PhNCED3与AtNCED3同源性高.实时荧光定量分析显示PhCCD1和PhCCD4 2个基因的表达主要在地上部分,其中PhCCD1在叶中的表达量高,PhCCD4在茎叶具有高表达,可能参与太子参类胡萝卜素的生物合成;PhNCED2和PhNCED3 2个基因的表达主要在地下部分,其中PhNCED2在须根中表达量高,PhNCED3在块根木部和皮部表达量较高,可能是脱落酸生物合成的关键酶基因.研究首次得到太子参CCDs基因,为进一步阐明太子参植株对于外界胁迫的应答机制,进而探讨太子参品质形成的生物途径奠定基础.
关键词： 太子参 类胡萝卜素双加氧裂解酶 生物信息学分析 表达分析 -
WLL-1株博卡病毒(Bocavirus)全基因组序列分析
儿童下呼吸道感染已成为当前儿科发病率高的一种疾病,而病毒是小儿下呼吸道感染的重要原因.临床上有相当比例的小儿下呼吸道感染病因未能作出明确的实验室诊断,给临床诊断与治疗带来了较大的困难.
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PCBP2基因座位上长非编码RNA的筛选与鉴定
目的 从EST鉴定人手利用生物信息学方法筛选验证PCBP2基因内部UC.338基因座位附近的长非编码RNA.方法 首先利用生物信息学方法筛选包含内含子转录区域的ESTs,经CPC分析和统计学比较,共筛选到4个(人、鼠各两个)可能的lncRNAs,用PCR方法进行鉴定,克隆到pGEM-T载体测序验证,并用PCR,real-time PCR的方法检测各ESTs在人源细胞系或小鼠不同组织,小鼠发育不同时间点大脑中的表达谱.结果 筛选到4个ESTs中有3个ESTs均具有一定的非编码特征,并终测序正确:1个人源,2个鼠源,并且其中有些lncRNAs具有一定的细胞、组织特异性,有些lncRNAs具有广谱表达模式.结论 使用了一种新的寻找lncRNAs的方法,从EST鉴定入手,对现有数据库进行了挖掘.找到了可能在小鼠大脑发育过程中起作用的lncRNAs.
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miR-26a对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖和迁移的影响
目的 观察miR-26a在人肝癌细胞中的表达情况及高表达的miR-26a对SMMC-7721细胞增殖和迁移的影响.方法 生物信息学分析miR-26a在肝癌及正常肝组织中表达水平分布;化学合成miR-26a寡聚核苷酸,并行测序确认;利用pcDNA6.2-GW/Em-GFP-miR质粒构建miR-26a真核表达载体;pcDNA6.2-GW/Em-GFP-miR-26a质粒载体瞬时转染SMMC-7721细胞,实时荧光定量PCR检测miR-26a的mRNA表达水平;高表达miR-26a后,CCK8法和划痕实验分别检测SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的变化.结果 miR-26a在肝癌组织中表达水平显著低于正常组织(P ＜0.001);设计的miR-26a序列与寡核苷酸测序结果比对,匹配程度达100％;pcDNA6.2-GW/Em-GFP-miR-26a质粒瞬转后人肝癌SMMC-7721细胞miR-26a的表达量与对照组相比显著增加(P ＜0.05);miR-26a过表达SMMC-7721细胞的增殖能力与对照组相比均显著下降(P ＜0.05);rniR-26a过表达组细胞迁移速度低于对照组.结论 miR-26a在肝癌组织中低表达,而上调的miR-26a可抑制人肝癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移能力.
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肾脏纤维化大鼠模型尿液中差异表达基因筛选及生物信息学分析
目的研究大鼠肾脏纤维化(RF)模型尿液中差异表达的基因,并对其进行生物信息学分析.方法将大鼠分为对照组和纤维化模型组,单侧输尿管结扎术建立大鼠肾脏纤维化模型,收集尿液.提取总RNA,构建测序文库并进行转录组测序.对差异表达的mRNA进行了GO分析和KEGG分析,并对miRNA的前体和lncRNA的家族进行预测和分类.结果肾脏纤维化模型组的尿液和对照组相比,得到813条表达上调转录本数据以及213条表达下调的转录本数据.结论利用转录组高通量测序结合相关生物信息学分析,可为肾脏纤维化诊断靶点提供新的可能.
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生物信息学在长非编码 RNA 研究中的应用
长非编码 RNA（lncRNA）是一类转录本长度大于200个核苷酸的非编码 RNA 分子，它们在细胞生命活动中的许多关键过程中起到重要调控作用。近年来关于 lncRNA 的研究发展迅速，涌现出一批用于 lncRNA 的鉴定、定量、结构分析以及功能预测的生物信息学工具和数据库，本文将对这些 lncRNA 研究的资源进行综述。
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沙眼衣原体多态膜蛋白PmpF基因克隆及生物信息学分析
目的 克隆沙眼衣原体的多态膜蛋白PmpF基因,分析其生物学特征. 方法 以沙眼衣原体L2菌株DNA为模板,PCR扩增PmpF基因,克隆后测序,采用生物信息软件、数据库对其进行同源性比对,并分析其编码蛋白的主要化学特征、结构功能以及B细胞抗原表位. 结果 PCR扩增实验株沙眼衣原体PmpF基因核苷酸序列长度为3 099bp,该菌株与同一生物型同源性≥99.97％,与不同生物型同源性＜89.32％;与同一生物型氨基酸序列同源性≥99.90％,与不同生物型同源性达＜89.25％.编码蛋白的分子质量单位为112.538 2 ku,等电点为9.15,该蛋白具有信号肽和2个结构域.对蛋白质的二级结构和柔性区、氨基酸的亲水性、抗原指数及表面可及性预测结果分析,推测该蛋白含有14个优势B细胞抗原表位. 结论 本研究克隆了沙眼衣原体PmpF基因,推测其表达蛋白含B细胞抗原表位.为研究此基因的生物学功能奠定了基础.
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弓形虫SAG3基因克隆及生物信息学分析
目的 克隆弓形虫表面抗原SAG3基因,对其结构和功能进行生物信息学分析,为进一步研究奠定基础.方法 提取虫体总RNA,RT-PCR扩增SAG3基因并用生物信息学方法 对SAG3蛋白的理化性质、结构和功能进行预测. 结果 扩增出的基因片段约1 158 bp,与预期相符.预测SAG3蛋白分子质量单位约41.773 2 ku,PI为6.75,为两亲性蛋白,有2个保守结构域和功能域. 结论 成功克隆出SAG3基因,为深入研究该基因结构和功能奠定了基础.
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螨类变应原的聚类及相关生物信息学分析
目的 分析螨变应原的聚类、所属的蛋白家族及其氨基酸序列组成特点. 方法 从国际免疫学会联合会变应原命名数据库获得螨类变应原氨基酸序列,采用生物信息学方法进行进化树构建、蛋白质家族和超家族分类、序列比对、二级结构分析和序列相似度分析. 结果 螨类变应原第1～24组分在系统进化树中按照功能聚类成7大簇,归属于Trypsin等16个蛋白质家族和E set domains等13个蛋白质超家族.通过序列比对,获得螨类变应原第1、2组分的一致性氨基酸和独有氨基酸信息及第1、2组分亚型间氨基酸置换信息.螨类变应原第1、2组分的二级结构基本都由α-螺旋、延伸主链和无规卷曲构成,但Tyr p 2的二级结构不含α-螺旋.Der f 1、Der p1和Eur m 1序列相似度高(82.77％～84.50％),在进化树中也聚类在一起;Der f 2、Der p 2和Eur m 2亦然(相似度分别为84.17％～85.15％). 结论 螨类变应原第1～24组分归属于16个蛋白质家族和13个蛋白质超家族,并聚类为7个簇,每簇变应原都有其特定功能,可为新变应原的寻找和变态反应学的基础研究提供参考,并为重组变应原的研究提供新的方向.
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戈登菌mmpL3同源基因序列分析及功能预测
目的 分析支气管戈登菌临床株mmpL3 (Rv0206c)同源基因(Gbro4481)序列,并预测其蛋白质结构及功能,为Gbro4481蛋白的进一步研究奠定基础. 方法 根据全基因组测序结果和同源比对找到支气管戈登菌的mmpL3同源基因,应用expasy工具预测支气管戈登菌MmpL3同源蛋白理化性质;利用Interproscan和Gene ontology工具对蛋白保守序列和功能进行预测;使用TMHMM在线工具进行拓扑结构预测. 结果 筛选出MmpL3同源蛋白(Gbro4481),该蛋白含有2个膜转运蛋白结构域和1个固醇敏感多肽区;TMHMM预测Gbro4481蛋白有10个跨膜区. 结论 支气管戈登菌的Gbro4481蛋白与结核分枝杆菌H37Rv的mmpL3蛋白同源,是分枝菌酸的转运蛋白,参与胞内小分子的运输和信号转导.
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结核分枝杆菌higB基因的扩增及生物信息学分析
目的 扩增结核分枝杆菌(H37Rv)的higB基因,运用生物信息学方法预测其编码蛋白的生物信息学特征.方法 采用PCR方法扩增higB基因并对扩增产物测序,通过在线Protparam、protscale、SignaIP 4.1、Motif Scan、SWISS_MODEL等程序,分析higB基因编码蛋白的生物学特征. 结果 获得的higB基因全长378 bp,与预期大小基本一致,基因序列与GenBank上公布的MTB标准株的核苷酸同源性为100.00％.higB蛋白共125个氨基酸,分子质量单位为14.429 8 ku,理论等电点10.18,脂溶性系数77.36,不稳定系数35.67,预测该蛋白为稳定蛋白.higB蛋白无信号肽,其二级结构中β-转角占12％,无规则卷曲占34.4％,氨基酸序列中有3个潜在的B细胞抗原表位,4个Th细胞表位,5个磷酸化位点. 结论 成功扩增了结核分枝杆菌higB基因,通过生物学信息获得了其编码蛋白的信息学特征,为研究该蛋白的生物学功能和免疫活性奠定了基础.
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结核分枝杆菌PKnG蛋白结构与功能的生物信息学分析
目的 运用生物信息学的方法分析结核分枝杆菌PKnG蛋白的结构与功能. 方法 从NCBI数据库获取PKnG的基因信息;使用protParam 工具分析PKnG基因编码蛋白的理化性质,运用ProtScale 工具分析其疏水性;运用SOPMA 工具预测其二级结构,运用SWISS-MODEL 工具模拟其三级结构;运用NCBI网站上的BLAST 工具对PKnG蛋白的保守域进行预测,运用NetPhos 3.1 Server预测其磷酸化位点;运用ABCperd服务器以及SYFPEITHI程序分别预测PKnG蛋白的B细胞和T细胞抗原表位;运用SignalP 4.1Server预测其信号肽,运用TMHMM2.0和TMpredServer对其跨膜螺旋区进行预测;运用STRING 10.5程序对其相互作用蛋白进行预测. 结果 预测PKnG基因编码蛋白由750个氨基酸构成,理论等电点5.52,为不稳定疏水蛋白,其二级结构以α-螺旋为主,有3个保守区域和多个磷酸化位点,有7个B细胞抗原表位和4个T细胞抗原表位,无信号肽和跨膜螺旋区,并发现数个相关作用蛋白. 结论 PKnG为不稳定疏水蛋白,含有T、B细胞抗原表位,具有良好的抗原性,可作为结核诊断与治疗的潜在候选因子.
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分枝杆菌噬菌体D29 holin基因的克隆及其编码蛋白的生物信息学分析
目的 研究分枝杆菌噬菌体D29 holin基因编码蛋白的理化特点及生物学特性,分析噬菌体抗结核菌的潜力.方法 根据GenBank中登录的分枝杆菌噬菌体D29 holin基因序列设计上、下游引物,以分枝杆菌噬菌体D29基因组为模板,PCR扩增holin基因,构建重组质粒pET32a-holin,进行双酶切鉴定、测序鉴定及生物信息学分析. 结果 PCR扩增得到序列正确的holin基因产物并成功构建重组质粒pET32a-holin.进化分析显示分枝杆菌噬菌体D29 holin基因与已知有尾分枝杆菌噬菌体Chy1、Chy4、Chy5 holin基因亲缘关系较近.生物信息学分析显示,该基因编码Holin蛋白为稳定、疏水性蛋白,具有2个跨膜区域和亲水性C-端;二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主,有信号肽,蛋白序列中存在2个丝氨酸磷酸化位点. 结论 分枝杆菌噬菌体D29 Holin蛋白的两个跨膜区及亲水性C-端构象发生变化,有助于阐明Holin“定时”打孔及启动噬菌体裂解细菌的机制,为研发抗结核Holin多肽药物奠定了基础.
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肠道病毒71型武汉分离株(EV71-WH029)全基因组cDNA克隆及序列分析
目的 对肠道病毒71型武汉分离株(EV71-WH029)进行全基因组克隆、序列测定及分析,了解其基因组结构和遗传进化特征,并初步探索EV71毒力相关位点.方法 采用RT-PCR扩增覆盖基因组全长的cDNA片段,利用Over-lap extension PCR得到WH029全基因组cDNA克隆;cDNA片段测序后利用BioEdit 4.8.8和MEGA 5.2.2等软件进行序列分析和遗传进化分析;采用Fisher's exact test进行编码区氨基酸变异位点的统计分析;采用RNAfold服务器进行非编码区二级结构分析.结果 WH029分离株基因组全长7 406 nt(未包含多聚腺苷酸尾),5'-和3'-UTR分别为743 nt和81 nt,中间为一个全长6 582 nt开放阅读框(ORF),编码一个长度为2 194 aa的多聚蛋白,编码区无核苷酸的缺失或插入;该毒株与安徽阜阳株EU703813及上海株JQ736684的核苷酸及氨基酸序列同源性均高(分别为97.53％～100％和97.41％～99.73％),系统进化分析也表明该毒株与以上两株的亲缘关系近;编码区氨基酸序列分析发现有7个位点变异.非编码区的二级结构预测提示,该区域的核苷酸位点变异与毒力无直接相关性,而与地域有相关性.结论 WH029分离株全基因组结构符合EV71病毒特征,经序列比对及进化分析证实WH029分离株属于EV71 C4a基因亚型,并推断该株可能来源于2008年安徽HFMD疫情.对不同临床症状的EV71毒株序列的比较分析提示,EV71毒力与编码区单一位点的突变及非编码区二级结构的变异无直接相关性,可能与多位点突变共同作用及患者的个体差异相关.
关键词： 肠道病毒71型 全基因组cDNA克隆 生物信息学分析 毒力 -
Septin4_I2基因活化肝星状细胞中的表达及序列生物信息学分析
目的 观察活化的肝星状细胞中Septin4_I2基因的表达,并对其进行生物信息学分析.方法 采用实时荧光定量PCR法观察活化的肝星状细胞LX-2中Septin4_I2基因的表达,利用网络平台和生物软件分析Septin4_I2序列.结果 活化的肝星状细胞中Septin4_I2基因表达上调.Septin4_I2基因序列含有5个内含子及保守的GTP结合位点.Septin4_I2蛋白以loop结构为主,氨基酸序列中含有数个丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸磷酸化位点,含有特异性的蛋白激酶K、蛋白激酶C及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,含有N-豆蔻酰化位点.结论 活化的肝星状细胞Septin4_I2基因表达上调,编码蛋白可能与细胞分裂相关.
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刚地弓形虫ROP16基因的克隆及生物信息学分析
目的 构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)真核重组表达载体,对TgROP16基因编码蛋白进行生物信息学分析. 方法 提取刚地弓形虫总RNA,根据TgROP16基因的开放阅读框架设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增ROP16基因,经EcoR I、Not I酶切后连接入真核表达载体pVAX1中,连接产物转化大肠埃希菌(E.coli)XL1-Blue.提取阳性菌落质粒,进行PCR、双酶切鉴定及基因测序,对所获序列进行生物信息学分析. 结果 TgROP基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小约为2 100 bp.重组质粒经PCR及双酶切鉴定构建正确.测序显示获得的TgROP16基因片段为2 124 bp,与GenBank已收录的弓形虫ROP16基因序列(登录号为GQ249093.1)比对,一致性为99.8％.预测其编码蛋白TgROP16为非跨膜分泌蛋白,含707个氨基酸,分子式为C3343H5339N967O1024S2,分子质量单位为76.1352 ku,理论等电点为9.18;在TgROP16蛋白的二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占比35.79％、14.29％、7.07％和42.86％;含多个可形成卷曲螺旋构象的区域与可成为磷酸化位点的氨基酸残基,存在信号肽序列,含39个B细胞抗原表位、24个CTL细胞抗原表位及33个Th细胞抗原表位. 结论 成功构建了pVAX1ROP16真核表达重组质粒,生物信息学分析表明其编码蛋白TgROP16具有良好的抗原性及免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选分子.
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埃博拉病毒糖蛋白与宿主细胞相互作用蛋白的筛选及生物信息学分析
目的 筛选埃博拉病毒糖蛋白在人源宿主细胞内的相互作用组分,为埃博拉病毒受体研究提供基础数据.方法 制备埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基人IgG-Fc标签融合蛋白,进行Pull-Down试验和质谱分析,经生物信息学分析确定关键相互作用因子. 结果 共筛选出31种潜在的与宿主细胞相互助用的埃博拉病毒糖蛋白,该类蛋白或为细胞结构成分,或为转录因子并参与信号转导等生物学过程;有10种蛋白参与20种信号通路,主要包括免疫反应、细胞黏附、致病性、病原感染等4大类信号通路. 结论 成功筛选与人源细胞相互作用的埃博拉病毒糖蛋白,其中部分蛋白在细胞生命活动中起重要作用.
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结核分枝杆菌Rv2629基因编码蛋白的生物信息学分析
目的 应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌Rv2629基因编码蛋白的结构和功能. 方法 从NCBI GenBank中获得结核分枝杆菌H37Rv利福平敏感菌株Rv2629的基因序列,利用在线分析软件预测和分析其编码蛋白的理化性质和亲疏水性,跨膜结构域及信号肽,糖基化位点及磷酸化位点,二级和三级结构及B、T淋巴细胞抗原表位. 结果 Rv2629蛋白由374个氨基酸组成,具有亲水性,主要存在于细胞壁及细胞膜.Rv2629含有信号肽及跨膜结构域,6个糖基化位点和4个磷酸化氨基酸位点,二级结构中α螺旋约占45.72％,β折叠约占17.11％.该蛋白含有3个潜在的B细胞抗原表位,其优势抗原表位主要集中在67-70,91-95,229-232位氨基酸,4个CTL细胞表位分别位于279、283、98、346位氨基酸,11个Th细胞表位分别位于26、127、256、25、34、116、204、215、350、363、367位氨基酸. 结论 Rv2629蛋白存在于细胞壁及细胞膜,是一分泌蛋白,在结核病的潜伏期可上调表达.该蛋白含有B、T细胞抗原表位,可作为结核利福平耐药株的研究靶点.
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微小巴贝斯虫烯醇化酶蛋白主要特征与抗原表位的生物信息学分析
目的 运用生物信息学方法分析微小巴贝斯虫烯醇化酶(BmEno)基因编码蛋白的主要特征和抗原表位.方法 运用ORF Finder、PROSITE、ProtPar am、SignalP、TMpred、SOSUI、Motif Scan、Bcepred、HNN等生物信息学在线分析软件,结合DNASTAR生物信息学分析软件,预测BmEno蛋白的开放阅读框、特征结构域、理化性质、信号肽、跨膜区、翻译后修饰位点、可溶性、亲水性、表面可及性、二级结构和抗原表位.结果 该蛋白由438个氨基酸组成,在349-362位存在烯醇化酶的特征结构域,分子式为C2098H3366N570O648S18,分子质量单位为47.5203 ku,等电点理论值为5.98,有25个翻译后修饰位点,10个亲水性参数得分≥1.9的区域,6个柔韧性参数得分≥2.0的区域,18个表面可及性参数得分≥1.9的区域,7个潜在的B细胞抗原表位,15个潜在的T细胞抗原表位,为可溶性蛋白.结论 微小巴贝斯虫烯醇化酶蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有潜在的免疫原性,可以作为微小巴贝斯虫的疫苗候选抗原.
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长链非编码RNA XLOC_004122在结核病患者肺巨噬细胞中的表达研究
目的 探讨XLOC_004122在结核患者支气管肺泡灌洗液的表达以及功能,评价长链非编码RNA(XLOC_004122)作为诊断MTB感染新标志物的潜力. 方法 收集解放军第309医院2014年10月-2015年3月结核科48例患者支气管肺泡灌洗液标本,结合患者的临床症状、体征、实验室检查、影像学检查等将其分为结核病组和非结核对照组,应用实时荧光定量PCR检测XLOC_004122的差异表达;通过基因GO功能注释、富集分析和KEGG信号转导通路富集分析,阐明XLOC_004122靶基因参与调控的细胞功能与信号通路. 结果 与非结核对照组相比,结核病组XLOC_004122的表达量显著下调(t=-2.487,P＜0.01);GO分析结果显示XLOC_004122靶基因功能主要富集于离子通道的活性、通道复合物的合成、跨膜转运活性等过程;KEGG信号转导通路主要富集于Ca2、toll样受体等信号通路,通过XLOC_004122共表达的Ca2+通道信号通路可以看出其在NCX、OPCR、CaV1、PTK、MLCK和CAMK中均有差异表达. 结论 XLOC_004122在结核感染中呈相对低表达,且可能与结核病的发生有关,可尝试将其作为诊断结核感染的新指标.
关键词： XLOC_004122 支气管肺泡灌洗液 巨噬细胞 生物信息学分析
